Descripción: Las leucemias agudas constituyen la neoplasia más frecuente en pacientes en edad pediátrica, y dentro de ellas, las Leucemias Linfoblásticas Agudas (LLA) representan aproximadamente el 75% de los casos. Actualmente, el 75% de los niños con LLA de diagnóstico inicial logran curarse con quimioterapia convencional, pero el 25% de los mismos presentarán una reaparición de la enfermedad, llamada recaída. En los últimos años, se han centrado los esfuerzos en identificar factores pronóstico que permitan adaptar la intensidad del tratamiento quimioterápico de acuerdo al riesgo individual de cada paciente. De esta manera, los pacientes con mayor riesgo de presentar recaídas reciben un tratamiento más intenso, mientras que los pacientes con menor riesgo de recaer reciben un tratamiento de menor intensidad. Esta adecuación del tratamiento permite, por un lado, disminuir la probabilidad de recaídas en los pacientes de mayor riesgo, y en los pacientes de menor riesgo, evitar la administración de tratamiento más agresivo, y por lo tanto de la potencial toxicidad aguda y secuelas, lo cual redunda a la vez en una mejor calidad de vida a mediano y largo plazo. Uno de los factores pronóstico independiente de mayor importancia lo constituye la enfermedad mínima residual (EMR), que permite evaluar la respuesta de la enfermedad al tratamiento instituido. El concepto de EMR hace alusión a la detección de células leucémicas que se encuentran en tan bajos niveles que no son detectables por los métodos estándares de estudio de la médula ósea ni por los estudios citogenéticos. Estos bajos niveles de enfermedad remanente, detectables sólo con métodos altamente sensibles, son los responsables de las posteriores recaídas de la enfermedad. Los métodos que cuentan con la sensibilidad adecuada para realizar la determinación de EMR son la citometría de flujo multiparamétrica (CFM) y las técnicas de diagnóstico molecular. Con respecto a las determinaciones por diagnóstico molecular, las técnicas descriptas a ser aplicadas para LLA son: cuantificación por PCR en tiempo real del transcripto de fusión BCR-ABL1, en pacientes LLA-Phi+, y de los rearreglos génicos de inmunoglobulinas (Ig) y receptores de linfocitos T (TCR). La mayoría de los protocolos de tratamiento internacionales actuales utilizan la EMR mediante rearreglos clonales de Ig/TCR para la estratificación de los pacientes, considerando a esta metodología como la técnica gold standard. Determinación de EMR en LLA pediátrica mediante PCR cuantitativa. Utilidad clínica. Es importante tener en cuenta que la aplicabilidad de la caracterización de los rearreglos Ig/TCR no se limita sólo a la determinación de la EMR. Como ya ha sido comentado, existe un porcentaje de niños con LLA que presentarán recaída de la enfermedad. En la mayoría de los casos, la reaparición de células leucémicas corresponde a una verdadera recaída, sin embargo, es necesario excluir la posibilidad de que se trate de una segunda enfermedad maligna. Además, se han descripto en la literatura casos inusuales de conversión de linaje de las células leucémicas durante el curso de la enfermedad llamados switches de linaje. El análisis comparativo entre los rearreglos clonales encontrados al diagnóstico y en la sospecha de recaída de la enfermedad permite diferenciar entre recaída de la LLA, switch de linaje y segunda enfermedad maligna, con consecuencias en la elección terapéutica. El presente trabajo de tesis tiene entre sus objetivos describir la incidencia y estabilidad clonal de rearreglos de Ig/TCR, estudiar su utilización como marcadores de identidad clonal, analizar su aplicabilidad para la determinación de EMR, correlacionar los resultados de la EMR mediante Ig/TCR con otras metodologías (CFM y BCR-ABL1 en LLA-Phi+); y evaluar el impacto pronóstico de la EMR mediante Ig/TCR en nuestra población de pacientes pediátricos con LLA. La población de estudio estuvo constituida por los pacientes pediátricos con diagnóstico de LLA de los centros integrantes de la Sociedad Argentina de Hemato-Oncología Pediátrica. Fueron estudiados 769 pacientes para la descripción de incidencias de rearreglos Ig/TCR, 455 pacientes para EMR y 39 pacientes para estudios de identidad clonal. En cuanto a los resultados del presente trabajo de tesis, el estudio de incidencia de rearreglos Ig/TCR permitió definir el perfil de reordenamientos génicos más frecuentes en nuestra población de pacientes, a fin de establecer los rearreglos de elección como blancos de seguimiento para EMR. En el 96% de los pacientes fue posible caracterizar rearreglos de Ig/TCR detectando un total de 2506 reordenamientos. Además, la comparación de rearreglos Ig/TCR entre muestras de diagnóstico inicial de LLA y de la recaída permitieron identificar 24 recaídas reales, 6 switches de linaje y 9 posibles segundas enfermedades malignas. Determinación de EMR en LLA pediátrica mediante PCR cuantitativa. Utilidad clínica. La EMR pudo ser aplicada en forma exitosa en el 89% de los casos estudiados, permitiendo identificar grupos de pacientes con pronósticos diferentes. Para ello, fueron diseñados en total 675 primers-paciente-específicos con sensibilidad adecuada. De la comparación de métodos pudimos observar una excelente correlación de los valores de EMR entre rearreglos de Ig/TCR y los hallados por CFM, con un 92% de resultados concordantes al día 33 y 97% al día 78 de tratamiento. Los mismos resultados no fueron encontrados al comparar la EMR mediante reordenamientos Ig/TCR y la cuantificación del transcripto BCR-ABL1 en pacientes LLAPhi+, donde se observaron resultados concordantes en el 46% de los casos. Los resultados que forman parte del presente trabajo de tesis constituyen el primer estudio realizado en nuestro país sobre la detección y caracterización de rearreglos de inmunoglobulinas y receptores de linfocitos T, así como la determinación de la Enfermedad Mínima Residual en número muy significativo de pacientes, que ha permitido confirmar el valor de la misma como un importante factor pronóstico en LLA pediátrica.

