Descripción: Las proteínas INK4 (p16INK4a, p15INK4b, p18INK4c, y p19INK4d) componen una familia de inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas (CDKs) que funcionan en la fase G1 bloqueando la actividad de las quinasas CDK4 y CDK6. Mientras que comparten similitudes en sus estructuras formadas por repeticiones de motivos ankirina, estas proteínas difieren en sus patrones de expresión durante el desarrollo y en el adulto. Más allá de la aparente redundancia de su función en el control del ciclo celular, algunos de sus miembros han sido involucrados en distintos procesos tales como diferenciación, senescencia y supresión tumoral. En este trabajo demostramos que p19INK4d es inducido por radiación UV en diferentes tipos celulares (células de Leydig MA-10, cultivos primarios de células de Leydig, BHK-21 y WI-38) y que la inducción es específica de este miembro de la familia. Planteamos que la inducción podría implicar una posible participación de p19INK4d en la reparación del ADN. Mediante diversas estrategias, establecimos que p19INK4d efectivamente tiene una función en este proceso. Además, frente a daño genotóxico la disminución en los niveles de p19INK4d aumentó el número de aberraciones cromosómicas, concluyendo que la actividad de p19INK4d afecta el mantenimiento de la integridad del genoma. Sumado a esto, las células con niveles reducidos de p19INK4d resultaron con menor capacidad de sobrevivir al tratamiento con radiación UV. En respuesta al daño al ADN se encienden una serie de cascadas de señales que involucran diversas proteínas quinasas. Estas quinasas activan a su vez diferentes sustratos efectores de la respuesta conduciendo a la reparación, o no, del daño. Habiendo descripto una función de p19 en este proceso el siguiente objetivo consistió en estudiar si p19 formaba parte de este grupo de proteínas efectoras fosforiladas frente al daño. Encontramos que p19 es fosforilada por agentes que inducen diferentes tipos de daño (radiación UV, péptido β-amiloide y cisplatino). Identificamos dos sitios de fosforilación, serina 76 y treonina 141, los cuales son fosforilados en forma secuencial. Los resultados señalan a CDK2 y CDK5 como responsables de la fosforilación en serina 76 y a PKA en treonina 141. La fosforilación de ambos sitios ocurre en el citoplasma y la serina 76 es necesaria para la translocación de p19 al núcleo en esta respuesta. Evaluamos luego la relevancia fisiológica de la fosforilación en estos sitios. Encontramos que tanto la serina 76 como la treonina 141 son estrictamente necesarias para la función de p19 en la reparación del ADN. Sin embargo, mutantes en estos sitios incapaces de ser fosforiladas, mantienen la misma capacidad de inhibir la proliferación del ciclo celular cuando son sobreexpresadas. Esto señala que existe una independencia en la función de reparación respecto de la función inhibitoria de CDK4/CDK6. Por último, iniciamos el estudio referido a las posibles proteínas que interactúan con p19INK4d relacionadas a la función de reparación del ADN. Describimos seis interactores encontrados por análisis de doble híbrido en levaduras que resultan de particular interés porque presentan funciones en procesos comunes a p19INK4d. Estos posibles interactores participan en la reparación del ADN, en la remodelación de la cromatina y en la regulación de factores de transcripción del ciclo celular y la apoptosis. En vista de la participación de p19INK4d en respuesta a diversos agentes genotóxicos, que activan distintos mecanismos de reparación, postulamos que p19INK4d actuaría en la reparación del ADN específicamente en una etapa temprana de la respuesta celular al daño al ADN. El análisis de los potenciales interactores de p19INK4d, luego de la injuria genotóxica, permite sugerir la participación de esta proteína en los complejos remodeladores de la cromatina necesarios para permitir el acceso de las maquinarias de reparación en los sitios de daño.

