Descripción: Fil: Kornblihtt, Alberto Rodolfo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: En este trabajo se caracterizó la adenilil ciclasa TczAC. Se determinó que el gen que codifica para esta enzima se encuentra altamente conservado con los genes de adenilil ciclasas identificados en otros tripanosomátidos, es parte de una familia multigénica y se expresa en todos los estadios del ciclo de vida de T. cruzi. Se determinó que el producto de este gen es una enzima funcional capaz de complementar una cepa de levaduras carente de actividad adenilil ciclasa. Esta enzima es específica para AMPc, presenta una mayor actividad en presencia de Mn+2 que de Mg+2 y es inhibida por Zn+2 y el inhibidor del sitio P, 2'-deoxy-3'AMP. Por otro lado, el Ca+2 estimula la actividad de la misma manera independiente de calmodulina. Utilizando la técnica de doble híbrido en levaduras se demostró que TczAC dimeriza a través de su dominio catalítico y se identificaron 13 clones capaces de interaccionar específicamente con la misma. En particular se analizó la interacción de TczAC con el clon correspondiente a la proteína de flagelo paraflagellar rod. Asimismo, TczAC fire expresada en una cepa mutante de levaduras S. pombe. Los resultados obtenidos con estos experimentos sugieren que este sistema de expresión podría ser de gran utilidad para la búsqueda de inhibidores específicos. Por otra parte, se identificó y caracterizó el gen TczPDE que codifica para la primer fosfodiesterasa de AMPc de T. cruzi. Se determinó que este gen es parte de una familia multigénica y codifica para una proteína que presenta un posible péptido señal, dos dominios GAF de unión a GMPc y un dominio catalítico altamente conservado. La funcionalidad de esta proteína se confirmó por ensayos de complementación en levaduras carentes de actividad fosfodiesterasa. En dichas levaduras TczPDE se encontró asociada a la fracción particulada, mostró una alta afinidad por el AMPc y no fue capaz de hidrolizar GMPc. Por ensayos de Western blot se confirmó la asociación de TczPDE a la membrana de las levaduras y se observó que esta se encuentra fuertemente asociada a la misma. La localización subcelular de TczPDE en T. cruzi se estudió por fraccionamiento subcelular e inmunolocalización. Estos experimentos demostraron que TczPDE se encuentra localizada en la membrana plasmática del parásito y concentrada en el flagelo.

Descripción: Los receptores acoplados a proteína G (GPCRs) son los mediadores de las respuestas celulares auna gran cantidad de estímulos, así como también el blanco de muchas drogas terapéuticas. Elrol clásico de los GPCRs es acoplar la unión de ligandos a la activación de proteínas Gheterotriméricas, que a su vez regulan a múltiples proteínas efectoras. Recientemente se hademostrado que los modos de señalización de los GPCR son mucho más complejos,involucrando también mecanismos independientes de proteínas G y señalización dependiente dela internalización del receptor. La hormona liberadora de corticotropina (CRH) ejerce un rol clave en la respuesta integrada alestrés. Además de regular la activación del eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA), CRH estáampliamente distribuida en el sistema nervioso central, donde funciona como unneuromodulador, integrando aspectos comportamentales y afectivos de la respuesta a estrés. Seha demostrado que la desregulación de la acción de CRH a través de su receptor de alta afinidad, CRHR1, se encuentra involucrada en el desarrollo de estadios patológicos asociados al estréscomo ansiedad y depresión. CRHR1 es un GPCR de clase B, que al activarse principalmente se acopla a proteína Gs y llevaa un aumento del segundo mensajero AMP cíclico (cAMP) y la activación de múltiples vías deseñalización. Es de particular interés la fosforilación de la MAPK ERK1/2, que induce latranscripción de Pomc para activar el eje HPA en corticotrofos, y se dispara en estructuras delcerebro asociadas a aspectos comportamentales de la respuesta a estrés frente a la estimulacióncon CRH. Habíamos descripto previamente que CRHR1 activa mecanismos de señalización dependientesde proteína G y otros dependientes de la endocitosis del receptor. Estos dos componentes derespuesta pueden evidenciarse como dos fases diferentes de activación de ERK1/2 en la líneacelular hipocampal murina HT22 transfectada establemente con CRHR1 (HT22-CRHR1). Eneste trabajo, nos focalizamos en la respuesta de cAMP mediada por CRHR1, utilizando métodosclásicos de biología molecular en combinación con biosensores basados