Descripción: En este trabajo de tesis se abordó el desarrollo y aplicación de tres materiales novedosos en el área de la química analítica y la remediación del medio ambiente. En primera instancia se desarrolló un biosensor con una fase de reconocimiento molecular altamente funcionalizada derivada de epóxido para contener la enzima. La etapa clave en la obtención del material modificador de la superficie del electrodo fue la polimerización radicalaria de la anilina (ANI) mediada por la enzima peroxidasa de soja (SBP) usando peróxido de hidrógeno como oxidante. Esta reacción se realizó in-situ sobre la superficie de un electrodo de carbón vítreo y juntamente con la copolimerización de ácido acrílico (AA) y etilenglicol diglicidil éter (EGDE), que cumplieron un rol estructural formando un entorno propicio para mantener la enzima activa sobre la superficie del electrodo y contribuir a la estabilidad del conjunto. La formación tanto de polianilina (PANI) como de poliacrilatos y aductos de EGDE fue verificada por espectroscopía UV-Visible y ATR-FTIR. SBP no sólo fue usada durante la síntesis del polímero conductor, sino que también fue el elemento de reconocimiento en el sensor electroquímico formado. El modo de detección elegido fue la amperometría en flujo, dando una buena una respuesta con elevada relación señal/ruido, buena precisión y selectividad. Para evaluar la aplicabilidad del sensor se analizó el contenido de peróxido de hidrógeno en una muestra comercial de blanqueador dental tanto por adición de estándar como por estándar externo, sin que hubiera diferencia significativa. En segundo lugar, se co-inmovilizaron complejos formados entre un nuevo material oligomérico y Cu junto con SBP para combinar sus capacidades catalíticas. El nuevo 156 material presentó grupos funcionales similares a otros oligómeros desarrollados previamente por el grupo de investigación, corroborado por FTIR, y con una capacidad similar de captación de iones metálicos. La comparación del perfil cromatográfico obtenido en la separación de ambos oligómeros por una columna de exclusión molecular y de sus electroferogramas mostró que los materiales obtenidos eran heterogéneos y presentaban una mezcla de productos similares, pero con una proporción diferente de las distintas poblaciones. Los nuevos oligómeros sintetizados sin peróxido de benzoilo conservaron la aplicabilidad de la variante precedente, pero presentaron la ventaja adicional de reducir el tiempo de síntesis en 12hs y también de poseer una menor citotoxicidad. Se utilizó el nuevo sistema catalítico para el tratamiento de efluentes textiles, tomándose como modelo el colorante naranja de metilo (MO). El catalizador para el proceso de decoloración se formuló en esferas por gelación ionotrópica entre alginato / oligómeros y clorhidrato de polietilenimina en presencia de SBP, y se usaron Ca(II) y Cu(II) para su endurecimiento. La distribución de los distintos elementos (N ,O, Cu, Ca) fue estudiada por medio de EDAX. Se comprobó la propiedad de los complejos formados entre Cu(II) y oligómeros, por medio de EPR y medición de oxígeno disuelto, para producir especies reactivas a partir del peróxido de hidrógeno El uso de la mezcla alginato / oligómeros evitó la coagulación del oligómero con el cobre, mejorando la accesibilidad de los sitios activos y facilitando su dosificación. La co-inmovilización de la enzima SBP en las esferas con los complejos con Cu(II) dio lugar a un efecto sinérgico en el proceso oxidativo. 157 El ultimo material desarrollado en esta tesis consistió en una resina de intercambio iónico basada en la reacción entre EGDE e imidazol (IM), el primer paso en la síntesis de los oligómeros previamente mencionados. El IM se utilizó tanto como catalizador en la apertura de los grupos epóxido, así como también aportando las cargas positivas permanentes provenientes de su disustitución y necesarias para la fijación de aniones; este uso dual es una innovación en esta clase de materiales. Al igual que el material anterior se investigó su aplicabilidad en el tratamiento de efluentes textiles, esta vez buscando la adsorción del colorante azo aniónico Remazol Black (RB). Los resultados de los estudios cinéticos e isotérmicos indicaron que la adsorción se producía de forma espontánea y con una afinidad sumamente alta. También se evaluó el efecto de sales interferentes sin hallar un impacto cuantificable. Se estudió el impacto del flujo, la concentración del adsorbato y la masas de adsorbente en un sistema de lecho fijo por medio de un diseño experimental, obteniéndose datos valiosos, como una relación positiva entre el aumento del caudal y la concentración del adsorbato, para facilitar en un futuro el escalado del proceso a un nivel industrial. Los intentos por regenerar la columna luego de la adsorción de RB por medio del tratamiento con sales, ácidos y álcalis no resultaron satisfactorios. Se probó la adsorción de MO, el cual pudo ser eficientemente recuperado al lavar la columna con una solución ácida que anulaba su carga neta negativa, corroborando el mecanismo de intercambio iónico. La microscopía SEM mostró cambios estructurales en el material luego de la adsorción del RB; esto se debió al apantallamiento de las cargas positivas en el material que le otorgaban su capacidad de hinchamiento, lo que coincidió con la 158 reducción de su volumen luego del proceso de adsorción. Pese a esta estrecha unión, no se evidenciaron cambios en los grupos funcionales al estudiar el colorante adsorbido en la resina por FTIR. La caracterización estructural se completó mediante un estudio de HR-MAS NMR. Se estudiaron las propiedades térmicas mediante calorimetría diferencial y termogravimetría, por medio de los cuales se pudo apreciar una reducción de la resistencia térmica al aumentar la proporción de EGDE en la mezcla de reacción.