Descripción: Agentes genotóxicos endógenos y exógenos amenazan continuamente la integridad dela estructura molecular del ADN. Dentro del sistema nervioso, respuestas apropiadasal daño al ADN son requeridas para mantener la homeostasis celular y prevenirenfermedades. Dado que las neuronas maduras son células post-mitóticas altamentediferenciadas que no pueden ser reemplazadas –en su gran mayoría– en caso detrauma o enfermedad, las mismas han seleccionado mecanismos para defender laintegridad de su genoma, por ende asegurando su longevidad y funcionalidad de caraa dichas amenazas. Defectos en la respuesta al daño al ADN en células neuronalesestán comúnmente asociados a neurodegeneración. La identificación de factoresneuroprotectores y de supervivencia neuronal es clave para la comprensión de laprogresión de desórdenes neurodegenerativos y para el establecimiento de terapiaspara menguar las consecuencias neurológicas de tales enfermedades. La familia de factores de transcripción E2F fue originalmente involucrada en eldesempeño de un rol crítico en el control del ciclo celular. Evidencias han dejado enclaro que –dado a su plasticidad funcional– estos factores participan en la regulaciónde una plétora de procesos biológicos, que incluyen la respuesta celular al daño al ADN. El principal objetivo de este trabajo consistió en estudiar la participación de losmiembros de la familia de factores de transcripción E2F en el mantenimiento de laintegridad genómica en células neuronales, y evaluar su potencial papel como factoresneuroprotectores. En esta tesis se demostró que E2F1 y E2F2, el último específicamente en célulasneuronales, son inducidos transcripcionalmente en respuesta al daño al ADN. Estemecanismo novedoso, el cual es común a la respuesta a diversos agentes genotóxicos yel cual se encuentra conservado en distintas especies, contribuye al incremento de losniveles proteicos de E2F1 y E2F2 como consecuencia de síntesis proteica de novo. Asimismo, se observó que E2F2 es estabilizado tempranamente por un mecanismopost-traduccional luego de injuria genotóxica al igual que fue reportado previamentepara E2F1. Por lo tanto, existen dos mecanismos consecutivos en el tiempo queconducen al aumento de E2F1 y E2F2 luego de daño al ADN: la estabilización proteicapor modificaciones post-traduccionales de la proteína E2F ya sintetizada, seguida de lainducción transcripcional del gen E2F y la consecuente síntesis proteica de novo. De estamanera, los factores E2F1 y E2F2 inducidos por daño al ADN contribuyen almantenimiento de la integridad genómica y a la resistencia a la injuria genotóxica alpromover la reparación del ADN, conllevando a una reducida respuesta apoptótica y auna incrementada supervivencia celular. Dichas respuestas las llevan a cabo al ejercerdos papeles diferentes. Primero, mediante un rol transcripcional que implica laexpresión de genes que favorecen la supervivencia en respuesta al daño al ADN. Segundo, a través de un rol no-transcripcional, localizándose en sitios de lesión al ADN y promoviendo el reclutamiento de factores de reparación y proteínasremodeladoras de la cromatina. En resumen, las evidencias presentadas en este trabajo establecen a E2F1 y E2F2 comofactores neuroprotectores implicados en el mantenimiento de la estabilidad genómicaen células neuronales en respuesta a injuria genotóxica. Es importante enfatizar que sedemostró por primera vez que E2F2 es inducido por estrés genotóxico y que cumple unrol crítico en la respuesta al daño al ADN. Palabras clave: células neuronales; estabilidad genómica; factor de transcripción E2F;reparación del ADN; respuesta al daño al ADN.

Descripción: El lupus eritematoso sistémico es una enfermedad autoinmune de etiologíadesconocida. El rasgo principal de esta enfermedad es la presencia de anticuerposdirigidos contra componentes nucleares, como histonas y ADN doble cadena. En losúltimos años, se ha demostrado que varios complejos proteína: ADN pueden inducir unarespuesta autoimmune contra ADN en ratones normales, no-predispuestos a desarrollarautoinmunidad. En este trabajo de tesis se describe el desarrollo de un modelo deinmunización con un complejo proteína: ADN molecularmente definido y lacaracterización de la respuesta inmune generada contra él en animales normales. Enparticular, se utilizó el complejo formado por el dominio C-terminal del factor detranscripción E2 del papilomavirus humano y un olígonucleótido doble cadena de 18 pbcomprendiendo uno de sus sitios de reconocimiento específico dentro del genoma viral. El análisis de la respuesta inmune humoral de ratones inmunizados con la proteína E2libre o unida a ADN indica que ésta es una proteína altamente inmunogénica. Lainmunización con E2 libre emulsionada en un adyuvante de composición aceite-en-aguaresulta en una respuesta policlonal dirigida hacia el reconocimiento de epitopesdiscontinuos, sugiriendo que la naturaleza acuosa del adyuvante es el responsable demantener a la proteína en su conformación nativa. El estudio de la respuesta policlonalcontra ADN desarrollada en los ratones inmunizados con este complejo proteína: ADNseñala que el olígonucleótido específico puede adquirir potencial inmunogénico sólocuando el complejo es incubado a altas concentraciones por un largo período de tiempo. En estos casos, los ratones inmunizados desarrollaron altos títulos de IgG anti-oligonucleótidodurante una respuesta T-dependiente clásica. Además, la inmunizacióncon la proteína E2, ya sea libre o unida a su secuencia de reconocimiento, resultó en unarespuesta autoinmune contra ADN nativo doble cadena. Estos resultados son congruentescon la hipótesis de que proteínas virales con capacidad de unir ADN tendrían el potencialnecesario para iniciar el desarrollo de la enfermedad autoimmune lupus eritematososistémico. A partir de uno de los animales inmunizados con el complejo E2: ADN han sidoobtenidos y caracterizados seis anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteínaviral y dos anticuerpos contra el olígonucleótido específico. En coincidencia con elpatrón de reactividades observado en la respuesta políclonal, la mayoría de los hibridomas anti-E2 reconocen epitopes discontinuos en la proteína. Los estudios de mapeo epitópico-funcionalrealizados sobre estos anticuerpos monoclonales revelan que se han obtenidodos grandes poblaciones de anticuerpos: una formada por anticuerpos capaces de formarun complejo temario estable con E2 y el oligonucleótido, y otra población formada poranticuerpos que reconocen un epitope, parcial o totalmente, superpuesto con la superficiede unión a ADN en el factor de transcripción, interfiriendo en su interacción con ADN. Estudios detallados de la interacciones anti-ADN: ADN muestran que los dosanticuerpos monoclonales anti-ADN generados reaccionan contra el oligonucleótidoutilizado como inmunógeno con afinidades comparables a las del factor de transcripción E2. Por el contrario, estos anticuerpos unen con muy baja afinidad moléculas de ADNno-relacionadas doble cadena del mismo largo. Más aún, ambos anticuerpos unen aloligonucleótido libre y acomplejado a E2 con afinidades muy similares, formando uncomplejo temario estable. La estructura de las regiones variables y el patrón demutaciones de la secuencia de estos anticuerpos indica que éstas son muy similares a lasencontradas en anticuerpos anti-ADN generados en modelos murinos de lupus. Enconjunto, todos estos resultados sugieren fuertemente que estos anticuerpos monoclonalesanti-ADN son el producto de una respuesta inmune dirigida por el antígeno, en el cual elcomplejo E2: ADN actuó como una nueva entidad inmunogénica.

