Descripción: El síndrome antifosfolípido (SAF) se caracteriza por la asociación de trombosis venosa o arterial,pérdidas fetales recurrentes y/o trombocitopenia con la presencia de anticuerpos antifosfolípidos (aFL). La especificidad de estos anticuerpos por los fosfolípidos (FL) ha sido cuestionada en losúltimos años y algunos datos experimentales indican la necesidad de ciertos cofactores protéicos paraque ocurra la interacción entre los FL y los anticuerpos. La β2 glicoproteína I (β2GPI) y laprotrombina (II) humana son las principales proteínas reconocidas como cofactores. Principales objetivos - desarrollar enzimoinmunoensayos (ELISA) para evaluar la presencia de anticuerpos anti-β2-GPI yanti-II en pacientes con aFL - estudiar si las inmunoglobulinas G (IgG) purificadas de pacientes con SAF poseen distintaespecificidad antigénica que aquellas obtenidas de pacientes con sífilis. - evaluar la especificidad antigénica de los aFL en relación a las complicaciones clínicas del SAF - analizar la interferencia de los aFL sobre el sistema de la proteina C (PrC) y la biosíntesis deeicosanoidcs de origen plaquetario, como probables mecanismos fisiopatogénicos del SAF Resultados Se optimizaron las condiciones para la detección por ELISA de anticuerpos dirigidos contra β2GPI y II en ausencia de FL. La principal variable de los ensayos fue el tipo de superficie utilizada que juntocon los datos de los experimentos de inhibición indicaron que los anticuerpos sólo reconocen a lasproteínas cuando se presentan en una determinada conformación estmctural. Los anti-β2GPI y anti-IIse detectaron con una frecuencia mucho mayor en los pacientes con enfermedades autoinmunesasociadas a los aFL (SAF y lupus eritematoso sistémico) que en pacientes con aFL sincomplicaciones clínicas del SAF. Los estudios con IgG purificadas demostraron que los aFLasociados con sífilis reconocen epitopes en los FL y la mayoría de las IgGs obtenidas de pacientescon SAF reaccionan específicamente con la β2GPI y/o II. En el estudio retrospectivo de 233pacientes con aFL se encontró que los anti-β2GPI-IgG y los anti-β2GPI-IgM a títulos moderados ofuertes eran factores de riesgo independientes para trombosis venosa y complicaciones obstétricas,respectivamente. Además, los anti-β2GPI se asociaron con el fenómeno adquirido de resistencia a la PrC activada y con la alteración en la biosíntesis de tromboxano plaquetario, reflejada en una mayorexcreción urinaria del metabolito 11-dehidro-tromboxano B2. En conclusión la utilización de ensayos que nos permitan conocer la especificidad antigénica de losaFL podría ser de gran utilidad diagnóstica y permitir una mejor evaluación de los mecanismospatogénicos del SAF.