Descripción: Los pueblos indígenas del nordeste argentino (NEA) se hallan por lo común en estrecho contacto con la naturaleza, dependiendo de ella, en gran parte, para su subsistencia. Por lo que poseen un profundo conocimiento de las propiedades medicinales de las plantas. Este conocimiento ha sido practicado, documentado y transmitido a través de generaciones, y permitió a la industria farmacéutica desarrollar gran cantidad de fármacos. Para ello, las propiedades medicinales de las plantas deben someterse a un proceso de validación científica en términos de eficacia, seguridad y calidad. Estos tres conceptos rigen la actual terapéutica del siglo XXI inherente a cualquier fármaco convencional. Y permite que las plantas medicinales puedan intervenir en el desarrollo y avance de la medicina moderna, sirviendo como punto de partida para el desarrollo de nuevos fármacos. Determinadas plantas son utilizadas por los indígenas del NEA para el tratamiento de diversas enfermedades. Entre ellas, el uso de "tapekué", nombre vulgar de Acanthospermum australe (Loefl.) Kuntze y de ?carnicera?, nombre vulgar de Conyza bonariensis (L.) Cronquist, para la cura de infecciones de la piel, desinfección de heridas y úlceras, entre otras afecciones dérmicas. Las infecciones de piel y partes blandas (IPPB) son una razón común de consulta en los centros de atención primaria de salud. Son entidades clínicas de presentación, etiología y gravedad variables que implican una invasión microbiana de las capas de la piel y los tejidos blandos, que van desde infecciones leves hasta infecciones potencialmente mortales. Las bacterias más comunes implicadas en IPPB son Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus, mientras que las infecciones fúngicas superficiales son causadas principalmente por especies de Candida, Malassezia y dermatofitos. La mayoría de los habitantes del NEA viven en un contexto económicamente desfavorable en cuanto a sus posibilidades para acceder a los fármacos. Ante esta barrera, recurren a los conocimientos de la medicina tradicional para el tratamiento y cuidado de su salud. Este trabajo tuvo como objetivo: obtener y caracterizar el extracto acuoso, el extracto etanólico y el aceite esencial de hojas de tapekué y carnicera del NEA; determinar si los extractos y aceites esenciales no eran citotóxicos a las concentraciones necesarias para inhibir el crecimiento microbiano; evaluar su actividad inhibitoria in vitro frente a hongos y bacterias causantes de IPPB, y determinar si la interacción entre extracto-extracto y extracto-droga (droga de uso clínico) era sinérgica. La caracterización se realizó mediante: determinación del contenido de flavonoides y fenoles totales de los extractos por métodos espectrofotométricos; determinación de la composición química de los aceites esenciales por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas; y evaluación de la actividad antioxidante de los extractos y aceites esenciales en función de la capacidad reductora de hierro y la capacidad secuestradora de radicales DPPH. La toxicidad se evaluó frente a célula mononucleares de sangre periférica. La actividad inhibitoria in vitro se evaluó mediante la determinación de la CIM de acuerdo a los documentos de referencia del CLSI, con modificaciones. Y el efecto de la interacción entre los agentes antimicrobianos se evaluó por el método del tablero de ajedrez. Los extractos acuosos y etanólicos de ambas plantas mostraron la presencia de compuestos fenólicos, siendo el contenido de fenoles y flavonoides significativamente superior en los extractos etanólicos. Por otro lado, los principales componentes del aceite esencial de hojas de C. bonariensis fueron limoneno, espatulenol y ?-curcumeno. Mientras que los principales componentes del aceite esencial de hojas de A. australe fueron germacreno A, ?-cadineno y trans-cariofileno. La evaluación de la actividad antioxidante mostró que los extractos acuosos y etanólicos de ambas plantas presentaban valores significativamente superiores de actividad antioxidante en comparación con sus respectivos aceites esenciales. El ensayo de citotoxicidad evidenció que los extractos y aceites esenciales no son tóxicos a las concentraciones ensayadas para inhibir el crecimiento microbiano. De acuerdo con el criterio establecido, los extractos acuosos y etanólicos de ambas plantas fueron inactivos frente a los microorganismos ensayados. Por el contrario, el aceite esencial de tapekué mostró una fuerte actividad frente a Epidermophyton floccosum y Microsporum canis; moderada actividad frente a Malassezia globosa; baja actividad frente a Microsporum