Descripción: El crecimiento tumoral resulta de la interacción de la célula neoplásica y su entorno. SPARC “Secreted Protein Acid and Rich in Cystein” es una proteína de matriz extracelular cuyaexpresión normal se asocia al desarrollo y a tejidos en remodelación. En la mayoría de lasneoplasias el aumento de la expresión de SPARC se asocia con un mal pronóstico. Sin embargo,en cáncer de mama la función que cumple la expresión de esta proteína en relación alcrecimiento del tumor primario y la diseminación metastásica es controvertida. En este trabajonos propusimos profundizar las funciones de SPARC, proveniente tanto del estroma como delas células epiteliales en la biología del cáncer de mama. A partir de los estudios realizados con animales transgénicos (SP-/-) que no expresan SPARC enninguna de sus células, diferentesmodelos de cáncer de mama humanos con distintos nivelesde expresión de SPARC, y la cuantificación de la expresión de la proteína en muestras depacientes con cáncer de mama, determinamos que la expresión de SPARC en amboscomponentes tumorales, epitelio y estroma, favorece el fenotipo maligno. Mientras que laelevada expresión en el epitelio tumoral resultó ser más relevante, encontramos que laexpresión de SPARC en el estroma tumoral favorece el crecimiento del tumor sólo si el epitelioes negativo. Por otro lado, mediante la utilización del modelo murino 4T1, representativo de un tumorhumano estadio IV, pudimos establecer una relación positiva entre la expresión de SPARC y laetapa metastásica de la enfermedad. A partir de la tecnología de microarreglos de ADN,encontramos que SPARC es un importante modulador transcripcional del espacio extracelulary de la proliferación celular, así como también de la respuesta inmune. Finalmenteidentificamosalgunos genes como posibles efectores de SPARC, favorecedores del crecimientotumoral y la diseminación metastásica.

Descripción: Previamente demostramos que el ADN bacteriano extracelular activa a los neutrófilos a través de un mecanismo diferente al canónico CpG-dependiente. El ADN extracelular es un componente central en la formación y estructura de los biofilms bacterianos, comunidades responsables de más del 60% de las infecciones ocasionadas por estos microorganismos. La presente tesis tuvo como objetivos centrales determinar el impacto del ADN de la matriz de los biofilms en la activación de los neutrófilos humanos y la identificaron del receptor involucrado en el reconocimiento de ADN. Los estudios realizados indicaron que la degradación con DNAsa I del ADN de la matriz extracelular de los biofilms de P. aeruginosa redujo marcadamente su capacidad de inducir la activación de los neutrófilos, determinada en función de su habilidad para producir citoquinas proinflamatorias, incrementar marcadores de activación fisiológicamente relevantes, de mediar la fagocitosis y de liberar trampas extracelulares de los neutrófilos (NET). La aplicación de técnicas de MALDI-TOF nos permitió identificar, en el neutrófilo, 16 proteínas con capacidad de unir ADN bacteriano. A pesar de que ninguna de ellas resultó ser el receptor de la superficie celular para ADN, es posible que dos de las proteínas encontradas constituyan sensores intracelulares de ADN, cuya relevancia queda por ser explorada. Los hallazgos realizados en la presente Tesis confirman la existencia de una proteína de la superficie del neutrófilo capaz de mediar el reconocimiento de ADN y la activación celular por esta molécula. Además, indican que el ADN de la matriz extracelular representa un componente proinflamatorio relevante de los biofilms de P. aeruginosa. Los mismos permiten especular que el reconocimiento del ADN de la matriz de biofilms podría representar un mecanismo seleccionado evolutivamente para permitir al huésped incrementar su capacidad de responder a este tipo de infecciones bacterianas persistentes

