Descripción: La autofagia es un proceso de degradación de componentes citoplasmáticos que en algunos casos puede jugar un rol citoprotectivo, mientras que en otros puede llevar a la muerte celular. En trabajos previos hemos descripto a la proteína transmembrana VMP1, la cual se encuentra inducida en la pancreatitis experimental. Con el objetivo de determinar su función, se estudió su participación en el proceso de autofagia. Los resultados obtenidos en esta tesis demostraron que la sobreexpresión de VMP1 induce autofagia en células cultivadas en un medio rico en nutrientes. Además, VMP1 está involucrada en la autofagia inducida por ayuno y rapamicina. Más aún, el silenciamiento de VMP1 inhibe la formación de autofagosomas por el tratamiento con ayuno o rapamicina sugiriendo que VMP1 es necesaria para la autofagia. Aún no ha sido esclarecido el rol de la autofagia en el cáncer de páncreas. Los estudios desarrollados en este trabajo sobre la autofagia y VMP1 en el cáncer de páncreas, indican que el tratamiento con gemcitabina induce autofagia en las líneas celulares de cáncer de páncreas PANC-1 y MIAPaCa-2, y que este proceso promueve la muerte celular por apoptosis. La inhibición de la autofagia con 3-metiladenina redujo significativamente el porcentaje de células apoptóticas en respuesta a la gemcitabina. También se observó que la gemcitabina induce la expresión temprana de VMP1, que el silenciamiento de VMP1 disminuye la apoptosis inducida por este agente quimioterapéutico y que la sobreexpresión de VMP1 aumenta significativamente el porcentaje de células apoptóticas. Estos resultados demuestran que la vía de autofagia mediada por VMP1 participa en la muerte celular por apoptosis inducida por gemcitabina. Con el objetivo de profundizar el estudio de los mecanismos moleculares mediante los cuales VMP1 interviene en la sobrevida o muerte celular, se buscaron interactores de esta proteína utilizando la estrategia de doble híbrido. Se demostró que VMP1 interacciona con S100A10, un miembro de la familia de proteinas S100 que se encontró sobreexpresado en adenocarcinomas pancreáticos. También se observó que la expresión basal del mRNA de S100A10 en las células MIAPaCa-2 es mayor que en las células HeLa. S100A10 se induce bajo estímulos autofágicos, como el tratamiento de ayuno y la gemcitabina, en células HeLa, pero no en las células tumorales MIAPaCa-2, sugiriendo que en estas su expresión se encuentra desregulada. El análisis del rol de la interacción VMP1-S100A10 en las células tumorales mostró que la sobreexpresión de VMP1 induce la expresión del mRNA de S100A10, sugiriendo que S100A10 forma parte de la respuesta celular mediada por VMP1. Cuando la proteína sobreexpresada es S100A10, se modifica la distribución intracelular de VMP1, disminuyendo su patrón punteado característico y aumentando la distribución en una estructura reticulada semejante al retículo endoplásmico. Finalmente se investigó la participación de S100A10 en el proceso de autofagia mediado por VMP1. Se observó que la sobreexpresión de S100A10 disminuye la formación de autofagosomas tanto en respuesta al tratamiento con gemcitabina como ante la inducción directa por la sobreexpresión de VMP1. Se determinó también que S100A10 reduce la apoptosis inducida por gemcitabina, ya que su silenciamiento aumentó la apoptosis causada por este agente quimioterapéutico. Por lo tanto, la expresión de S100A10 disminuye la autofagia y la apoptosis mediadas por VMP1, favoreciendo la resistencia a la muerte de las células de cáncer de páncreas. Los resultados de este trabajo contribuyen a elucidar el rol de la autofagia en el cáncer de páncreas, señalando a la autofagia mediada por VMP1 como un mecanismo molecular que conduce a la muerte por apoptosis de las células neoplásicas de origen pancreático, y a la proteína S100A10 como un mecanismo posible de supervivencia de las células de cáncer de páncreas, que actúa disminuyendo la capacidad de desarrollar autofagia y apoptosis. En base a los resultados obtenidos, proponemos a la vía de autofagia mediada por VMP1 como posible blanco para el estudio de nuevas estrategias terapéuticas para el cáncer de páncreas.