Descripción: La Fiebre aftosa (FA) es una de las principales enfermedades de origen viral que afecta muchas especies de animales domésticos y salvajes con pezuña hendida. La misma, no solo perjudica a los productores dueños de los rodeos sino que, a nivel global, ocasiona gastos y pérdidas económicas millonarias debido al costo de los programas de control y a las restricciones que se imponen en el comercio internacional. El agente etiológico es el virus de la fiebre aftosa (VFA) y su principal vía de entrada a la célula huésped es mediada por la interacción con receptores de membrana tipo integrinas (Ig). Fundamentalmente, el control del VFA es mediado por anticuerpos neutralizantes que reconocen regiones claves del virus como el referido sitio de interacción con las integrinas, en donde el motivo RGD (arginina-glicina-aspartato) resulta esencial. Toda esta región viral conforma el sitio antigénico inmunodominante que se ha denominado sitio A. Las interacciones VFA/Ac y VFA/Ig han sido estudiadas por difracción de cristales y caracterizadas a nivel cuasi-atómico para algunos complejos en particular, pero no existen investigaciones que extrapolen esta información hacia otros aislamientos del VFA, anticuerpos o integrinas de interés. A la vez, las frecuentes variaciones nucleotídicas en el genoma de un virus de ARN como el VFA, determinan una composición aminoacídica también variable que afecta en particular a las proteínas virales estructurales y sus sitios de contacto con los anticuerpos. Los elementos referidos sustentan la relevancia de las investigaciones centradas en la formalización y modelización de estos fenómenos de interacción para complejos entre Ac y otros VFA, posibilitando la generación de conocimiento que resultará de utilidad para el diseño de mejores antígenos y vacunas, así como para la comprensión de los elementos que determinan la especificidad de reconocimiento virus/célula en el modelo del VFA. En esta tesis evaluamos la efectividad de múltiples herramientas de diseño computacional, con diferentes simplificaciones físico-químicas, para modelizar los fenómenos de reconocimiento entre Ag del VFA de serotipo C y anticuerpos, y su variación ante las mutaciones del antígeno. Trabajamos con un primer conjunto de complejos de interacción, disponibles en el repositorio público de datos de estructura (PDB), entre dos Ac de referencia y variantes de un péptido que representa al sitio A del VFA. Modelizamos molecularmente todas las mutaciones puntuales posibles en todos los residuos aminoacídicos del referido péptido antigénico viral y generamos un perfil computacional de la influencia de estas mutaciones en la energía de interacción Ag/Ac. Realizamos además, modelizaciones del antígeno de cepas del VFA con mutaciones en múltiples residuos aminoacídicos representativas de brotes y aislamientos a campo, y obtuvimos una predicción de la interacción de estas variantes antigénicas con los referidos Ac monoclonales. Los resultados emergentes de esta etapa soportan la utilización de aquellos métodos computacionales, que hacen eje en las optimizaciones de las cadenas laterales y el uso de conjuntos de complejos de interacción como molde, para predecir la interacción Ag-Ac. En una 2da etapa clonamos la secuencia codificante de otros 2 Ac monoclonales obtenidos en Argentina que reconocen un sitio A similar pero del VFA A24 Cruzeiro, perteneciente al serotipo A. Para estos anticuerpos implementamos un protocolo de modelado de su estructura molecular y de su interacción con el Ag viral asistidos por la información de los perfiles mutacionales obtenidos en ensayos de ELISA con péptidos con mutaciones puntuales y de información bibliográfica. Por medio de estos resultados de ELISA desarrollamos un mapa diferencial y fino del epítopo funcional para Ac monoclonales anti serotipo A. Finalmente, trabajamos en las interacciones virus/integrinas y mediante las herramientas computacionales descritas, caracterizamos la estructura de dichos complejo de interacción y recapitulamos específicamente sobre los elementos de secuencia y estructura que determinan la especificidad de las integrinas bovinas por elmotivo RGD en el contexto aminoacídico viral. Este trabajo nos permitió detectar potenciales elementos claves en la especificidad de las integrinas αVβ6 por sus ligandos. Este trabajo de tesis demuestra la pertinencia y aplicabilidad de técnicas computacionales de predicción y modelado de la estructura y el acople molecular en fenómenos de interacción entre el sitio inmunodominante del VFA y moléculas del huésped como anticuerpos e integrinas.