Descripción: El cáncer de próstata (PCa) es el segundo tipo de cáncer más frecuente en el mundo. En la Argentina, es el de mayor incidencia y el segundo en mortalidad. La edad, el origen étnico, la historia familiar, el estilo de vida y la obesidad son importantes factores de riesgo asociados al desarrollo de esta patología. En este trabajo de tesis nos centralizamos en el rol de BRCA1 en diferentes vías que contribuyen al desarrollo del PCa. Estudiamos la regulación transcripcional mediada por BRCA1 del gen ATM, clave en el mantenimiento de la estabilidad genómica celular. Determinamos que el complejo formado por las proteínas BRCA1, E2F1 y CtIP, se asocian al promotor de ATM y activan su transcripción. Asimismo, cuando se induce estrés genotóxico, BRCA1 y CtIP se liberan reprimiendo su transcripción. Además, estudiamos la regulación transcripcional de BRCA1. Encontramos que los andrógenos, la principal hormona masculina, regula la expresión de BRCA1 en líneas celulares de PCa. Esta hormona reprime la transcripción de BRCA1 en las células LNCaP, sensibles a andrógenos. Mientras que en las células PC3, insensibles a andrógenos, la testosterona aumenta los niveles de expresión de BRCA1. Esta diferencia en la respuesta a la testosterona en las células tumorales de próstata parece responder a un efecto en la síntesis de estrógenos a partir de andrógenos. En este trabajo de tesis también determinamos que las proteínas CtBP1 y BRCA1 se encuentran asociadas a la región proximal del promotor de BRCA1 reprimiendo su transcripción. En la línea tumoral PC3, la testosterona provoca que estos factores se liberen del promotor de BRCA1 activando su transcripción. Utilizando líneas celulares que sobre-expresan o tienen disminuida en forma estable la expresión de CtBP1, encontramos que la sobreexpresión de CtBP1 aumenta la transformación y la viabilidad celular. En un modelo de xenotransplantes generado por inoculación de estas células estables en ratones nude, determinamos que la disminución de la expresión de CtBP1disminuyó drásticamente el crecimiento tumoral solo cuando los animales habían sido alimentados con una dieta hipercalórica. Asimismo, la incubación de las líneas estables de PC3 con el suero proveniente de animales alimentados con una dieta hipercalórica aumento la proliferación celular de las células que sobre-expresan CtBP1 al igual que se ven favorecidos la activación de procesos de EMT que podrían conducir al establecimiento de metástasis. En resumen, en este trabajo de tesis describimos por primera vez un mecanismo de regulación transcripcional de ATM por BRCA1 en respuesta al estrés genotóxico. Además determinamos que los andrógenos y la dieta hipercalórica pueden influenciar el desarrollo tumoral prostático alterando la vía de CtBP1/BRCA1. Por lo tanto, estos resultados aportan nuevas evidencias en cuanto a la regulación transcripcional de BRCA1 y su función co-reguladora de otros blancos moleculares fortaleciendo así su rol supresor tumoral en el PCa.

Descripción: BNCT es una radioterapia para el cáncer. Se basa en la reacción 10B (n, α) 7Li utilizando el compuesto borado BPA. Las partículas resultantes (alta LET) provocan DSBs (Double Strand Breaks) en el ADN que pueden ser reparadas por las vías homologous recombination (HR) y non homologous end joining (NHEJ). La inhibición de estas vías podría mejorar la respuesta del tumor a la terapia. El objetivo de este trabajo fue: Optimizar la respuesta del carcinoma pobremente diferenciado de tiroides a BNCT. Se demostró que la radiación de alta LET proveniente de BNCT produce DSBs más complejas que la de baja LET (Gamma) y que induce la expresión de la enzima de reparación Rad51 (HR) en una línea celular de carcinoma tiroideo. Estudios en células de melanoma demostraron que el patrón de daño es específico para cada línea celular pero que la vía de reparación activada luego de BNCT sería la misma en los dos carcinomas. El inhibidor específico de la enzima Rad51: (E)-3-benzyl-22-(pyridin-3-yl) vinyl) quinazolin-4(3H)-one (B02) aumentó el tamaño de las DSBs. Los estudios in vivo demostraron que la administración intraperitoneal de NaB aumentó la captación de BPA intratumoral y las relaciones en la concentración de boro entre el tumor y la sangre y el tumor y la piel normal circundante, cumpliendo con los requisitos para aplicación de la terapia. Los estudios de irradiación mostraron que el 80% de los tumores tratados con NaB desaparecieron y no volvieron a crecer durante el tiempo que duró la evaluación. Esto representó un aumento del 10% en la efectividad de la terapia respecto a BNCT solo. Conocer los mecanismos celulares radioinducidos por BNCT descriptos podrían ser de utilidad para mejorar la efectividad de la terapia.

Descripción: El reconocimento antígeno-anticuerpo se basa en identificación de estructuras químicas de agentes foráneos como no-propias. El ADN suele ser escasamente inmunogénico dada su similitud química y estructural entre los distintos organismos. Sin embargo, los anticuerpos anti-ADN son un razgo característico de enfermedades autoinmunes como el Lupus Eritematoso Sistémico. El anticuerpo monoclonal anti-ADN ED-10 fue aislado en nuestro laboratorio a partir de la inmunización de ratones normales, con un complejo formado por el domino carboxilo terminal del factor de transcripción E2 (E2c) del virus de papiloma humano cepa 16 (HPV16) unido a su oligonucleótido blanco. En este trabajo de tesis se describe el mecanismo de interacción de ED-10 con el ADN, el primer complejo entre un anticuerpo monoclonal y el ADN que lo generó, a través de una caracterización estructural, termodinámica y cinética. Se determinó que el anticuerpo monoclonal ED-10 reconoce solamente una de las hebras del ADN doble cadena utilizado en el complejo inmunogénico. Por otra parte, se cristalizó el fragmento Fab de este anticuerpo formando un complejo con ADN inmunógeno, siendo el primer complejo anticuerpo:ADN genuino descripto al detalle atómico a la fecha. Se realizó la caracterización termodinámica y cinética de la interacción de ED-10 con el ADN inmunógeno y con oligonucleótidos de poli-Timidina. Los primeros experimentos de calorimetría demostraron que la interacción ED-10-ADN esta entálpicamente dirigida, tiene una componente entrópica desfavorable y un cambio de capacidad calorífica negativo. Los estudios cinéticos demostraron que, la asociación entre ED-10 y el ADN presenta solo una fase cinética, con una constante de asociación aproximándose al límite de velocidad descripta para interacciones anticuerpo:antígeno. La presencia de una constante de disociación cinética extremadamente lenta resultó determinante en la formación de este complejo tan estable. Por último, se demostró que ED-10 posee actividad nucleasa, aparentemete no específica, degradando ADN doble cadena tanto en forma lineal como circular.