gypseum y Trichophyton tonsurans; e inactivo frente a los demás microorganismos ensayados. Por su parte, el aceite esencial de carnicera mostró una fuerte actividad frente a todos los dermatofitos y M. globosa; baja actividad frente a Malassezia furfur; e inactivo frente a los demás microorganismos. De acuerdo al método del tablero de ajedrez, la única combinación que presentó efecto sinérgico frente a Malassezia fue la combinación entre el aceite esencial de carnicera con el aceite esencial de tapekué. Las combinaciones entre ambos aceites esenciales y de cada aceite esencial con ketoconazol mostraron efectos sinérgicos frente a M. canis, M. gypseum, E. floccosum y T. tonsurans. Mientras que la mayoría de las combinaciones con terbinafina mostraron efectos de no interacción, excepto con el aceite esencial de carnicera frente a M. canis y M. gypseum, que presentó efecto sinérgico. Los resultados obtenidos proporcionan la evidencia científica que avala el uso ancestral de hojas de tapekué y carnicera para el tratamiento de las dermatofitosis y la pitiriasis versicolor, además de justificar el uso tradicional de combinaciones de plantas medicinales.

Descripción: El sistema inmune es afectado por la malnutrición haciendo que aumente la susceptibilidad a las infecciones. La malnutrición y las infecciones por nematodes gatrointestinales son enfermedades crónicas que coexisten en individuos de países en desarrollo. Dentro de los diferentes tipos de malnutrición, las deficiencias calórico-proteica y proteica (DP) poseen efectos más generalizados. La trichinellosis es una zoonosis parasitaria endémica de nuestro país en la que anualmente se registran brotes epidémicos. El ciclo de vida de T. spiralis comienza cuando un hospedador ingiere carne con el estadio infectivo (larva muscular, LM). En el estómago son liberadas las LM y al llegar a intestino éstas mudan a vermes adultos (VA). Allí los VA copulan y permanecen hasta que son expulsados por el hospedador a través de la respuesta inmune de mucosas. Las VA hembras liberan al siguiente estadio, las larvas recién nacidas (LRN; desde el día 5 hasta el 13 post infección en el modelo murino). Una vez liberadas, las LRN pasan al sistema linfático y al torrente sanguíneo donde se diseminan por todo el organismo, pasando por diferentes órganos hasta alcanzar el músculo esquelético. Al llegar a su destino, cada una de ellas penetra una célula muscular y finalmente, se forma una cápsula de colágeno (quedando encapsulada). Los mecanismos inmunológicos esenciales de protección contra T. spiralis están dirigidos a nivel intestinal contra los VA y a nivel sistémico y tisular contra las LRN. El ataque inmunológico contra los VA se manifiesta por un rechazo acelerado en intestino. Las LRN son destruidas en presencia de leucocitos activados mediante el mecanismo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA). En simultáneo con la respuesta intestinal se produce una respuesta inflamatoria a nivel del parénquima pulmonar donde habría retención y destrucción de la LRN. El objetivo general de esta Tesis fue estudiar el efecto de la deficiencia proteica en la dieta a nivel inmunológico durante la infección con T. spiralis en un modelo experimental en ratas a partir del destete. En particular, se estudió la respuesta inmune en el intestino y en pulmón por ser órganos de importancia durante la respuesta inmune contra T. spiralis. Para ello, dos grupos de ratas de la cepa Wistar a partir del destete recibieron una dieta deficiente en proteína (DP) o dieta control (C). Luego de 10 días, un grupo de cada dieta se infectó por vía oral con 900 LM (grupos DPI y CI) y otros dos permanecieron sin infectar (grupos DPNI y CNI). A distintos tiempos post-infección (p.i.) se midieron parámetros nutricionales, parasitológicos e inmunológicos tanto en intestino como pulmón (órganos de importancia en el ciclo de T. spiralis). Con respecto a los parámetros nutricionales se observó que tanto el peso corporal como el consumo de dieta y proteínas fueron menores en el grupo DPI con respecto a CI. Incluso se observó un menor peso del grupo DPI con respecto a DPNI. En cuanto a la respuesta inmune tanto en intestino como en pulmón se observó que el número de células caliciformes, mastocitos, eosinófilos, células IgE+, entre otras, alcanzaron menores números en animales del grupo DPI con respecto a CI; habiendo inicialmente un retraso en el aumento de dichas poblaciones en el grupo DPI. Con respecto a los anticuerpos tanto específicos como totales, también se observaron menores niveles en el grupo DPI comparado con CI. Los niveles de interleuquinas en extractos