Descripción: Entre los mecanismos de defensa contra Mycobacterium tuberculosis, la autofagia constituye un proceso esencial para la sobrevida o muerte del patógeno, tanto en la inmunidad innata como adaptativa, y puede ser modulada por citoquinas y otros varios mediadores inmunológicos. Por ello, resulta importante dilucidar los mecanismos de activación de la autofagia, así como la interrelación con la respuesta inmune humana articulada frente a la infección tuberculosa. Al respecto, en este trabajo demostramos que la IL-17A regula diferencialmente la autofagia en monocitos infectados de pacientes con alta (TB AR) y baja (TB BR) respuesta inmune contra M. tuberculosis, al menos en parte por un defecto en la vía de señalización de ERK MAPK en los monocitos de pacientes BR. A su vez, la adición de IFNγ a monocitos infectados, indujo un flujo autofágico funcional a través de la vía de p38 MAPK tanto en pacientes TB AR como BR. Importantemente la estimulación con IFNγ e IL-17A ocasionó una significativa eliminación de micobacterias mediante un mecanismo dependiente de la autofagia. Por otro lado, encontramos que la PGE2 ejerce una potente acción inmunosupresora durante la respuesta inmune contra M. tuberculosis. Este efecto quedó demostrado por la inhibición de la linfoproliferación y la producción de citoquinas proinflamatorias, así como por una reducción significativa de la expresión en superficie de diferentes receptores inmunológicos en linfocitos y en monocitos humanos. Sin embargo, la PGE2 promovió el flujo autofágico de monocitos estimulados de dadores sanos y pacientes con tuberculosis, aún en presencia de IFNα. De esta forma, la atenuación de la inflamación y la inmunopatología causada por una excesiva respuesta inmunológica emerge como un blanco terapéutico atractivo. Al respecto, se observó un mayor número de neutrófilos en sangre periférica de pacientes con las formas más severas de la enfermedad. Además, por primera vez demostramos que SLAMF1 es expresado en neutrófilos tras el desafío antigénico de M. tuberculosis. Más aún, encontramos que la activación de SLAMF1 induce la autofagia en neutrófilos a través de un mecanismo dependiente de la generación de especies reactivas del oxígeno. Tomados en conjunto, los hallazgos que surgen de esta tesis aportan nuevos conocimientos sobre el papel de la autofagia en las interacciones hospedador-patógeno durante la tuberculosis activa, lo que contribuye a identificar nuevos objetivos y diseñar nuevas herramientas terapéuticas para combatir al patógeno.

Descripción: Los neutrófilos son leucocitos que cumplen un papel clave en la defensa antimicrobiana. Éstos constituyen las células más numerosas de la sangre periférica, con una producción que se incrementa dramáticamente durante la inflamación o infección sistémica. Tradicionalmente se les ha adjudicado un papel microbicida en la respuesta inmune, pero estudios recientes demostraron que pueden modular el curso de las mismas a través de la secreción de citoquinas, entre las cuales se encuentra la Interleuquina‐1β (IL‐1β). Ésta es una citoquina proinflamatoria central en procesos fisiopatológicos que ejerce efectos pleiotrópicos tanto sobre el sistema inmune innato como el adaptativo. La IL‐1β es sintetizada como un precursor inactivo que requiere clivaje proteolítico para ser activado. En respuesta a la estimulación con LPS y ATP, los neutrófilos humanos sintetizan pro‐IL‐1β y median la generación de su forma activa a través de la caspasa‐1 tras la activación del inflamasoma. La IL‐1β carece de péptido señal, por lo que es sintetizada en el citoplasma y secretada por vías no convencionales de naturaleza controvertida, que son independientes de la vía canónica que involucra al retículo endoplásmico‐aparato de Golgi. En este trabajo de tesis aportamos evidencias que sustentan que un mecanismo de autofagia secretoria se encuentra involucrado en la exportación de IL‐1β en neutrófilos humanos, a través de estudios cinéticos cuantitativos que involucraron inmunomarcaciones, técnicas de microscopía confocal y cuantificación de las imágenes, así como ensayos de ELISA específicos y Western Blot. Estos estudios también indicaron que aun cuando los neutrófilos humanos liberan pro‐IL‐1β, su secreción no está mediada por autofagia. Además, los resultados evidenciaron