Descripción: El estudio de la condición nutricional de las larvas de peces permite evaluar individualmente el estado fisiológico de los ejemplares y detectar así áreas de cría favorables para la supervivencia y el crecimiento larval. En el presente trabajo se emplearon técnicas morfométricas, histológicas y bioquímicas para determinar la condición nutricional de larvas de anchoíta, Engraulis anchoita, recolectadas en el mar. Los resultados obtenidos fueron complementados con los datos oceanográficos y las abundancias de diferentes componentes del plancton, tanto predadores como presas de las larvas de anchoíta. Se ha observado que los factores que determinan la distribución de las larvas de esta especie serían principalmente de naturaleza físico-química. Si bien no se encontraron diferencias significativas entre áreas, la condición nutricional fue algo mejor en las zonas caracterizadas por aguas de mezcla dentro las estructuras frontales presentes en el área de estudio. Por otra parte, la condición nutricional se vería favorecida durante las estaciones del año en las que no se observan altas densidades larvales. Probablemente las condiciones sean propicias para el crecimiento larval durante todo el año y las densidades bajas o intermedias de larvas de peces permitan a las larvas de anchoíta evitar o reducir la competencia intra e interespecífica por el alimento. Por otra parte, muy pocas larvas presentaron valores bajos de condición nutricional, esto podría indicar que E. anchoita encuentra durante todo el año en la zona estudiada las condiciones ambientales adecuadas para su supervivencia y crecimiento larval.

Descripción: Levodopa y pramipexol son drogas de uso frecuente en el tratamiento de la enfermedadde Parkinson. Levodopa es el fármaco más efectivo para aliviar las deficiencias motoraspero en la mayoría de los casos induce disquinesias (movimientos involuntariosanormales). Pramipexol ha sido relacionado con efectos neuroprotectores y con unamenor inducción de disquinesias. Sin embargo, su eficacia disminuye a medida queprogresa la enfermedad. Con el objetivo de analizar si estas diferencias se reflejan anivel de la expresión de genes, inyectamos ratas con 6-hidroxidopamina en el estriado ycaracterizamos un modelo de lesión moderada de la vía nigroestriatal. Luego de lacirugía los animales fueron tratados con levodopa o pramipexol, en dosis queprodujeron un beneficio terapéutico similar, determinado como la disminución de laaquinesia, inducida por la lesión, de la pata delantera contralateral al hemisferiolesionado. Un grupo control recibió vehículo. Mediante la tecnología de microarreglosde ADN analizamos 3 tandas independientes de animales a fin de comparar los cambiosen la expresión de genes inducidos por los tratamientos de los grupos: normal/vehículo,lesionado/vehículo, lesionado/levodopa, y lesionado/pramipexol. Encontramos que eltratamiento crónico con levodopa y pramipexol indujo cambios en la expresión denumerosos genes, demostrando que, además de las diferencias observadas en el perfilfarmacológico y en los efectos clínicos (tanto anti-parkinsonianos como adversos), estasdrogas también inducen importantes diferencias a nivel de la expresión génica. Laexploración de los genes expresados diferencialmente permitió elaborar nuevashipótesis, siendo éste el valor principal del análisis masivo de genes.