de ambos órganos fueron menores en DPI, con la excepción de IL-12 en extractos pulmonares. Estudios histológicos en intestino mostraron la presencia del VA hasta el día 33 p.i. en el grupo DPI, cuando en el modelo murino se encuentran presentes hasta aproximandamente los 14 dias p.i. Teniendo en cuenta este resultado, se evaluó el índice de fecundidad de los VA hembras a diferentes días y se observó que en el grupo DPI los VA hembras liberan LRN en mayor cantidad y a mayores tiempos p.i. con respecto al grupo CI. Cuando se analizó la respuesta contra el estadio migrante (LRN) se observó que los sueros de CI y DPI tenían la misma capacidad de participación en el mecanismo de CCDA. En cuanto a la capacidad de CCDA de las células pulmonares, se observó que las del grupo DPI recién a los 13 días p.i. podían ejercer el efecto citotóxico (combinadas con un suero con alto título de anticuerpos anti-LRN), mientras que en el grupo CI tanto a los 6 como 13 días p.i. las células eran capaces de ejercer efecto citotóxico. El estudio de las suspensiones celulares mostró un menor porcentaje tanto de neutrófilos como de eosinófilos (células efectoras del CCDA) en DPI. Al evaluar la capacidad de mediar CCDA de los anticuerpos presentes en los extractos pulmonares, se observó una menor respuesta en el grupo DPI con respecto a CI. Finalmente, cuando se evaluó la combinatoria de extracto pulmonar con su respectiva suspensión celular para cada grupo no se observó CCDA en el grupo DPI mientras que en CI se observó tanto a los 6 como a los 13 días p.i. Finalmente, al evaluar la carga parasitaria final en músculo de ambos grupos, se observó que el grupo DPI tuvo una carga diez veces mayor a la del grupo CI. Teniendo en cuenta todos los resultados en la presente Tesis, se puede concluir que la deficiencia proteica disminuye la respuesta inmune contra T. spiralis, retrasando la expulsión de los VA del intestino, lo cual sumado al mayor índice de fecundidad y la menor respuesta contra la LRN en pulmón, culminaría con la mayor carga parasitaria final.

Descripción: Los trastornos del espectro autista (TEA) son un grupo de desórdenes del neurodesarrollo de inicio temprano, cuyo núcleo sintomático son los déficits en la comunicación e interacción social e intereses y actividades restringidos y estereotipados. Los TEA se caracterizan por alteraciones sinápticas, neuroinflamación y conectividad cerebral atípica. Actualmente, se postula una hiper-conectividad de circuitos locales e hipo-conectividad de largo alcance en los TEA. Lamentablemente, no existe terapia farmacológica para sus síntomas nucleares. El modelo VPA es ampliamente aceptado en el estudio de los TEA, dada su validez de constructo, apariencia y predicción. El enriquecimiento ambiental es una estrategia utilizada en diversos modelos y en animales naive mediante la cual se modula la neuroplasticidad y se obtienen beneficios conductuales. El objetivo de este trabajo de Tesis fue evaluar la conectividad en el cerebro de los animales VPA y los efectos conductuales y neurobiológicos del enriquecimiento ambiental sobre estos animales en una etapa crítica del desarrollo postnatal, junto a la disección de la relevancia de sus componentes. Para ello, se administró una única dosis de ácido valproico (VPA, 450 mg/kg) a hembras gestantes (E10,5). Los animales VPA presentaron un retraso en parámetros de crecimiento, maduración y desarrollo conductual en un estadio postnatal temprano, seguidos de déficits conductuales en el estadio prepuberal que reproducen los síntomas nucleares de los TEA. En el aspecto funcional, se evaluó la captación de -fluordesoxiglucosa (FDG) cerebral mediante PET. Los animales VPA mostraron una menor captación cerebral global de FDG y un incremento en la captación de FDG local y asimétrica, en la corteza prefrontal y somatosensorial, el cíngulo, los ganglios basales, la amígdala, el tálamo y el hipocampo. Para estudiar las bases neurobiológicas de la hipo-conectividad de largo alcance, se estudiaron aspectos moleculares, ultraestructurales y celulares en el cuerpo calloso (CC), la principal estructura de conexión interhemisférica. Los animales VPA presentaron una menor proporción de axones mielínicos en el CC y aberraciones en la vaina de mielina, compatibles con una pérdida de su compactación característica. Asimismo, se evidenció un menor número de oligodendrocitos maduros y un aumento en la densidad de precursores oligodendrogliales (OPCs) en el CC de los animales VPA, en ausencia de gliosis reactiva. Estos cambios se acompañaron de alteraciones en la expresión de la molécula de adhesión celular neural y su forma