que las serinproteasas neutrofílicas regulan la secreción de la IL‐1β. Nuestros hallazgos indicaron que la IL‐1β es secretada mayoritariamente en forma soluble, y sólo en una mínima proporción dentro de microvesículas y exosomas. Los resultados son compatibles con un modelo que involucra la participación de la chaperona HSP‐90 y de la Gasdermina D en la translocación de la IL‐1β a las vesículas. Nuestros hallazgos también sugirieron que la autofagia controla el destino de los inflamasomas. Teniendo en cuenta las diversas condiciones de naturaleza infecciosa e inflamatoria en las que los neutrófilos infiltran masivamente los tejidos, los resultados de esta tesis aportan blancos moleculares potenciales, que podrían ser sujeto de investigaciones en el futuro para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas para mitigar la inflamación en patologías en las cuales la IL‐1β neutrofílica cumpla un papel relevante en su patogénesis.

Descripción: La autofagia es un proceso evolutivamente conservado por el que las células eucariotas llevan a cabo la auto-digestión de componentes citoplasmáticos. Este es un mecanismo de adaptación a distintas condiciones de estrés, tales como el ayuno y las infecciones por patógenos intracelulares. En células de mamífero en cultivo, plantas y gusanos se ha visto previamente que la autofagia también puede desencadenarse en respuesta a hipoxia, desempeñando un papel adaptativo esencial en esta condición. Durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral estudiamos la autofagia inducida por ayuno o hipoxia, utilizando a Drosophila melanogaster como organismo modelo. La vía autofágica disparada por ayuno se encuentra ampliamente estudiada en este organismo, el cual además puede sobrevivir durante varios días en niveles de oxígeno extremadamente bajos. En el presente trabajo hemos identificado una nueva inmunofilina de Drosophila, que denominamos Zonda, esencial para la autofagia inducida por ayuno. Encontramos que Zonda se requiere en etapas tempranas de la cascada, puntualmente para la deposición de fosfatidilinositol-3-fosfato en estructuras membranosas asociadas al retículo endoplasmático conocidas como omegasomas, proceso mediado por el complejo Vps34 específico de la autofagia. En condiciones basales, Zonda presenta una distribución citoplasmática y luego del ayuno se dispone en foci asociados al retículo endoplasmático, que co-localizan con marcadores de omegasoma. Encontramos también que la nucleación de Zonda depende del complejo de iniciación (Atg1, Atg13 y Atg17), pero no del complejo de nucleación (Vps34, Vps15, Atg6 o Atg14). Asimismo, observamos que Zonda interactúa físicamente con el dominio quinasa de Atg1, así como también con Atg6 y Vps34. Proponemos entonces que Zonda es un nuevo componente de la cascada autofágica requerido para la biogénesis del omegasoma. Paralelamente durante este proyecto de Tesis caracterizamos la respuesta autofágica inducida por hipoxia en D. melanogaster, proceso que hasta el momento no se había analizado en este organismo. Encontramos que este mecanismo se desencadena en células del cuerpo graso de larvas sometidas a 4% O2. La inducción de esta respuesta se estudió a distintos tiempos de exposición hipóxica, mediante el uso de diferentes reporteros de autofagia. A las 2 horas de hipoxia observamos la formación de estructuras autofágicas incipientes, indicando el inicio del proceso. Luego de 6 horas de hipoxia, detectamos la coexistencia de autofagosomas y autolisosomas y, tras 12 horas de hipoxia, la mayoría de las vesículas autofágicas eran degradativos. Sorprendentemente, encontramos que la autofagia inducida por hipoxia se bloqueaba en animales mutantes para Atg1 o Sima (principal factor de transcripción de los genes involucrados en la adaptación a hipoxia). Por el contrario, la autofagia desencadenada por ayuno no mostró esta dependencia con Sima. Por último, larvas mutantes para Atg1 o Atg3 exhibieron una dramática reducción de la sobreviva al desarrollarse en un ambiente hipóxico, al compararlas con animales salvajes. Estos resultados muestran por primera vez que el estrés hipóxico induce una respuesta autofágica robusta en D. melanogaster, comparable a la inducida por ayuno, siendo éste un mecanismo de adaptación a la hipoxia, dependiente de Sima y Atg1.