Descripción: Las células madre mesenquimales derivadas de células madre pluripotentes inducidas (CMM-DP) constituyen una alternativa interesante a las células madre mesenquimales clásicas en medicina regenerativa. Sus propiedades terapéuticas, tales como multipotencialidad y capacidad inmunomoduladora se deben tanto a la liberación de factores solubles (citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento), como a la secreción de vesículas extracelulares. Los exosomas son vesículas extracelulares pequeñas con tamaños que rondan entre los 50 y 120 nm, que se originan en la vía endocítica y contienen lípidos, proteínas y ARN que reflejan el tipo celular que les dio origen y su estado fisiológico. Diversas investigaciones han demostrado que los exosomas participan en la comunicación intercelular a través de un fenómeno conocido como bystander effect. Mediante este efecto una célula con fenotipo normal adquiere un fenotipo alterado al recibir señales secretadas por la célula afectada por un agente estresante. Este mecanismo de comunicación podría ser una estrategia para desencadenar una respuesta global y coordinada para hacer frente a una perturbación a la homeostasis celular. En particular, la respuesta al daño al ADN (DDR del inglés Damage Response) causada ante la exposición a radiación modula la secreción de exosomas en distintos modelos experimentales. En este trabajo investigamos la implicancia del estrés genómico y la activación de la DDR causado por irradiación UV-C en la secreción, el contenido y el efecto biológico de los exosomas derivados de CMM-DP. Desarrollamos un sistema experimental que permitió inducir estrés genómico en las CMM-DP, mediante la irradiación con tres intensidades de UV-C (254 nm, 0,001 J/cm2, 0,01 J/cm2 y 0,1J/cm2). Evaluamos la activación de la DDR mediante la expresión y el análisis de la ubicación subcelular de p53 y la fosforilación H2AX, observando que la dinámica de respuesta al daño es dosis dependiente. Por otro lado, determinamos que la expresión de genes involucrados tanto en la vía endosomal como en la síntesis de exosomas, no se ven alterados en CMM-DP bajo estrés genómico en nuestro sistema experimental. Para obtener una muestra de exosomas libre de contaminantes proteicos, en el laboratorio pusimos a punto una nueva metodología de aislamiento de vesículas extracelulares basada en la cromatografía de exclusión molecular. A partir del aislamiento de exosomas de CMM-DP bajo estrés genómico y su cuantificación mediante Tunable Resistive Pulse Sensing, observamos que la irradiación no produjo cambios en la cantidad de vesículas secretadas. Sin embargo, los exosomas provenientes de células irradiadas no mostraron las mismas propiedades pro migratorias que son típicas de los exosomas de CMM-DP no irradiadas sobre células blanco. Por último, un análisis proteómico semicuantitativo del contenido exosomal demostró que la activación de DDR causada por UV-C produce la formación de exosomas con cargo alterado, sobrerrepresentando proteínas con propiedades inhibitorias de la migración resultando en un repertorio menos estromal. Nuestros resultados demuestran que los efectos de la irradiación UV-C se traducen en una modulación del contenido de los exosomas de CMM-DP, generando un cambio en su efecto biológico, disminuyendo la migración celular, y por lo tanto sus propiedades regenerativas.

Descripción: Para comprender los fenómenos involucrados en la evolución de las especies es importante estudiar los patrones de variación geográfica de los atributos genéticos y fenotípicos de las poblaciones. El presente trabajo analiza la estructura genética y la variación fenotípica en el pez marino, Eleginops maclovinus (róbalo), una especie endémica del sur de Sudamérica que constituye uno de los recursos marinos costeros de mayor importancia socioeconómica de la región. El estudio genético se realizó con individuos colectados a lo largo de casi todo el rango latitudinal de la especie en la costa atlántica y pacífica. Se obtuvieron secuencias parciales del gen mitocondrial citocromo b de un total de 261 individuos provenientes de 9 localidades y también se analizaron 9 loci de microsatélites en 239 individuos provenientes de 5 localidades. El estudio de la variación fenotípica se realizó mediante morfometría geométrica en 140 individuos provenientes de 4 localidades ubicadas a lo largo de la costa atlántica. El ADN mitocondrial reveló un patrón general de baja estructuración poblacional y una clara señal de expansión demográfica ocurrida, probablemente, durante el Pleistoceno Medio. El análisis de microsatélites sugirió la existencia de dos grupos genéticos, uno principalmente de origen pacífico y otro atlántico. Considerando ambos tipos de marcadores fue posible modelar la historia de la especie a lo largo de diferentes ciclos glaciares. El estudio fenotípico permitió discriminar todas las poblaciones estudiadas. Futuros análisis serán necesarios para establecer la importancia relativa de los factores ambientales y genéticos en la variación fenotípica.

Descripción: Fil: Pellegrotti, Jesica Vanesa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Existen diversos procesos sociales, políticos y culturales de las poblaciones humanasque pueden dejar huellas en su acervo génico. En consecuencia, el análisis del ADN constituyeuna herramienta complementaria para su estudio. En esta tesis se abordaron distintos aspectosde las poblaciones que habitaron el actual Noroeste Argentino (NOA) y el resto del Área Centrosur Andina en tiempos prehispánicos a partir del análisis del ADN antiguo, es decir, delmaterial genético extraído de restos óseos. Utilizando al ADN mitocondrial como el principalmarcador y a fin de contribuir al estudio de la dinámica y el estilo de vida de estas poblaciones,se emplearon dos escalas de análisis: local y regional. A nivel local, en la Quebrada de Humahuaca se intentó establecer: a) la procedencia delos habitantes de un sitio del Período Incaico, hallándose evidencias del origen local de unaparte de la población, que habría sido probablemente relocalizada desde otros pobladoscercanos; y b) las relaciones de parentesco entre individuos de dos asentamientos,obteniéndose indicios de que aquellos enterrados en un mismo recinto o unidad habitacionalse encontraban emparentados. En una escala de análisis regional, se evaluó la variabilidad y la diferenciación genéticaentre distintas poblaciones prehispánicas del Área Centrosur Andina. Por un lado, no seencontraron evidencias de diferenciación entre poblaciones como las de los actuales territoriosdel NOA, norte de Chile y Bolivia. Por el otro, en líneas generales se observó la existencia deestructuración considerando toda el área analizada, sobre la que habrían incidido factorescomo diferencias temporales y las características particulares de cada población en cuanto a suinteracción con otras. Los resultados obtenidos en este trabajo han permitido poner a prueba hipótesisvinculadas al estilo de vida, los procesos migratorios y las interacciones entre distintos grupos,contribuyendo especialmente al conocimiento de las dinámicas poblacionales prehispánicas del NOA y del resto del Área Centrosur Andina.