Descripción: La angiogénesis es el mecanismo por el cual se generan nuevos vasos sanguíneos a partir de los pre-existentes. En adultos, la angiogénesis es un evento raro excepto durante la reparación de heridas o en procesos asociados con el ciclo menstrual. Sin embargo, existen desórdenes patológicos dependientes de angiogénesis, como el desarrollo de tumores, la retinopatía diabética, la artritis reumatoidea, entre otras. Este proceso, es modulado en condiciones normales y patológicas por el balance entre factores positivos (pro-angiogénicos) y negativos (anti-angiogénicos), y ha sido propuesto como un factor limitante en el desarrollo tumoral, jugando también un papel importante en la metástasis. Los melanomas son tumores muy agresivos y resistentes a las terapias antineoplásicas que se caracterizan por expresar diversos factores de crecimiento. Estos pueden actuar en forma autocrina e intracrina sobre la proliferación y sobrevida, y en forma paracrina en la angiogénesis. Entre estos factores se destacan el VEGF y el FGF-2. Este trabajo tiene como objetivo principal el desarrollo de anticuerpos monoclonales (AMs), capaces de neutralizar los efectos biológicos del VEGF y del FGF-2 sobre las células endoteliales y evaluarlos terapéuticamente sobre el crecimiento tumoral en ratones atímicos, inducidos por distintas líneas de melanoma humanos. También, se caracterizó la expresión de estos factores en las líneas de melanoma para evaluar si existe una relación entre el efecto terapéutico de dichos AMs y el patrón de expresión de dichos factores en las líneas de melanoma. Concluimos que sólo el bloqueo del VEGF con AMs conduce a una reducción del crecimiento tumoral, mientras que el bloqueo del FGF-2 con AMs no mostró efectos terapéuticos en los modelos ensayados, incluso en las líneas que sobre-expresaban FGF-2, ni la combinación de ambos AMs sinergizó el efecto terapéutico del AM anti-VEGF. Por otro lado, si bien el efecto del bloqueo del VEGF con AMs se observó en todas las líneas neoplásicas ensayadas, evidenciaron una gran diferencia en la respuesta, dependiendo de los niveles de expresión de FGF-2. Las líneas de melanoma que sobreexpresan FGF-2 (A375 y 1205Lu) mostraron una mayor resistencia a esta terapia antiangiogénica, con una reducción del tamaño tumoral del orden del 50% respecto a los controles. Sin embargo, en la línea de melanoma que expresa bajos niveles de FGF-2 (IIB-Mel-J) esta reducción fue cercana al 90%. En conclusión, demostramos que solo el bloqueo del VEGF con AMs es efectivo en el tratamiento de melanomas experimentales y encontramos que este efecto terapéutico es en parte dependiente de los niveles de expresión de FGF-2, que actuaría en forma intracrina, generando una resistencia al tratamiento mencionado. De esta manera, contribuimos a definir al FGF-2 como un posible marcador de resistencia a esta terapia en melanoma. Finalmente, a partir del AM anti-VEGF, desarrollamos un anticuerpo recombinante de cadena simple (scFv-Fc) neutralizante de la actividad biológica del VEGF. Resultados preliminares indican que con solo un bajo porcentaje de células transfectadas con un plásmido que expresa el scFv-Fc anti-VEGF, xenotransplantadas en ratones atímicos, alcanza para disminuir significativamente la angiogénesis y el crecimiento tumoral.

Descripción: La infección por el Virus Sincicial Respiratorio (VSR) representa mundialmente la principal causa de hospitalización en niños menores de 5 años. Mientras que la mayoría de los niños que padecen infección por VSR sufren una enfermedad leve, del 2 al 5 % de ellos padecen un cuadro severo. Al respecto, los factores que predicen la severidad de la enfermedad no se encuentran completamente esclarecidos. Previamente, nuestro grupo demostró que, durante la infección aguda y severa por VSR en niños menores de 2 años, el compartimento de células T CD4+ regulatorias (Tregs) de sangre periférica se encuentra depletado. Posteriormente, determinamos que las células T CD4+ son permisivas a la infección por VSR, lo que afecta su función. El objetivo de este trabajo consistió en caracterizar las consecuencias funcionales