Descripción: En este trabajo se estudian, desde un punto de vista teórico, distintas técnicasópticas que permiten observar in vivo procesos que ocurren en células y embriones. Todas ellas involucran la obtención de registros o imágenes de fluorescencia. Uno de losobjetivos del trabajo es determinar cómo analizar los datos experimentales para extraerinformación cuantitativa sobre parámetros biofísicos relevantes para los fenómenosobservados. En particular, se analiza cómo hacerlo cuando las moléculas observadasdifunden e interactúan (reaccionan) con otras especies. En los distintos casos analizadoslas fluctuaciones de los registros o imágenes cumplen un rol fundamental ya que seusan para extraer información. En base al conocimiento construido a partir del estudiode las fluctuaciones en experimentos de fluorescencia, en el presente trabajo se avanzatambién sobre otro aspecto relevante para los procesos de señalización biológica comoes el tiempo que le lleva a un mecanismo celular endógeno “sensar” la concentración deun ligando con un dado nivel de error. En la primera parte de la Tesis se hace foco en el estudio de la técnica conocida como Espectroscopía por Correlación de Fluorescencia (FCS, por su nombre en inglés). En losexperimentos de FCS se obtienen registros de fluorescencia en un pequeño volumen apartir de los cuales se calcula la función de autocorrelación (ACF) de las fluctuacionesde la fluorescencia. Ajustando la ACF es posible extraer los tiempos de correlación quela caracterizan y los pesos con que entran dichos tiempos. Usando un modelo dinámicode los procesos que subyacen a las observaciones es posible pasar de los parámetrosde ajuste a parámetros biofísicos. En particular, a partir de los tiempos de correlaciónpueden estimarse las tasas de transporte de las moléculas marcadas y, a partir de lospesos, puede obtenerse información sobre la concentración de las moléculas observadas. En el Capítulo 2 se estudia de qué modo, para un sistema de moléculas marcadasque reaccionan y difunden, los tiempos de correlación dependen de los parámetros delsistema y de los del experimento. Se muestra, en particular, cómo variando el volumen deobservación los tiempos característicos pasan de estar determinados exclusivamente porlos coeficientes de difusión libre de las especies involucradas a depender de coeficientesefectivos que son función de las tasas de reacción. En el Capítulo 3 se estudia la variaciónde la ACF dependiendo de si las moléculas marcadas interactúan con sitios móviles oinmóviles. Se observa que en el caso de sitios inmóviles hay un tiempo de correlación cuyopeso se anula lo que tiene implicancias directas sobre la estimación de concentracionesa partir de los experimentos. En este Capítulo se estudia también con qué precisión esposible estimar concentraciones dependiendo de la longitud de los registros analizados. En el Capítulo 4 se estudia la precisión de los mecanismos de “lectura” endógenosque involucran la ligadura de moléculas “efectoras” a sitios en la célula y la posteriorgeneración de una respuesta que depende de la concentración “leída”. Se presentan, enparticular, expresiones que permiten estimar el error en la concentración sensada comofunción del tiempo de observación y los tiempos característicos del sistema. Uno delos mayores aportes de esta parte del trabajo radica en que, a diferencia de estudiosanteriores, las expresiones describen el decaimiento del error para todo el rango detiempos de observación, no sólo en el límite asintótico. Por otro lado, incorpora unacorreción que tiene en cuenta la no linealidad del sistema que es relevante para tiempostempranos cuando se estudia el comportamiento de sitios de ligadura únicos. En eltrabajo se muestra cómo esta corrección “no lineal” permite interpretar la reducciónen las fluctuaciones observada en experimentos realizados en embriones de la mosca Drosophila melanogaster cuando se comparan las asociadas a la producción instantáneade mRNA con las de la proteína correspondiente acumulada a lo largo del tiempo. Apartir de la descripción de las fluctuaciones tempranas se presenta también en este Capítulo una estimación de la distribución de tiempos de espera entre eventos de ligaduraconsecutivos. La distribución obtenida permite interpretar observaciones experimentalesde la actividad de enzimas a nivel de molécula única sin recurrir a modelos que suponenque la molécula fluctúa entre un sinnúmero de estados conformacionales distintos. La observación de fenómenos in vivo mediante microscopía de fluorescencia es engran parte factible debido a que pueden manipularse los organismos en estudio paraque expresen algunas proteínas de interés con una cola fluorescente. Esto permite,por ejemplo, estudiar las propiedades espacio-temporales de gradientes de proteínasinvolucrados en morfogénesis. Un caso analizado con gran detalle es el del desarrolloembrionaria temprano de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, en particular,el del gradiente de la proteína Bicoid (Bcd) a lo largo del eje antero-posterior. Enmuchos trabajos se interpretan las observaciones experimentales en el marco de unmodelo (SDD) en el que el Bcd es sintetizado en un extremo del embrión desde dondedifunde a lo largo de éste a la vez que se degrada. El modelo SDD no logra explicarcuantitativamente las características observadas del gradiente. En el Capítulo 5 seanaliza de qué modo varía la información que puede extraerse de las imágenes al teneren cuenta que Bcd no sólo difunde sino que también se liga a sitios internos y que lafluorescencia observada no distingue entre Bcd libre y Bcd ligado. Se introduce para talfin una extensión del modelo SDD al que llamamos SDID ya que incluye la interaccióncon sitios de ligadura con el que se estudia tanto la dinámica espacio-temporal de laconcentración de Bcd como su habilidad para actuar como factor de transcripción. Elmodelo logra reproducir las observaciones experimentales con parámetros biofísicosrazonables y abre la puerta a una reinterpretación de la relación existente entre Bcd yla proteína Hunchback para cuya producción el Bcd es factor de transcripción. Finalmente, en el Capítulo 6 se analiza la validez y limitaciones de un modelo quedescribe las fluctuaciones de fluorescencia en imágenes donde se observa la distribuciónde Ca2+ intracelular utilizando fluoróforos que cambian su intensidad al ligar a esteión (single-wavelength Ca2+ dyes). El modelo es la base de un método que permitecomparar cuantitativamente entre sí experimentos de señales de Ca2+ realizados endistintas condiciones experimentales y que ayuda, por otro lado, a identificar parámetrosexperimentales óptimos para cada “set-up”. El análisis detallado presentado en este Capítulo muestra que el modelo reproduce correctamente las fluctuaciones observadasaunque no siempre para un conjunto unívoco de parámetros. Palabras claves: Modelado de técnicas ópticas, análisis fluctuaciones, sistemas dereacción-difusión, fluorescencia, correlación