Descripción: En la presente Tesis Doctoral se realizaron estudios sobre la biosíntesis de aldosterona, en la glándula interrenal de Bufo arenarum, a partir de distintos sustratos tales como corticosterona, 18-hidroxicorticosterona (18-OH-B) y el compuesto "N" que se biosintetiza a partir de pregnenolona pero no de progesterona. A diferencia de lo que ocurre con la 18-OH-B comercial o de rata, la proveniente de interrenales de sapo presenta una forma menos polar única y distinta de las conocidas hasta el momento. Con respecto a la precursoriedad de aldosterona que posee este esteroide 18-hidroxilado, los resultados mostrados indican que esta hormona no es intermediario en la biosíntesis de aldosterona, por lo menos en las condiciones utilizadas para los experimentos presentados en esta Tesis. También se ensayó la capacidad precursora de aldosterona que tiene corticosterona y la conclusión a la que se arribó es que la capacidad biosintética de este conocido intermediario en la síntesis de aldosterona es, también, muy baja. Se caracterizó por diversos métodos el compuesto "N", esteroide muy polar con movilidad intermedia entre 18-OH-B y cortisol en el sistema Bush B5, como el 3β -hidroxi-5-ene análogo de aldosterona (3β ,11β ,21-trihidroxi-5-pregnen-20-ona-18-al). Cuando se estudiaron las propiedades biosintéticas del compuesto "N", este esteroide demostró ser un muy buen precursor para la síntesis de aldosterona. La importante capacidad precursora de aldosterona que posee "N", a la menor precursoriedad de corticosterona y a la falta de capacidad de 18-OH-B, indican que en Bufo arenarum, la isomerización del doble enlace Δ 5 a Δ 4 es un paso muy tardío en el camino biosintético de aldosterona. La transformación del análogo de aldosterona en el mineralocorticoide es catalizada por la enzima 3β -hidroxiesteroide deshidrogenasa-Δ 4 isomerasa de localización mitocondrial. La actividad de la enzima mencionada es regulada por la concentración de sodio del medio, la que parece regular la cantidad de enzima presente en aquella fracción.

Descripción: El presente trabajo tuvo como objetivo la elucidación de algunos aspectos (cinéticos,estructurales y metabólicos) relacionados con los últimos pasos de la biosíntesis dealdosterona (ALDO). La última etapa de la biosíntesís de ALDO involucra laoxidación mitocondrial de 11-desoxicorticosterona (DOC), a través de diferentescaminos siendo sus primeros metabolitos corticosterona (B) y 18-hidroxi-1 desoxicorticosterona (18-OHDOC). Todas estas reacciones son catalizadas porenzimas de la familia de los citocromos P-450. Una de estas enzimas es el citocromo CYP11B1 involucrado en la transformación de DOC a B y 18OHDOC. El otrocitocromo involucrado, CYP11B2 es el responsable de la transformación de B a 18-hidroxicorticosterona (l8-OHB) y a ALDO. Mediante los resultados obtenidos altrabajar con cortisol como sustrato alternativo en este camino metabólico se pudoclasificar a las enzimas presentes corno sensibles a cortisol (SC) o insensible a cortisol (ISC), siendo esta clasificación compatible con la existencia de las dos enzimasclonadas CYP11B1 y CYP11B2. Cortisol inhibió competitivamente la transformaciónde B a ALDO y 18-OHDOC a ALDO. Por otro lado, se desarrollo un modelomatemático para el estudio de inhibidores suicidas. Se observó que 18-etinil-11-desoxicorticosterona (18-EtDOC) se comportaba como inhibidor suicida. Mediante lautilización del nuevo modelo propuesto se calcularon los diferentes valores de lasconstantes de inhibición para los diferentes pasos involucrados. Los valores obtenidosconcuerdan nuevamente con la existencia de los dos citocromos CYP11B1 y CYP11B2. Por otro lado se logró caracterizar un intermediario dimérico del camino de 18OHBa ALDO, el cual resultó un buen sustrato para la biosintesis de aldosterona. Mediante los estudios realizados y utilizando como base de estudio animalestratados con litio, se observó que 1a secreción de ALDO por 1a vizcacha (Lagostomus maximus maximus) es más sensible a estos tratamientos que estasecreción por la rata, especie usualmente utilizada en estos tipos de estudio. Sepuede concluir que dado que el litio produce efectos colaterales en estos animales,se debería estudiar en humanos si estos efectos se repiten en los tratamientoscrónicos con este ión.