Descripción: La Interleuquina 1β (IL-1β) es una citoquina proinflamatoria central en procesos fisiopatológicos que ejerce efectos pleiotrópicos sobre el sistema inmune innato y el adaptativo. A pesar de ser una proteína de exportación, la IL-1β carece de un péptido se~nal y es sintetizada en el citoplasma como una molécula precursora inactiva (proIL-1β), que tras ser procesada proteolíticamente, es secretada por mecanismos definidos de forma incompleta, que son independientes de la vía canónica de secreció celular que involucra al retículo endoplasmático y al aparato de Golgi. En este trabajo de tesis, investigamos los mecanismos involucrados en la secreción de IL-1β en neutrófilos aislados de sangre periférica humana. Nuestros estudios indicaron que la inhibición de la inducción de autofagia mediante el uso de inhibidores como 3-metiladenina y Wortmanina, o el bloqueo de lujo autofágico con Bafilomicina A1 (Baf A1) o E-64d, redujeron marcadamente la secreción de IL-1β inducida por LPS o LPS+ATP luego de 5 hs de cultivo. En neutrófilos diferenciados a partir de la línea celular PLB985, la reducción de la expresión (knockdow) de ATG5 mediante ARN de interferencia inhibió la secreción de IL-1β. En respuesta a la estimulación de neutrófilos con LPS+ATP, la IL-1β pudo ser detectada colocalizando con el marcador de vesículas autofágicas LC3B al ser analizadas por microscopia laser confocal a las 4 horas postestimulación (p.e.). En contraposición al impacto ejercido por la inhibición de la autofogia, su inducción por privación de nutrientes incrementó la colocalización entre IL-1β y LC3B a las 4hs. p.e., y promovió significativamente la secreción de IL-1β inducida por LPS+ATP a las 5 hs p.e. Dado que la secreción de IL-1β en neutrófilos requiere de la actividad de la NADPH oxidasa, nos planteamos como hipótesis que la actividad de la enzima es necesaria para evitar la acidificación de las vesículas que contienen IL-1β y de esta forma prevenir su degradación por proteasas ácidas lisosomales. En favor de esta posibilidad, el tratamiento de neutrófilos con inhibidores de la NADPH oxidasa como DPI y apocinina inhibió la secreción de IL-1β inducida por LPS+ATP y no modificó los niveles intracitoplasmáticos de la misma, sugiriendo que la IL-1β es degradada si la enzima es inhibida. Por otro lado, en neutrófilos estimulados por 4 hs. con LPS+ATP, la IL-1β pudo ser detectada colocalizando parcialmente con gp91 (componente de la NADPH oxidasa). Sin embargo, el tratamiento con DPI de neutrófilos estimulados con LPS+ATP no afectó la colocalización de la IL-1β vesicular con Lysotracker red, aunque disminuyó la colocalización de IL-1β con LC3B. Estos hallazgos indican que la actividad de la NADPH oxidasa es requerida para la secreción de IL-1β pero este efecto parece ser independiente de la acidificación de las vesículas que contienen a la IL-1β. Nuestros resultados no descartan que la NADPH oxidasa sea necesaria en otros pasos del proceso de secreción, como ser en la inducción del proceso autofágico o en la exocitosis de las vesículas autofágicas conteniendo IL-1β. Por último, también determinamos que una porción de la IL-1β sintetizada puede ser degradada por serin proteasas neutras, cuya actividad estaría determinada por el pH vesicular el cuál podría ser modulado por la actividad VATPasa. En conjunto, los hallazgos de este trabajo sugieren que la secreción de IL-1β en neutrófilos podría involucrar un mecanismo de autofagia secretoria y que la cantidad de IL-1β secretada dependería de su resistencia a ser degradada por proteasas antes de ser conducida al medio extracelular.