Descripción: Un desafío importante para el desarrollo de vacunas frente a infecciones adquiridas por víade mucosas es poder inducir una respuesta inmune local, con el fin de evitar la diseminación delpatógeno al resto del organismo. Actualmente, el esquema de inmunización utilizado ampliamenteen ensayos clínicos para HIV, y otros patógenos para los cuales se requiere inducir una respuestainmune celular específica, es el denominado “prime-boost” que consiste en la utilización de distintosvectores vacunales durante la inmunización tales como los vectores de ADN recombinantes yaquellos basados en el virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA). En este trabajo de tesis doctoral se utilizó un esquema ADN-prime/MVA-boost por ruta demucosas, donde ambos vectores expresan la glicoproteína de envoltura de HIV y se analizó elefecto adyuvante de ADN-IL-12 con la subunidad B de la toxina colérica (CTB) en ratones BALB/ccon el fin de potenciar la respuesta inmune específica frente al HIV a nivel sistémico y de la mucosadel tracto genital. Los resultados obtenidos demostraron que esta combinación de adyuvantesmejoró la respuesta inmune celular no sólo a nivel sistémico, sino también en ganglios drenantes dela mucosa genito-rectal, y más importante aún, en el tracto genital, observándose un incremento enla magnitud, amplitud y calidad de la respuesta. En conclusión, la combinación de los adyuvantes ADN-IL-12 + CTB podría serpotencialmente utilizada como adyuvantes de mucosas en vacunas ADN/MVA, no sólo paraantígenos de HIV sino también para otras enfermedades infecciosas con impacto en mucosas.

Descripción: Más de 50 tipos de papilomavirus humanos (HPV) infectan epitelio mucoso causando una variedad de lesiones benignas y malignas. El dominio C-terminal de la proteína E2 de HPV (E2C) discrimina entre cuatro sitios de ADN altamente similares regulando el ciclo de vida del virus vía la activación de la replicación y la activación y/o represión de la transcripción. Con el fin de tratar de entender la naturaleza de la interacción entre E2C y ADN, realizamos un análisis detallado del complejo utilizando herramientas bioinformáticas y el contenido de información en las secuencias proteicas y nucleotídicas y usando técnicas biofísicas, proteínas E2C recombinantes y sitios sintéticos de ADN específicos y no-específicos. Antes de estudiar el rol de la interacción E2C-ADN, nos focalizamos en el proceso de polimerización no-funcional de E2C dado que su desarrollo es reprimido por la presencia de ADN específico. Inducida por temperatura, la polimerización de E2C se desencadena mediante la formación de un núcleo estructurado y finaliza en un paisaje morfológico de oligómeros solubles con propiedades amiloideas. El estudio computacional de la interacción E2-ADN de todos los tipos de HPV mucosos indica que las proteínas E2 de distintos tipos poseen propiedades de discriminación de ADN similares. Las diferencias en la interacción E2-ADN se encuentran principalmente en la secuencia de ADN específico, en acuerdo con el análisis de la unión de E2C a diferentes sitios mediante titulaciones isotérmicas de calorimetría. Basado solamente en la secuencia de ADN, logramos predecir diferencias en la energía de unión las cuales se ordenaron en seis grupos de afinidades discretas. Ciertas jerarquías de afinidades como también distancias entre sitios y presencia de sitios de metilación se encontraron estadísticamente asociados con tipos de HPV propensos a ser malignos. Estudiamos la estabilidad y la propiedad de discriminación de secuencia de cinco proteínas E2C homólogas de identidad de secuencia proteica en el rango 44% al 77%. La desnaturalización al equilibrio y la cinética de desplegado en cloruro de guanidinio mostró que todos los dominios son homodímeros estables que se desnaturalizan vía un mecanismo de dos estados. Medimos la unión a distintos sitios de ADN y confirmamos que el mecanismo de unión para todos los complejos es el mismo en base a una genuina compensación entropico-entálpica. Nuestros resultados muestran que la inusual estructura de barril-beta de E2C puede acomodarse a numerosas mutaciones manteniendo las propiedades cruciales de conformación y función. Pero la unión cooperativa a sitios adyacentes de ADN mostró que los componentes entálpicos-entrópicos de la reacción como la deformación del ADN puede divergir entre distintas homólogas en acuerdo con un fuerte acoplamiento entre la dinámica global de la proteína y el reconocimiento del ADN.