que impone la infección por VSR en el compartimento de células T en niños hospitalizados menores de 2 años. En primer lugar, evaluamos si la infección por VSR se asocia a una desregulación en la vía de señalización de la IL-2, citocina clave para el compartimento de las células T, en particular las Tregs. Observamos que las células T CD4+ de los niños hospitalizados por infección por VSR exhiben una menor producción de IL-2 en comparación con niños sanos, que correlacionó con la severidad de la enfermedad. El agregado de IL-2 exógena restauró parcialmente la proliferación de las células T CD4+ y la expresión de FOXP3 en niños sanos y niños con VSR. El hecho de que la vía de señalización de IL-2 y la fosforilación de STAT5 no se encontraran afectadas sugirió la presencia de otros mecanismos limitantes de IL-2. Los niños con VSR presentaron niveles elevados de CD25 soluble plasmático, un receptor secuestrador que disminuye la biodisponibilidad de IL-2. En segundo lugar, considerando que los niños menores de seis meses tienen elevados niveles de anticuerpos maternos circulantes, analizamos si los complejos inmunes que contienen IgG, a través de la unión al CD32, pueden promover la estimulación de las células T disminuyendo su umbral de activación y favoreciendo sus funciones efectoras. Inicialmente, establecimos una alta frecuencia de células T CD4+ y T CD8+ circulantes CD32+ en los niños con VSR. Estas células mostraron un predominio de la isoforma activadora del CD32 y un fenotipo compatible con células activadas relacionadas con los perfiles Th1, Tfh y Tregs. La estimulación de las células T a través de CD32 promovió la secreción de un amplio patrón de citocinas y la actividad citotóxica. Por último, la frecuencia de células T CD4+ y CD8+ CD32+ correlacionó negativamente con la severidad de la enfermedad. El desarrollo del presente trabajo de tesis permitió caracterizar, al menos parcialmente, dos mecanismos involucrados en la regulación de la respuesta mediada por las células T durante la infección por VSR en la población pediátrica. Estos hallazgos podrían impactar en diversas áreas del campo de la salud incluyendo infecciones, autoinmunidad y cáncer.

Descripción: Los camélidos poseen anticuerpos que carecen de cadena liviana y de una fracción de la cadena pesada. El sitio de unión al antígeno está formado por el dominio variable de la cadena pesada, denominado VHH. Su largo CDR3 resulta especialmente apto para la unión a epitopes cóncavos, como los sitios activos enzimáticos. Salmonella tyhimurium es una bacteria intracelular patógena que posee una ADP‐ribosiltransferasa denominada SpvB, esencial para la virulencia. SpvB induce la depolimerización de los filamentos de actina, llevando a la muerte celular. En este trabajo de Tesis, mostramos la generación de una biblioteca de expresión en fagos, a partir de linfocitos de llamas inmunizadas con el dominio catalítico de SpvB, para obtener VHHs que reconocen a SpvB e inhiben su actividad enzimática. Los clones de VHHs anti‐SpvB se secuenciaron y clasificaron de acuerdo al CDR3. Fueron seleccionados 5 clones, los cuales se expresaron y purificaron como proteína recombinante. Mediante dos ensayos independientes, mostramos que estos VHHs inhiben a SpvB. Uno de los ensayos nos permitió cuantificar la relación molar VHH:SpvB para lograr un 100% de inhibición identificando así a VHH5, que inhibe a SpvB en relación equimolar. Se transfectaron macrófagos con VHH5 y se infectaron con Salmonella typhimurium. El análisis de las células por microscopía de fluorescencia mostró claramente que VHH5 expresado en el interior celular, tiene la capacidad de proteger su citoesqueleto. Por otro lado, mediante la translocación de SpvB al citoplasma, realizamos un ensayo en células transfectadas con VHH5 para discriminar el efecto de SpvB de otros factores de virulencia. Los resultados mostraron que la expresión intracelular de VHH5 protege el citoesqueleto del efecto citopático causado por SpvB. Estos resultados constituyen una prueba de concepto sobre el uso de anticuerpos de dominio único de llama para la inhibición de enzimas intracelulares.