Descripción: Los glicosilfosfatidilinositoles (GPIs) son una familia decompuestos que pueden actuar como anclas de proteínas a membranascelulares y también pueden estar libres en estas membranas. Porhidrólisis de GPI con fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC)se libera inositolfosfoglicano (IPG) que ha sido propuesto como segundomensajero de insulina y otras hormonas. Resultados del laboratoriomostraron que ACTH es capaz de hidrolizar GPI y que un IPG conestructura conservada purificado de Trypanosoma cruzi es capaz deinhibir la acumulación de aldosterona mediada por ACTH en célulasadrenocorticales de vaca. El objetivo de este trabajo fue estudiar: a) GPIs presentes encorteza adrenal bovina, b) La participación de estos compuestos en larespuesta de ACTH y c) GPI y sus precursores en Schizosaccharomycespombe, una sistema no estudiado hasta el presente, con el fin de buscaruna fuente de GPI para los estudios biológicos. En este trabajo se mostró la presencia de anclas de GPI en cortezaadrenal pues se encontraron compuestos suceptibles a ácido nitroso y sepurificó parcialmente una enzima anclada por GPI la fosfatasa alcalina, FAL, cuyo ancla fue utilizada como fuente de IPG y se probó su efectoinhibitorio sobre la respuesta de ACTH. Con respecto a la participación de GPI en la respuesta de ACTH,se encontró que esta hormona es capaz de activar una PI-PLC, a travésde una proteína G inhibible por toxina de pertussis, Gi/o, en célulasadrenocorticales, lo que muestra que el receptor de ACTH puedeacoplarse a más de un tipo de proteína G (Gs, Gi). La activación de PI-PLCpor la hormona sugiere la producción de IPG. Se encontró que un IPG purificado de T. cruzi, fue capaz de inhibir en célulasadrenocorticales la producción de aldosterona, corticosterona (en rata) ycortisol (en vaca). ACTH utiliza AMPc como segundo mensajero. Losresultados sugieren que el efecto inhibitoriode IPG estaría mediado poruna activación de fosfodiesterasa, enzima que degrada AMPc, y unainhibición de PKA. Se sabe que IPG es liberado al medio extracelular y luego entra enla célula donde actúa. En concordancia con este hecho hemos visto que: a) los sobrenadantes de células tratadas con ACTH son capaces deinhibir la respuesta de la hormona y b) el agregado del anticuerpo anti-CRDcontra IPG aumenta la acumulación de esteroides mediada por ACTH. Estos resultados muestran que ACTH es capaz de liberar IPG elcual inhibe su respuesta y reafirman la hipótesis de que el IPG participaen la respuesta fisiológica de esta hormona. Por otro lado, con el objeto de obtener una fuente de GPI pararealizar los estudios biológicos, más fácil de trabajar que eltrypanosoma, se estudiaron GPI y sus precursores, losinositolfosfolípidos, en S. pombe, pues se ha encontrado que en otralevadura, Saccharomyces cerevisiae, estas anclas son abundantes. S.cervisiae es la única levadura cuyos GPIs han sido estudiados hasta elmomento por lo cual fue interesante encarar el estudio de otra levadura, Schizosaccharomyces pombe de caracteristicas biológicas diferentes a S.cervisiae. Se ha visto que los inositolfosfolípidos consisten principalmente enfosfatidilinositol y no contienen alquilglicerol ni ceramida. Se ha obtenidola estructura completa de estos inositolfosfolípidos por estudios en TLC, RPTLC y CGL, a partir de cultivos con o sin incorporaciones de palmiticoradioactivo. Se encontró un único ácido graso esterificando la posición 2de fosfatidilinositol y una mezcla en posición 1. A pesar de que no seincorporó ceramida en inositolfosfoceramidas, se demostró la existenciade [³H]-esfingomielina, esfingofosfolípido característico de mamíferos,conteniendo ceramida radioactiva. Se detectó una banda de proteínas de PM 19.000 aproximadamente que incorpora [³H]-ácido palmitico. Luegode digestión con proteasa e hidrólisis con GPI-PLD se liberaron lípidosmarcados que prueban la existencia de anclas en esta fracción. Por otra parte, se evidenció la presencia de GPIs libres enextractos orgánicos por susceptibilidad a ácido nitroso y PIPLC. Estoscompuestos, fueron utilizados como fuentes de IPG y se probó su efectoinhibitoriosobre la acumulación de corticosterona por ACTH.