en la transferencia deenergía resonante de Förster (FRET) para estudiar por visualización dinámica de célula únicalos mecanismos de señalización de CRH. En primer lugar demostramos que al estimular CRHR1, el aumento en los niveles de cAMP nosólo está mediado por las adenilil ciclasas transmembrana (tmACs) sino también por una adenilil ciclasa soluble (sAC) en las células HT22-CRHR1. sAC es una fuente atípica de cAMPya que es insensible a proteína G y es regulada por calcio y bicarbonato. Además, se hareportado que sAC está presente en distintas localizaciones subcelulares, formandomicrodominios de señalización. La respuesta de cAMP a CRH también se encontró mediadatanto por tmAC como por sAC en la línea celular derivada de corticotrofos AtT20, pero no asíen las células 3T3L1-CRHR1. Sin embargo, observamos que tanto en células HT22-CRHR1como en AtT20, sAC no participa en la señalización de otros ligandos de GPCRs, comoisoproterenol o PACAP38, respectivamente. Estos resultados indican que el rol de sAC en latransducción de señales de un GPCR depende del contexto celular y del receptor involucrado. La estimulación con CRH genera un aumento en los niveles de calcio intracelular, y al bloquearla respuesta de calcio se observó un patrón de cAMP y ERK1/2 en respuesta a CRH similar alque se obtiene al bloquear sAC. Esto sugiere que calcio es el activador de sAC río abajo de CRHR1. Luego, nos propusimos caracterizar si ambas fuentes de cAMP contribuyen a un pool común decAMP o si pueden identificarse roles particulares para cada adenilil ciclasa en la respuesta. Observamos que tanto tmACs como sAC participan en la fase aguda de activación de ERK1/2,pero que en la fase sostenida de fosfo-ERK1/2, dependiente de la internalización de CRHR1,sólo sAC está involucrada. Más aún, demostramos que el CRHR1 continúa generando cAMPdesde estaciones endocíticas, y que es sAC la responsable de esta producción una vezinternalizado CRHR1. En conclusión, a través de la caracterización de los mecanismos moleculares activados por CRHR1, se hallaron nuevas evidencias que refuerzan el modelo emergente de señalización por GPCR en el que la respuesta de cAMP no ocurre exclusivamente a nivel de la membranaplasmática y donde sAC representa una fuente alternativa de cAMP regulada por GPCRs.

Descripción: Phytomonas es un género de la familia Trypanosomatidae que parasita plantas. Si bien muchos de sus componentes no provocan daño a sus respectivos huéspedes, otros en cambio, son responsables de afecciones que acarrean pérdidas económicas. Tal es el caso de las palmas aceiteras en paises como Colombia, Venezuela y Guyana, el café en Brasil y algunos reportes de daño en algunos frutos como el tomate, tanto en Brasil como en España (Granada). La especie objeto de este estudio no es patogénica y corresponde a la aislada de Euphorbia characias (planta laticífera). Contiene una adenilil ciclasa unida a membranas y un sistema transductor de señales de proteínas G, del tipo Gs y Gi. Estas proteínas afectan la actividad de la adenilil ciclasa y posiblemente participan en un mecanismo que involucra a una señal de tipo hormonal. Si bien no existen evidencias directas de la existencia de un receptor, la proteína del tipo Gi es capaz de interaccionar con el peptido tóxico Mastoparán, que mimetiza la acción de los receptores acoplados a proteínas G. Se analizaron distintas fracciones subcelulares para caracterizar una actividad de quinasa de proteínas modulada por AMPc (PKA). Las fracciones subcelulares purificadas por cromatografía en DEAE-celulosa mostraton dos picos de actividad enzimática frente a histona IIA y a kémptido como sustratos. Usando un anticuerpo policlonal contra la subunidad catalítica de PKA de corazón bovino, se inmunoprecipitó un polipéptido con un peso molecular de 40 kDa. Estos datos en conjunto sugieren la presencia de dos tipos de actividad de quinasa de proteína de pendiente de AMPc (tipo I y 11). Experimentos in vivo con toxina del cólera, dieron como resultado un arresto del ciclo celular del parásito, poniendo en evidencia un efecto ambiguo de la vía de señalización mediada por AMPc, que requerirá de futuros estudios para su profundización. Datos preliminares, aunque incompletos nos dan un primer indicio de la conservación de este tipo de vía en una cepa patógena (responsable del Hartrot de las palmas aceiteras). La extrapolación de los resultados anteriores, nos permitirán diseñar aquellos experimentos tendientes a tratar de develar dónde reside la diferencia de patogenicidad de ambas cepas.