Descripción: El gen de susceptibilidad al cáncer de mama (BRCA1) es un supresor tumoral. Las mutaciones germinales en este gen confieren predisposición al cáncer de mama, ovario y están asociadas con una mayor agresividad del cáncer de próstata (PCa). Varias evidencias demuestran que BRCA1 tiene numerosas funciones, sin embargo, no se conoce aún cuál es el rol de este supresor tumoral en el PCa. En esta tesis determinamos por primera vez que BRCA1 regula directamente su propia transcripción y la de otros genes que intervienen en la respuesta al daño en el ADN, el ciclo celular y la apoptosis en el PCa. Establecimos un mecanismo por el cual la regulación de la transcripción de BRCA1 es una característica fundamental en la modulación de la sensibilidad a los agentes genotóxicos. Comprobamos que BRCA1 forma un complejo multriproteico integrado por E2F1 y Rb, que se asocia a su promotor autorreprimiéndolo. Luego del estrés genotóxico generado por doxorrubicina, BRCA1 se libera activando su transcripción y asociándose a los promotores de otros genes, entre ellos GADD153. Así, BRCA1 induce la transcripción de GADD153 aumentando la apoptosis y el arresto del ciclo celular. Además, generamos un modelo in vivo de xenotransplantes de PCa que poseen disminuída la expresión de BRCA1. Con este modelo demostramos que la disminución de la expresión de BRCA1 aumenta el desarrollo tumoral de próstata. Considerando que los agentes quimioterapéuticos utilizados comúnmente en el tratamiento del cáncer causan daño en el ADN, en este trabajo proponemos que el PCa asociado a mutaciones en BRCA1 presentaría una respuesta alterada a la quimioterapia, representando un nuevo subgrupo de pacientes que podrían requerir terapias alternativas. Los tumores de próstata avanzados se tornan rápidamente resistentes a todos los agentes quimioterapéuticos actualmente utilizados. Así, el entendimiento de los mecanismos de resistencia en tumores con mutaciones en BRCA1 ayudará a desarrollar mejores opciones de tratamiento, como por ejemplo, terapias personalizadas para el PCa.

Descripción: En este trabajo de tesis se presenta un estudio a nivel interespecífico y otro a nivel intraespecífico, en dos grupos de gorgojos perjudiciales para la agricultura en Argentina y América; analizando, en ambos casos, la variabilidad a nivel de secuencias de ADN mitocondrial desde una perspectiva filogenética. En el primer caso, se realizó un estudio filogenético en el complejo de especies Pantomorus–Naupactus. Los resultados mostraron que las especies sudamericanas asignadas a Pantomorus constituyen un grupo polifilético basado en caracteres morfológicos convergentes, como la reducción de los hombros y alas metatorácicas. Otros géneros del complejo como Aramigus, Asynonychus, Eurymetopus y Graphognathus serían linajes monofiléticos que han acumulado una gran cantidad de autapomorfías, y se han diferenciado a partir del grupo parafilético Naupactus. En el segundo caso, se llevó a cabo un estudio filogeográfico, a nivel poblacional, en la especie Anthonomus grandis, conocida como “picudo del algodonero”, a fin de establecer el origen de las poblaciones sudamericanas de la plaga. Se demostró que las muestras de picudos procedentes de áreas algodoneras de Argentina y Paraguay presentan baja o nula variabilidad de haplotipos mitocondriales. Por el contrario, las muestras del Parque Nacional Iguazú, una zona de vegetación nativa protegida, y de México, considerado país de origen de la especie, presentaron características típicas de poblaciones ancestrales, como alta variabilidad y diferenciación genética de haplotipos. Estos resultados, analizados a la luz de evidencias biogeográficas, permitieron proponer que la especie habría estado ampliamente distribuida en el continente Americano probablemente desde el Plio- Pleistoceno, y que su asociación con algunas especies de malváceas de los géneros Gossypium y Cienfuegosia sería probablemente muy antigua.

Descripción: La cepa 16 de HPV es responsable del 50% de los casos de cáncer de cuello de útero asociado a Papilomavirus. La proteína E2 es el único factor de transcripción viral y posee cuatro o más sitios de unión en su genoma, cuya interacción diferencial está asociada a las distintas etapas del ciclo viral. Para cumplir su función regulatoria, E2 debe discriminar entre los distintos sitios específicos, a través de diferencias mínimas en la afinidad, en presencia de un enorme exceso de sitios no específicos , en el contexto del genoma. Con el objetivo de comprender las bases estructurales de esta discriminación, nos propusimos estudiar la estructura de la proteína libre en solución y su complejo con ADN, así como caracterizar equilibrios conformacionales de ambos ligandos. Se realizó principalmente mediante RMN que, además de proporcionar estructuras con detalle atómico, permite el estudio de la dinámica, fundamental en procesos de reconocimiento de este tipo. En la presente tesis se describe la estructura de E2C de HPV-16, cuya topología no difiere de la de otras proteínas de su familia. E2C presenta una estructura plástica, con una gran exposición al solvente de su esqueleto proteico, y un loop flexible en la interfaz con el ADN. La estructura no se modifica significativamente al unir un ADN, pero sí lo hace su dinámica y su exposición al solvente que resultan muy disminuidas. El loop β2−β3, por otro lado, permanece flexible aun encontrándose a corta distancia del ADN sugiriendo una importancia de esta flexibilidad en la interacción. La ausencia de cambio estructural entre la proteína libre y unida, sugiere un papel activo de los sitios de unión de ADN en la discriminación de afinidades. En solución estos sitios se presentan precurvados y sensibles al efecto del magnesio o la temperatura.Independientemente de las variaciones conformacionales de los sitios libres, una vez unidos adoptan una conformación similar y complementaria a una región de E2C. Sin embargo, se mantendrían pequeñas diferencias entre los distintos complejos. El uso de oligonucleótidos de distintas longitudes permitió la identificación de una interacción novedosa que, junto con otras características propias de E2C que se describen, explicaría la alta actividad regulatoria de esta proteína.