Descripción: El protozoario Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, expresaen su superficie moléculas con actividad trans-sialidasa. Esta actividad novedosa constituye laúnica vía de captación de residuos de ácido siálico en el parásito. La adquisición de estos azúcaresen glicoconjugados aceptores de superficie es indispensable para el reconocimiento y/o la infecciónde células de mamífero. La trans-sialidasa presente en el estadío infectivo de T cruzi tiene unaestructura quimérica, compuesta por una región responsable de la actividad catalítica y un dominiorepetitivo altamente inmunogénico (SAPA). Esta proteína es también secretada espontáneamente asangre del hospedador mamífero con propósitos inciertos. En el transcurso de la presente Tesis, hemos realizado un análisis funcional del antígeno SAPA. Más precisamente, hemos evaluado el rol que podría estar cumpliendo este dominio en lainteracción de la trans-sialidasa con el sistema inmune y en la biodisponibilidad de la moléculasecretada. Con este propósito, generamos y expresamos en bacterias distintas trans-sialidasasrecombinantes conteniendo o no al dominio SAPA. Las mismas fueron administradas en ratonessiguiendo distintos protocolos de inmunización a fin de analizar el curso de la respuesta inmunehumoral contra uno y otro dominio. Por otro lado, realizamos un análisis farmacocinético de lasdistintas enzimas purificadas. De tal manera, demostramos que la presencia del dominio SAPA cumpliría un rol dualdurante la infección; en un primer momento, estabilizando la actividad trans-sialidasa en sangre, locual podría estar asociado al mecanismo de infección y/o a las alteraciones del sistema inmune quese verifican durante la fase aguda de la enfermedad. En etapas más tardías, la presencia del dominio SAPA induce la formación de anticuerpos capaces de neutralizar la actividad trans-sialidasa. Larespuesta inmune inicial dirigida contra el dominio SAPA y/o la estabilización en sangre de lamolécula secretada en su conformación nativa podrían estar mediando la difusión de la respuestahumoral hacia epitopes presentes en la región catalítica. De hecho, también demostramos que losanticuerpos inhibitorios de trans-sialidasa están dirigidos contra epitope/s discontinuo/s en lasecuencia primaria de la enzima. Estos resultados son coincidentes con los datos clínicos, en los que se observa una faseinicial de la infección en la que puede llegar a detectarse actividad trans-sialidasa en circulación (asociado a altos niveles de parasitemia) y una fase tardía caracterizada por la presencia de anticuerposinhibitorios de dicha actividad (asociado a bajas o nulas parasitemias). La inducción de anticuerposinhibitorios mediada por SAPA contradice el rol inmunodistractor propuesto para este antígenorepetitivo, y sugiere un mecanismo seleccionado en la interacción parásito-hospedador para elestablecimiento de una infección crónica. La estabilización de la actividad trans-sialidasa en sangre requiere de un número mínimode unidades repetitivas y no depende de las secuencias no repetitivas presentes en el antígeno SAPA. El mecanismo molecular por el cual estas repeticiones aumentan la vida media de la transsialidasaen circulación no ha podido ser dilucidado, aunque no está mediado por una mayorresistencia a la degradación por proteasas séricas ni por unión de estas repeticiones a alguna proteínaendógena. De manera interesante, el dominio SAPA es también capaz de estabilizar la conformaciónnativa de otra proteína en sangre, en absoluto relacionada a la trans-sialidasa, por lo cual se sugiereuna posible aplicación biotecnológica.

Descripción: La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa demotoneuronas. Se encuentra mayormente asociada a una forma esporádica deetiología desconocida. Numerosas evidencias favorecen a la auto-inmunidad comouno de los potenciales contribuyentes a esta patología. Para estudiar los posibles antígenos que interactúan con las IgGs depacientes con ELA esporádica (IgGs-ELA), evaluamos su inmuno-reactividad haciala placa neuromuscular (PNM), comparando animales normales con aquelloscarentes de la subunidad formadora del poro del canal de calcio (Ca2+) de tipo P/Q (CaV2.1). Las IgGs-ELA mostraron una importante reactividad hacia la PNM deratones CaV2.1+/+ e incrementaron la frecuencia de potenciales de placa miniatura (MEPPs). Ambos parámetros disminuyeron significativamente al evaluar tejido deanimales CaV2.1-/-. Ensayos de inmuno-precipitación y western blot indican que elblanco de los anticuerpos no sería el canal mismo sino una proteína asociada. Estudios de proteómica sugieren a la proteína BASP-1 (proteína ácida soluble decerebro-1) como un candidato a evaluar en forma más detallada en fututosensayos. Nuestros resultados adicionan evidencias a favor de la auto-inmunidad comouno de los posibles mecanismos contribuyentes a la patología de ELA. Tambiénsugieren que los auto-anticuerpos en el suero de una serie de pacientes interactúancon proteínas cuya presencia en la PNM disminuye cuando los canales de Ca2+ detipo P/Q se encuentran ausentes.