Descripción: se encuentra en franco aumento a nivel mundial, y dada la ausencia de un tratamiento eficiente se proyecta como uno de los grandes desafíos en el campo de la salud con injerencia social y económica para las sociedades modernas. Se caracteriza por la presencia de depósitos extracelulares de péptidos amiloides en el parenquima cerebral y agregados intraneuronales de proteína Tau hiperfosforilada. Además, se hace evidente un cuadro de neuroinflamación crónica, desregulación de la autofagia neuronal y daño vascular. En este sentido, el estudio integrado deneuronas, células gliales y vasculares –constituyentes de la unidad neurovascular- ha cobrado relevancia en los últimos años. En esta Tesis se planteó como principal objetivo estudiar el rol de las células microgliales, astrogliales y endoteliales –así como la interacción entre ellas- durante la instalación del cuadro neuroinflamatorio en etapas tempranas de la patología. Asimismo, se evaluó en etapas avanzadas si el sistema degradativo por autofagia se encontraba afectado en estas células no-neuronales. Para ello se empleó la cepa de ratones transgénicos PDAPP-J20, modelo animal ampliamente validado en la bibliografía, y modelos in vitro de la patología empleando los tipos celulares mencionados. En etapas tempranas de la enfermedad –antes de la presencia de depósitos amiloides- los ratones PDAPP-J20 presentan activación en la microglía y astroglia en el hipocampo. Sin embargo, la vasculatura no evidencia alteraciones ni en su morfología ni en su densidad. En etapas avanzadas, en cambio, la vasculatura cerebral presenta signos de atrofia y eventos detectables de daño vascular. Las células de la microglía y astroglía exhiben una evidente hipertrofia de su soma en la cercanía a placas amiloides, lo cual se asocia en parte a la acumulación de proteínas involucradas en el proceso de autofagia. En este sentido, en este trabajo de Tesis aporta evidencia original acerca del flujo autofagico en las células astrogliales en la cercanía de placas amiloides. Las células de la microglía, por su parte, presentan un impedimento en el flujo autofágico durante la estimulación crónica con péptidos amiloides fibrilizados y en el hipocampo de ratones PDAPP-J20. Por otro lado, la comunicación entre células astrogliales y endoteliales se vió afectada por el proceso de envejecimiento en este modelo animal. Los estudios realizados en sistemas in vitro demostraron que las células endoteliales son capaces de responder directamente a péptidos amiloides, pero también indirectamente a través de factores solubles liberados por microglía y astroglía que actuarían a través del receptor de moléculas asociadas al daño RAGE. Finalmente, el análisis por espectrometría de masa de la fracción proteica obtenida a partir de una muestra enriquecida en microvasculatura cerebral evidenció que los sistemas de metabolismo de ARN (principalmente la traducción y el splicing) se encuentran especialmente alterados en células vasculares durante etapas avanzadas de la patología. En su conjunto, estos resultados sugieren que hay claros indicios de instalación de un cuadro neuroinflamatorio en una etapa temprana de la patología, que contribuye a la progresiva disfuncion de la Unidad Neurovascular. En etapas avanzadas, alteraciones en la autofagia astroglial y microglial así como en los sistemas metabólicos básicos de las células endoteliales sugieren un cuadro de pérdida de homeostasis que probablemente promueva la exacerbación del proceso patológico.