polisialilada (PSA-NCAM). En cambio, los animales VPA evidenciaron preservada la vaina de mielina y ausencia de alteraciones en el linaje oligodendroglial en la corteza prefrontal medial (CPFm). Dados los beneficios del enriquecimiento ambiental (EE) sobre aspectos conductuales, neuroquímicos y en la dinámica oligodendroglial en animales naive, se decidió utilizar esta estrategia para evidenciar sus efectos sobre los animales VPA. El EE completo (físico y social) previno las deficiencias en la actividad exploratoria y en la exploración social de los animales VPA. El EE no tuvo efecto sobre la actividad estereotipada y la conducta símil-ansiedad, exacerbadas en los animales VPA. En lo que respecta a la neurobiología de estos animales, el EE previno la reducción de axones mielínicos y las aberraciones de la vaina de mielina en el CC de los animales VPA. El EE previno el aumento de la densidad de los OPCs, sin afectar el número de oligodendrocitos maduros en el CC de los animales VPA. Los animales VPA evidenciaron un aumento en el número de sinapsis en la CPFm, que fue prevenido por el EE. Para identificar la importancia de los componentes físico y social del EE en sus efectos conductuales, se implementó una estrategia de enriquecimiento ambiental exclusivamente físico (EF). Esta estrategia no sólo previno los déficits en la actividad exploratoria y en la exploración social evidenciados en los animales VPA sino que, a diferencia del EE completo, también previno el incremento de la conducta estereotipada. En este trabajo de Tesis se describen alteraciones conductuales en los animales VPA presentes en estadios postnatales tempranos y estadios prepuberales, que representan el núcleo sintomático de los TEA. Notablemente, este trabajo apoya la hipótesis de la hiper-nconectividad local e hipo-conectividad de largo alcance para los TEA. Los animales VPA evidencian alteraciones en el perfil metabólico cerebral, con un hipo-metabolismo global y una hiperactividad metabólica local y en algunos casos asimétrica, en diversas regiones cerebrales asociadas a los síntomas nucleares de los TEA. Asimismo, se evidencian las bases neurobiológicas subyacentes a la hipo-conectividad de largo alcance postulada para los TEA. Los animales VPA presentan alteraciones en la mielinización y la dinámica oligodendroglial, acompañados por cambios en moléculas de adhesión relevantes en la señalización entre los axones y la oligodendroglia, y para el correcto desarrollo de tractos de sustancia blanca. La ausencia de cambios en la CPFm, descarta una afección generalizada en la mielinización y la dinámica oligodendroglial en el cerebro de los animales VPA. El EE promueve beneficios conductuales a los animales VPA, concomitantemente con la modulación de la mielinización y la dinámica del linaje oligodendroglial en el CC y la sinapsis en la CPFm. Así, el EE modula la conectividad cerebral atípica en los animales VPA. Sorprendentemente, el EF genera mayores beneficios en la conducta de los animales VPA, señalando el papel fundamental del componente físico e indicando que el componente social no es requerido para promover los beneficios conductuales del EE. De este modo, el EE y el EF se establecen como herramientas para el estudio de las bases neurobiológicas y los blancos terapéuticos de los TEA.

Descripción: El virus de la diarrea viral bovina (BVDV) es un patógeno importante del ganado bovino de gran impacto económico, por lo que la identificación de antivirales para el tratamiento de las infecciones y control de los brotes por BVDV resulta de interés. Mediante fármaco-modulación de 5,6-TSC, un compuesto previamente identificado como un inhibidor no nucleosídico (INN) de la ARN-polimerasa (RdRp) de BVDV, se sintetizaron una serie de tiosemicarbazonas (TSC) y N4-ariltiosemicarbazonas derivadas de 1-indanonas. A partir de esto, en este trabajo de tesis se identificaron dos compuestos con mayor actividad anti-BVDV: N4-(p-nitrofenil)-TSC derivada de la 5,6-dimetoxi-1-indanona (N4-TSC) y la TSC derivada de 6-nitro-1-indanona (6NO2-TSC), que fueron activos frente a BVDV de distintos genotipos y biotipos e inactivos frente a otros ARN virus. Se demostró que estos compuestos actúan en etapas intermedias del ciclo de replicación viral. Particularmente, N4-TSC actúa inhibiendo la síntesis del ARN viral, y mediante la selección de BVDV resistentes (N4-TSCR) se identificó a la RdRp como el blanco de acción. Mediante estudios de docking y dinámica molecular se demostró que las mutaciones encontradas en N4-TSCR (N264D y A392E) alteran la interacción de N4-TSC con RdRp y son responsables de la resistencia antiviral.