Descripción: Se obtuvo la cepa HVB-1ΔgEβlgal, a partir de la cepa HVB-1 LA en la cual elgen de la glicoproteina E (gE)fue reemplazado por el gen de la enzima ,βgalactosidasa,por técnicas de ingeniería genética. La cepafue caracterizada tanto a nivel genómico yantigénico,como en cuanto a sus propiedades de crecimiento en cultivo celulares. La inmunogenicidad de la cepa HVB-1ΔgE-βgal se mantuvo intacta,comparada con la cepa parental, cuando se la utilizó como un inmunógeno inactivado ypermitió la diferenciación entre animales vacunados e infectados en base a surespuesta de anticuerpos. Utilizado como vacuna atenuada, HVB-1ΔgE-βgal indujo una buena respuestainmune especifica que resultó protectora frente al desafio viral, independientemente dela via de inoculación. Además, se comprobó la seguridad de la cepa HVB-1ΔgE-βgalya que, en las condiciones de la experiencia, no se transmitió por contacto, ni fueabortigénica. Asimismo, se verificó la respuesta inmune difierencial inducida frente a lavacunación con la cepa desarrollada, con respecto a la inducida por la infección viral. La respuesta inducida por la vacuna atenuada en bovinos adultos fue sostenida durante 330 días y se mantuvo negativa contra gE. La vacuna atenuada fue altamente inmunogénica tanto cuando fueadministrada en animales adultos como en terneros jóvenes. En particular, en aquellosbovinos que al momento de la vacunación tenían 3 meses de vida, hijos de madresvacunadas y que por lo tanto contaban con niveles detectables de anticuerposespecificos. Si bien se evidenció un efecto de interferencia de los anticuerpos maternosfrente al desarrollo de una respuesta inmune específica,fue posible detectar el aumentode los anticuerpos frente a una revacunación realizada cuando los bovinos contabancon 8 meses de vida (l60dpv).

Descripción: El lupus eritematoso sistémico es una enfermedad autoinmune de etiologíadesconocida. El rasgo principal de esta enfermedad es la presencia de anticuerposdirigidos contra componentes nucleares, como histonas y ADN doble cadena. En losúltimos años, se ha demostrado que varios complejos proteína: ADN pueden inducir unarespuesta autoimmune contra ADN en ratones normales, no-predispuestos a desarrollarautoinmunidad. En este trabajo de tesis se describe el desarrollo de un modelo deinmunización con un complejo proteína: ADN molecularmente definido y lacaracterización de la respuesta inmune generada contra él en animales normales. Enparticular, se utilizó el complejo formado por el dominio C-terminal del factor detranscripción E2 del papilomavirus humano y un olígonucleótido doble cadena de 18 pbcomprendiendo uno de sus sitios de reconocimiento específico dentro del genoma viral. El análisis de la respuesta inmune humoral de ratones inmunizados con la proteína E2libre o unida a ADN indica que ésta es una proteína altamente inmunogénica. Lainmunización con E2 libre emulsionada en un adyuvante de composición aceite-en-aguaresulta en una respuesta policlonal dirigida hacia el reconocimiento de epitopesdiscontinuos, sugiriendo que la naturaleza acuosa del adyuvante es el responsable demantener a la proteína en su conformación nativa. El estudio de la respuesta policlonalcontra ADN desarrollada en los ratones inmunizados con este complejo proteína: ADNseñala que el olígonucleótido específico puede adquirir potencial inmunogénico sólocuando el complejo es incubado a altas concentraciones por un largo período de tiempo. En estos casos, los ratones inmunizados desarrollaron altos títulos de IgG anti-oligonucleótidodurante una respuesta T-dependiente clásica. Además, la inmunizacióncon la proteína E2, ya sea libre o unida a su secuencia de reconocimiento, resultó en unarespuesta autoinmune contra ADN nativo doble cadena. Estos resultados son congruentescon la hipótesis de que proteínas virales con capacidad de unir ADN tendrían el potencialnecesario para iniciar el desarrollo de la enfermedad autoimmune lupus eritematososistémico. A partir de uno de los animales inmunizados con el complejo E2: ADN han sidoobtenidos