Descripción: Los arenavirus son virus envueltos con genoma ARN segmentado cuyo ciclode replicación tiene polaridad bisentido. La entrada a las células blanco se realiza víaendocitosis mediada por receptor y posterior fusión dependiente de pH. Una vezque la nucleocápside se encuentra en el citoplasma se expresan 5 proteínasestructurales. La proteína mayoritaria asociada a la nucleocápside se denomina NP. A partir de un único precursor glicoproteico (GPC), se obtienen dos glicoproteínasvirales denominadas GP1 y GP2 y el péptido señal (SP), los cuales conforman lasestructuras claviformes encontradas en la envoltura viral. En este trabajo se estudiaron aspectos de la interacción virus-célula huésped,caracterizando el rol de distintas proteínas celulares en los eventos tempranos delciclo de multiplicación de los arenavirus Tacaribe (TCRV) y Junín (JUNV). Debido aque TCRV no utiliza el receptor de transferrina humano (hTfR) para entrar en lascélulas, se utilizo un modelo de células que expresan diferencialmente el TfR y seanalizaron las vías de entrada utilizadas por el virus. Para ello, se utilizaroninhibidores farmacológicos de las diferentes vías endocíticas (dependiente declatrina, colesterol, dinamina, acidificación endosomal y macropinocitosis) y seconfirmaron los resultados obtenidos utilizando construcciones dominantesnegativas unidas a GFP de proteínas involucradas en cada una de ellas. Estosexperimentos permitieron caracterizar que en aquellas líneas que no expresan elhTfR, la vía endocítica principal de entrada es la dependiente de clatrina, dinamina yacidificación endosomal mientras que en las células que si expresan dicho receptor,la vía principal es la macropinocitosis. La endocitosis del virus mediada por la unión a un receptor celular puededesencadenar diferentes señales intracelulares para beneficiarse de procesoscelulares. En este trabajo estudiamos la participación de la autofagia durante lainfección con JUNV en un modelo de células humanas. Se analizó la distribución dela proteína LC3 sobreexpresada (marcador de la vía de la autofagia), se utilizaroninhibidores farmacológicos y células con el gen Atg 5 mutado (esencial para laactivación de la vía convencional de la autofagia). Los resultados obtenidospermitieron determinar que esta vía se activa desde el inicio de la infección ypermanece activa hasta 24 hs post-infección. Los hallazgos presentados en este trabajo no sólo aportan conocimientosbásicos sobre los pasos iniciales del ciclo de replicación de estos arenavirus, sino queademás permite desarrollar nuevos blancos antivirales contra JUNV.

Descripción: La enfermedad de Parkinson es una patología neurodegenerativa que afecta al 1% de la población mayor de 60 años. Se caracteriza por déficits motores, temblor en reposo y una pérdida selectiva de las neuronas dopaminérgicas de la Substantia Nigra Pars Compacta. Otro rasgo típico es la aparición de agregados proteicos conocidos como cuerpos de Lewy cuyo principal componente es una pequeña proteína, α-sinucleína. Esta proteína se une a las membranas lipídicas y en su conformación de α-hélice podría modular la fusión de las vesículas sinápticas con las membranas pre-sinápticas e influiría en la liberación de neurotransmisores. En condiciones patológicas, α-sinucleína sería capaz de unirse a las mitocondrias y se ha propuesto que esta unión provocaría disfunción mitocondrial y estrés oxidativo que colaborarían en el desarrollo de la enfermedad. La hipótesis de este trabajo propone que AS se incorpora a la mitocondria y se distribuye en sus distintos compartimientos. En esas localizaciones, esta proteína generaría disfunción mitocondrial incidiendo negativamente sobre distintos parámetros metabólicos, sobre la dinámica mitocondrial y la autofagia. En el presente trabajo se estudió la localización específica de α-sinucleína en mitocondrias aisladas de cerebro de rata. Se emplearon técnicas de microscopía de fluorescencia, microscopía electrónica de transmisión, Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET), fraccionamientos celulares y mitocondriales, western blots y distintos ensayos bioquímicos. Los resultados obtenidos en mitocondrias aisladas