Descripción: La Enfermedad Respiratoria Bovina (ERB), es una enfermedad infectocontagiosa que afecta las vías respiratorias de los rumiantes, y si bien engloba a un conjunto de enfermedades, comúnmente se la denomina neumonía. Es una patología de desarrollo multicausal en la que intervienen agentes virales y bacterianos que, junto con factores ambientales, permiten el desarrollo de la enfermedad que cursa con una sintomatología característica. A pesar de los estudios realizados en las últimas décadas sobre numerosos aspectos de la ERB entre los que se encuentran los factores de riesgo, la etiopatogenia, las características de los agentes causales, el diagnóstico, la terapéutica o la profilaxis y sus efectos globales, la neumonía continúa siendo una de las enfermedades de mayor impacto económico en el ganado vacuno. Tales antecedentes sumados a la falta de regulación sanitaria en los establecimientos productores de carne y de leche, hacen que los brotes de neumonía sean un problema de relevancia productiva y económica para un país con una matriz agropecuaria como la Argentina. A pesar de utilizarse vacunas para ERB, sus principales características indican que se la debe considerar como una enfermedad de difícil control con la que el ambiente ganadero convive, con la esperanza de minimizar tanto su incidencia como la gravedad de sus consecuencias que incluyen la pérdida en la ganancia de peso, los gastos en los tratamientos y la muerte de los animales. En base a lo expuesto, existe la necesidad de estudiar la respuesta inmune generada por la vacunación con el fin de mejorar las respuestas de las vacunas para esta enfermedad. Así surgió el objetivo general de esta Tesis Doctoral que consistió en estudiar la respuesta inmune generada por la vacunación contra la ERB en el ganado bovino y establecer un modelo murino que permita evaluar la respuesta a cada componente vacunal por separado, y analizar la posibilidad de modificar la composición vacunal antes del traslado al campo. Complementariamente, se evaluaron estrategias inmunopotenciadoras sobre la respuesta inmune generada por la vacuna. En este trabajo, se desarrolló un modelo murino similar al plan de vacunación en los bovinos, empleando la vacuna comercial Biopoligen® HS. Además, se desarrolló un ELISA para detectar anticuerpos específicos contra Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica e Histophilus somni que permitiera evaluar las modificaciones en los planes de inmunización realizados en ratones variando los tiempos de inmunización, el número de dosis, los inmunógenos y los adyuvantes empleados. Se evidenció que la incorporación de una tercera dosis en el plan de inmunización en ratones mejoró la respuesta humoral, y que la administración conjunta de la cepa probiótica Enterococcus faecalis CECT7121 como estrategia inmunoestimulante potenció la respuesta frente a la vacunación. Adicionalmente, se evaluaron distintos adyuvantes junto a los inmunógenos aislados y se demostró que el empleo de MontanideTM Gel 01PR y Coagel fueron muy eficientes ya que estimularon un aumento en la producción de anticuerpos específicos. Este adyuvante novedoso de nanoestructura de cristal líquido, Coagel, deberá aun ser evaluado en el hospedador natural. Respecto al modelo bovino, se estudió la serología en terneros, animales de tambo y de engorde a corral de diferentes edades y status inmunitario. Los resultados obtenidos muestran que los terneros luego de recibir calostro presentaron elevados títulos para las 3 bacterias estudiadas que no eran detectables antes de la ingesta del mismo y que pueden interferir en la respuesta a la vacunación. En los screenings realizados se detectó una gran heterogeneidad en la respuesta inmune evaluada en bovinos inmunizados. Sin embargo, en planes de inmunización bien controlados se evidenció el aumento de anticuerpos específicos provocado por la vacunación. La neumonía está ampliamente distribuida en el ganado, y si bien los bovinos son inmunizados para protegerlos de la ERB, igualmente pueden desarrollar cuadros neumónicos. Esto sugiere que la incidencia de la enfermedad se ve afectada por factores externos a la vacunación como ser el manejo de los bovinos, el correcto calostrado, el cumplimiento de las dosis y los tiempos de vacunación, factores que por lo general son subestimados. Durante la ejecución de esta tesis, fue posible trasladar del modelo murino al bovino, algunas de las modificaciones con las que se obtuvieron mejoras en la respuesta inmune. Así, la introducción de tres dosis al plan de inmunización logró mejorar los niveles de anticuerpos específicos. Además, el empleo del adyuvante MontanideTM Gel 01PR y la estrategia de administrar probióticos condujo a una tendencia a mejoras en la producción de anticuerpos. Los aportes de este trabajo de Tesis consistieron en estudiar en el ganado bovino la respuesta inmune generada por la vacunación para la Enfermedad Respiratoria Bovina y establecer un modelo murino que, a pesar de algunas diferencias, fue útil como herramienta para evaluar modificaciones en la composición vacunal y/o los adyuvantes antes del traslado al hospedador natural. Complementariamente, se evaluó como estrategia inmunopotenciadora sobre la respuesta inmune generada por la vacuna la utilización de preparados probióticos tanto en ratones como en terneros. En base a los resultados obtenidos proponemos mejoras estratégicas en los cronogramas de vacunación actualmente utilizados contra ERB, teniendo en cuenta los puntos críticos de infección dentro de los establecimientos y los momentos específicos de manejo.