y caracterizados seis anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteínaviral y dos anticuerpos contra el olígonucleótido específico. En coincidencia con elpatrón de reactividades observado en la respuesta políclonal, la mayoría de los hibridomas anti-E2 reconocen epitopes discontinuos en la proteína. Los estudios de mapeo epitópico-funcionalrealizados sobre estos anticuerpos monoclonales revelan que se han obtenidodos grandes poblaciones de anticuerpos: una formada por anticuerpos capaces de formarun complejo temario estable con E2 y el oligonucleótido, y otra población formada poranticuerpos que reconocen un epitope, parcial o totalmente, superpuesto con la superficiede unión a ADN en el factor de transcripción, interfiriendo en su interacción con ADN. Estudios detallados de la interacciones anti-ADN: ADN muestran que los dosanticuerpos monoclonales anti-ADN generados reaccionan contra el oligonucleótidoutilizado como inmunógeno con afinidades comparables a las del factor de transcripción E2. Por el contrario, estos anticuerpos unen con muy baja afinidad moléculas de ADNno-relacionadas doble cadena del mismo largo. Más aún, ambos anticuerpos unen aloligonucleótido libre y acomplejado a E2 con afinidades muy similares, formando uncomplejo temario estable. La estructura de las regiones variables y el patrón demutaciones de la secuencia de estos anticuerpos indica que éstas son muy similares a lasencontradas en anticuerpos anti-ADN generados en modelos murinos de lupus. Enconjunto, todos estos resultados sugieren fuertemente que estos anticuerpos monoclonalesanti-ADN son el producto de una respuesta inmune dirigida por el antígeno, en el cual elcomplejo E2: ADN actuó como una nueva entidad inmunogénica.

Descripción: La LLC es la leucemia de adultos más frecuente en Occidente. El uso de inhibidores de la tirosina quinasa de Bruton (iBTK) son nuevas y exitosas estrategias terapéuticas en LLC. Uno de los principales efectos adversos del tratamiento con ibrutinib, primer iBTK aprobado para su uso en pacientes, son las infecciones entre las que se encuentran aquellas causadas por micobacterias y hongos. Los efectos de los iBTK sobre las células de la inmunidad innata claves en el desarrollo de una respuesta anti-microbiana efectiva contra este tipo de microorganismos no han sido estudiados en profundidad. En este trabajo evaluamos los efectos del ibrutinib y dos iBTK de segunda generación, acalabrutinib y spebrutinib, sobre macrófagos y neutrófilos, como así también su interacción con otros agentes terapéuticos. Para esto, evaluamos el efecto de los diferentes iBTK sobre la respuesta in vitro de macrófagos y neutrófilos, obtenidos tanto de dadores sanos como de pacientes con LLC, a distintos estímulos microbianos tales como M. tuberculosis, C. albicans y A. fumigatus. Encontramos que el ibrutinib inhibió la respuesta de los macrófagos a los distintos estímulos microbianos evaluados, en particular a M. tuberculosis, y también la polarización hacia el perfil pro-inflamatorio M1. Además, el ibrutinib inhibió la activación de los neutrófilos en respuesta a estímulos fúngicos y su capacidad de impedir el crecimiento de A. fumigatus. En cuanto a los iBTK de segunda generación, encontramos que el spebrutinib no afectó ni la activación ni el fenotipo de los macrófagos, mientras que el acalabrutinib mostró los mismos efectos inhibitorios que el ibrutinib. Por otro lado, los iBTK de segunda generación inhibieron la activación de los neutrófilos de forma similar que el ibrutinib. Por último, al analizar la interacción de los iBTK con anticuerpos anti-CD20 de uso clínico en LLC, encontramos que el acalabrutinib fue el único que no inhibió los mecanismos efectores de estos anticuerpos. En conclusión, los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que los iBTK podrían estar disminuyendo la respuesta inmune innata antimicrobiana en los pacientes, y que la utilización del iBTK de segunda generación acalabrutinib podría aumentar la eficacia de las terapias combinadas de iBTK con anti-CD20.