mostraron que AS 1μM se asocia a la mitocondria, mayoritariamente en la membrana externa y AS 10μM y 50 μM se encuentra principalmente internalizada. La microscopía electrónica confirmó la localización de α-sinucleína en el interior de la mitocondria y también en la periferia. Mediante un experimento de FRET se demostró un posible rol para el transportador de membrana externa TOM en la incorporación de AS. El análisis de la funcionalidad mitocondrial reveló que α-sinucleína altera el consumo de O2, elpotencial de membrana, la producción de ATP y aumenta la generación de especies reactivas de oxígeno. Por otra parte, se utilizaron células SH-SY5Y transfectadas con α-sinucleína para estudiar el efecto sobre la viabilidad celular, la producción de ATP, la generación de especies reactivas de oxígeno, la dinámica mitocondrial y la autofagia. Los resultados revelaron una disminución significativa de la viabilidad, en paralelo a una disminución en la producción de ATP y generación aumentada de especies reactivas. Además, α-sinucleína indujo disipación del potencial de membrana mitocondrial, desbalance de los procesos de fisión-fusión y desencadenamiento de la autofagia y mitofagia. Estos últimos procesos actuarían como un mecanismo de rescate celular disminuyendo la muerte y eliminando la mitocondrias dañadas. Este trabajo agrega evidencia novedosa al conocimiento de la localización de α-sinucleína en los distintos compartimientos mitocondriales, sus efectos sobre la funcionalidad mitocondrial y la relevancia de la disfunción de la organela en el destino celular. De este modo representan una contribución a la comprensión de los procesos que llevan a la patogénesis de la Enfermedad de Parkinson.

Descripción: El manganismo es un desorden neurodegenerativo originado por la sobreexposición crónica a Mn, cuyo cuadro clínico y vías de señales se asemejan a los de la Enfermedad de Parkinson Idiopática. El Mn se acumula preferentemente en los ganglios basales y en particular, en las mitocondrias y lisosomas, donde puede generar especies reactivas de oxígeno y afectar las membranas de estas organelas. La permeabilización de la membrana lisosomal (PML) conduce a la liberación de hidrolasas al citosol y a la apoptosis y puede también comprometer la degradación autofágica. En el presente trabajo se investigó el daño lisosomal inducido por Mn y el impacto de este evento en la muerte de las células C6 de glioma de rata. Parte de los resultados obtenidos fueron trasladados a un modelo in vivo de intoxicación aguda con Mn. Por lo tanto, el enfoque estuvo dirigido al estudio de la posible participación de la vía lisosomal en la apoptosis inducida por Mn y al rol potencial de la autofagia en este contexto celular. Los ensayos in vitro se realizaron empleando células expuestas a MnCl2 en distintas condiciones de incubación. Se demostró que el Mn induce un aumento en el tamaño de las vesículas ácidas que puede ser totalmente prevenido por preincubación con antioxidantes. Asimismo, la exposición al metal genera PML y liberación de Catepsina D (CatD) al citosol, procesos que tienen lugar rio arriba de la injuria a la mitocondria. El estudio del rol de las catepsinas en la vía de muerte celular apoptótica demostró que las CatD y B regulan los niveles de expresión de FasL, intervienen en el clivaje de caspasa-8 y Bid y en la activación de la vía de muerte mitocondrial. En este contexto, el Mn activó la autofagia como un mecanismo de supervivencia celular. Los estudios in vivo sugieren que los efectos tóxicos del Mn resultan en un daño a los astrocitos del striatum y en la alteración de los niveles de expresión de la CatD en las neuronas de ciertos ganglios basales involucrados en el manganismo. En conjunto, nuestros resultados demuestran por primera vez que los lisosomas constituyen un blanco estratégico de la toxicidad del Mn, integrando la cascada de señales implicadas en la apoptosis. En este escenario, la autofagia se desencadena en un intento de rescatar a las células de la muerte. Estos hallazgos contribuyen al conocimiento de los mecanismos de daño posiblemente activados en el manganismo y probablemente en otras enfermedades neurodegenerativas.