Descripción: Dado que en la síntesis de hormonas esteroides a partir de colesterol participan distintos citocromos P450, que son hemoproteínas, es posible que exista una relación entre la síntesis de esteroides y la de hemo. Con el fin de analizar esta posibilidad, en el presente trabajo se estudió el efecto del agregado de hemina sobre la síntesis de esteroides en adrenales de rata. Se encontró que la adición de hemina in vitro a homogenatos de adrenal o la administración de hemina a ratas in vivo, estimulan la síntesis de esteroides. Por otro lado, 3,5-dietoxicarbonil-1,4-dihidrocolidina, fue capaz de inhibir la síntesis de hemo en adrenal similarmente a lo que ha sido descripto en hígado, por inhibición de la última enzima de esta biosíntesis, la ferroquelatasa. El bloqueo de la síntesis de hemo en adrenal con DDC produjo una disminución de la acumulación de aldosterona y corticosterona producida por ACTH. Este efecto del DDC fue parcialmente revertido por tratamiento de las ratas con hemina. Es decir que el contenido de hemo es un factor limitante de la respuesta de un estimulador de la síntesis de esteroides como ACTH. El fenobarbital, un conocido inductor de la síntesis de hemo, que estimula la transcripción de la enzima regulatoria de esta biosíntesis, el ALA-sintasa, actuando sobre el promotor de este gen que es el mismo que se expresa en adrenal, fue capaz de estimular la síntesis de aldosterona y corticosterona en adrenales de rata. Además, se encontró que estimuladores de la síntesis de esteroides en adrenal, como ACTH y endotelina, son capaces de aumentar el mRNA de ALA-sintasa de modo de asegurar una suficiente provisión de hemo para transformar los apociticromos libres, involucrados en síntesis de esteroides, en holocitocromos activos. Es decir que la disponibilidad de hemo afecta la síntesis de esteroides y los estimuladores de la síntesis de esteroides aumentan el mRNA de ALA-s para asegurar esta disponibilidad. También en este trabajo se investigó la participación de glicosilfosfatidilinositol (GPI) en la respuesta de ACTH. Teniendo en cuenta que se había informado que ACTH estimula una fosfolipasa C que hidroliza GPI, lo que libera inositolfosfoglicano (IGP), que es capaz de inhibir la acumulación de esteroides mediada por ACTH y que ACTH estimula la liberación al medio extracelular de fosfatasa alcalina, una enzima anclada a la superficie celular por GPI; se quiso investigar si la liberación de fosfatasa alcalina por ACTH está mediada por una fosfolipasa C que hidroliza GPI y el mecanismo involucrado en la activación de esta fosfolipasa. Se encontró que ACTH a través de AMPc activa una Gi que es necesaria para la activación de una fosfolipasa C de GPI involucrada en la liberación de fosfatasa alcalina por la hormona. Es decir que el receptor de ACTH, como ha sido descripto con otros receptores acoplados a Gs que estimulan la producción de AMPc, es capaz de producir un posterior acoplamiento a Gi mediado por AMPc. Este acoplamiento a Gi media la activación de una fosfolipasa C de GPI lo que produce IPG que, como se había visto, es capaz de inhibir la respuesta de la hormona. Por lo tanto, la respuesta de ACTH se inicia con un acoplamiento a Gs y posteriormente un acoplamiento a Gi que mediaría una señal de apagado de la respuesta.