Descripción: El virus de la diarrea viral bovina (BVDV)es el agente etiológico de una importanteenfermedad que afecta al ganado ocasionando grandes pérdidas económicas anivel mundial. La infección por BVDV es a menudo subclínica o causasintomatología clínica leve y poco específica, sin embargo, la infeccióntransplacentaria puede ocasionar desórdenes reproductivos, malformacionescongénitas y nacimiento de animales persistentemente infectados (PI). La vacuna empleada actualmente en Argentina se formula con virus inactivadoquímicamente. Sin embargo, los datos existentes sobre su efectividad para induciranticuerpos neutralizantes son contradictorios y la protección frente a la infecciónno resulta plenamente satisfactoria. En nuestro país, la prevalencia de anticuerpos anti BVDV en el ganado bovino esde 40-90%, según los reportes; aproximadamente el 2% de la población total deanimales se encuentra persistentemente infectado. En esta compleja situaciónepidemiológica, la técnica de referencia utilizada para la detección de anticuerposanti BVDV es la seroneutralización en cultivo celular. Si bien esta técnica resultamuy especifica y sensible, requiere de un laboratorio de diagnóstico de mediana-altacomplejidad y resulta económicamente desventajosa para analizar un númeroalto de muestras. En el presente trabajo se abordaron ambas problemáticas centrales para el controlde la enfermedad. Por un lado, se desarrollaron y evaluaron ensayos de ELISApara detectar anticuerpos anti BVDV en el suero de los bovinos. Los ensayos sediseñaron utilizando cada una de las tres proteínas más inmunogénicas del virus, E0, E2 y NS3, expresadas en el sistema baculovirus / células de insecto. Losensayos de ELISA demostraron ser altamente sensibles y específicos en ladetección de anticuerpos anti BVDV, de manera similar a la neutralización. Másaún, la inclusión de la proteína no estructural NS3 permitió detectar anticuerpos anti BVDV en animales tipificados como negativos en ensayos de seroneutralización. Por otro lado, se ensayó una vacuna experimental basada en la glicoproteína E2. Para ello se llevó a cabo una prueba de vacunación y desafío en la que se evaluó larespuesta inmune humoral y la protección conferida por la vacuna experimentalfrente a una de las vacunas comerciales usada actualmente. El nivel de anticuerposneutralizantes presentes en el suero de los animales vacunados con la vacunarecombinante E2 fue significativamente mayor que el inducido por la vacunainactivada convencional. Al momento del desafío, los animales vacunados con E2presentaron altos niveles de anticuerpos neutralizantes, mientras que en losanimales de los grupos vacunados con vacuna inactivada o con placebo, éstosfueron indectables. Coincidentemente, la sintomatología clínica desarrollada por losbovinos vacunados con la vacuna E2 recombinantes después del desafío viral fuemás leve. Los resultados obtenidos demuestran que es posible mejorar las actuales vacunascontra BVDV, así como diseñar nuevos ensayos diagnósticos sencillos, sensibles,específicos y económicos basados en la utilizaciónde las proteínas recombinantes E2 y E2/E0/NS3, respectivamente. Este trabajo puede considerarse como un primerpaso hacia la resolución de ambos problemas.