Descripción: Diversas evidencias experimentales demostraron que el desarrollo de insulinorresistencia (IR) se acompaña de cambios en la actividad del eje hipotálamo-hipófiso_adrenal (HHA) que se traducen en variaciones en los niveles sanguíneos de glucocorticoides (GC), tanto en pacientes como en modelos animales de la enfermedad. En trabajos previos de nuestro laboratorio demostramos un aumento en los niveles de GC en animales tratados con una dieta rica en sacarosa (DRS) durante 7 semanas que se asoció con una respuesta adrenal disminuida en la prueba de estimulación con la hormona adrenocorticotropina (ACTH). Dado que la principal hormona reguladora de la secreción de GC es la ACTH, el objetivo central de este trabajo de tesis consistió en evaluar los efectos de la administración de DRS sobre la producción de ATCH en distintos estadios del dearrollo de IR y estudiar los mecanismos subyacentes a las alteraciones encontradas a nivel adenohipofisario. En ese marco, evaluamos los efectos del tratamiento antioxidante sobre cambios tempranos inducidos por el consumo de DRS y del ejercicio moderado como medida preventiva de los efectos de la exposición prolongada a la dieta. Los resultados obtenidos indicaron que en el modelo animal de IR por la administración de DRS, los animales presentaron cambios en la secreción de ACTH y corticosterona. En etapas tempranas del tratamiento (3 semanas) encontramos un aumento en la actividad del eje HHA, que fue previa a la detección de cambios en la insulinosensibilidad sistémica (evidente a partir de la séptima semana del inicio del consumo de DRS). Sin embargo, en animales tratados por períodos más prolongados (15 semanas) observamos una disminución de los niveles circulantes de ACTH y de corticosterona. Postulamos que la hiperactivación temprana del eje podría estar asociada con la generación de estrés oxidativo a nivel adenohipofisario, dado que el tratamiento antioxidante sistémico previno tanto el aumento de marcadores de este proceso como la hipersecreción de ACTH. La disminución en la actividad del eje HHA detectada en etapas más tardías del tratamiento podría ser consecuencia de la exposición crónica del tejido hipofisario al estrés oxidativo, inducido por concentraciones elevadas de ácidos grasos no esterificados (AGNE) circulantes, un efecto que podría ser medido por la inducción de autofagia. Demostramos que el ejercicio moderado previno la inducción de estos procesos y la inhibición de la secreción de ACTH en animales alimentados con DRS durante 15 semanas, además de evitar el incremento de AGNE. Finalmente, estudiamos con mayor profundidad estos procesos en células adenohipofisarias en cultivo evaluando el efecto de la incubación de células de la línea ArR-20 con ácido palmítico (C16:O) y con inductores de estrés oxidativo y autofagia. En suma, nuestros resultados indican que la administración de una DRS produce un incremento temprano en la expresión de Pomc y ACTH posiblemente mediada por la generación de estrés oxidativo tisular. Una exposición prolongada del tejido a niveles incrementados de nutrientes, como los ácidos grasos, adicionalmente induce el proceso autofágico, lo que lleva a una hipofunción de la glándula. Los GC afectan el metabolismo estimulando la movilización de las reservas energéticas. Sin embargo, un aumento sostenido de los niveles de estas hormonas podría contribuir al agravamiento de las características metabólicas del síndrome de IR, y precipitar la aparición de las complicaciones a largo plazo relacionadas con la enfermedad. En nuestro modelo, el estado de IR crónico se correlacionó con una inhibición de la actividad basal del eje HHA, lo que contribuiría al restablecimiento de la homeostasis metabólica. Sin embargo, también podría dar lugar a complicaciones adicionales, como la insuficiencia adrenal, afectando la respuesta del organismo frente a situaciones de estrés, lo que representaría otro factor de riesgo para los pacientes con IR.