Descripción: La leucemia linfática crónica (LLC) es una enfermedad incurable y se caracteriza por la acumulación clonal de linfocitos B maduros en sangre periférica y órganos linfoides. Las células leucémicas sobreviven, se activan y proliferan en los tejidos linfoides por percibir señales a través de su receptor antigénico (BCR) y por contactar con linfocitos T activados, células estromales y mieloides. Es por eso que la terapia con inhibidores de las tirosinas quinasas asociadas al BCR (BCR-KI) resulta tan exitosa ya que moviliza a las células leucémicas de los órganos linfoides hacia la circulación. Si bien estos inhibidores no curan la LLC, el clon leucémico en circulación, lejos de los nichos de supervivencia, es más susceptible al tratamiento con otros agentes terapéuticos, entre ellos, los anticuerpos monoclonales anti-CD20, como el rituximab y el inhibidor de BCL-2, llamado venetoclax o ABT-199. Venetoclax mostró resultados muy alentadores en ensayos clínicos y fue aprobado en el 2016 en EE. UU. y en Argentina como monoterapia, y en 2018 en combinación con rituximab luego de los resultados alentadores observados en el estudio MURANO. Si bien en los últimos años las nuevas terapias han mejorado el panorama en el tratamiento de la LLC, esta enfermedad hoy continúa siendo incurable. Por todo esto, el objetivo general del trabajo fue la búsqueda racional de una combinación de agentes terapéuticos que logren mejorar el tratamiento actual de los pacientes con LLC, centrándonos en el venetoclax, los BCR-KIs y el anticuerpo anti-CD20 rituximab. Para ello primero estudiamos el impacto del tratamiento in vitro con venetoclax en la sobrevida del clon leucémico, los linfocitos T, las células NK y los monocitos de los pacientes con LLC. Encontramos que las células leucémicas son altamente sensibles a la droga en comparación al resto de las poblaciones. Asimismo, venetoclax no modificó sustancialmente la capacidad de activación de los linfocitos T. Luego determinamos que las señales brindadas por los linfocitos T autólogos activados activaban al clon leucémico, incrementando la expresión de moléculas antiapoptóticas como MCL-1 y BCL-XL, las cuales no son blanco del venetoclax, por lo que se favorecía la resistencia del clon leucémico a la droga. Asimismo, encontramos que las células que resisten a venetoclax presentan un fenotipo más agresivo caracterizado por un tamaño aumentado, mayor expresión de CD86, PD-1 y mayor potencial proliferativo dado por el aumento en Ki67. Nuestros hallazgos alientan a la combinación de la droga con el inhibidor de SYK entospletinib ya que fue capaz de revertir la resistencia a venetoclax inducida por los linfocitos T activados. Por último, estudiamos el efecto in vitro del venetoclax y entospletinib en la CCDA mediada por células NK y en la fagocitosis de células leucémicas recubiertas con rituximab. Encontramos que venetoclax no afecta la CCDA en las células NK, mientras que entospletinib la inhibe. En relación a la fagocitosis, nuestro grupo ya había trabajado con BCR-KI y fagocitosis demostrando que tanto ibrutinib como entospletinib reducían la fagocitosis de las células LLC recubiertas con rituximab. En este trabajo de tesis demostramos que venetoclax, actuando sobre el clon leucémico, incrementa su fagocitosis y que este proceso se asocia a un incremento en la exposición de fosfatidilserina, sin embargo, no puede explicarse por una mayor unión de rituximab a las células LLC. Más interesante aún, venetoclax continuó siendo capaz de incrementar la fagocitosis de las células LLC opsonizadas, aún en presencia de entospletinib. En conclusión, la generación de resistencia in vitro a venetoclax inducida por los linfocitos T autólogos activados sugiere que las células leucémicas presentes en los nichos de supervivencia no serían eficientemente eliminadas por el venetoclax como monodroga, seleccionándose aquellas células con un fenotipo más agresivo y con mayor capacidad proliferativa. Nuestros resultados alientan al empleo de venetoclax en combinación con entospletinib, el cual fue capaz de revertir la resistencia de las LLC inducida por el microambiente tumoral. Además, la combinación de estos dos agentes con anticuerpos anti-CD20 podría ser potencialmente beneficiosa para los pacientes ya que venetoclax fue capaz de incrementar la fagocitosis de las LLC opsonizadas con rituximab aún en presencia de entospletinib.

Descripción: Las Porfirias son desórdenes metabólicos producidos por deficiencia en una de las enzimas de la biosíntesis del hemo. La Porfiria Cutánea Tardía (PCT), la más frecuente de todas las Porfirias, es consecuencia de una disminución en la actividad de la uroporfirinógeno decarboxilasa (URO-D) a nivel hepático (PCT-A) o en todos los órganos (PCT-H). La PCT-A es la más común (75 a 80%) de este tipo de Porfiria, la PCT-H es de herencia autosómica dominante y la URO-D tiene un valor de alrededor del 50% de actividad con respecto al valor normal. Cuando su carácter es homocigota o heterocigota compuesto se la conoce como Porfiria Hepato Eritropoyética (PHE). La PCT es una enfermedad de baja penetrancia, aparece en la adultez aproximadamente a los 40 años y la relación Hombre:Mujer es de 4:1. Hay diversos agentes que son capaces de desencadenarla como ser el alcohol, estrógenos, acumulación de hierro, hidrocarburos polihalogenados, nitrosaminas del humo del tabaco y virus hepatotrópicos. Nuestra hipótesis se basa en que la presencia de SNPs en los citocromos P450 (CYPs) jugaría un rol en el desencadenamiento de la Porfiria, aumentando la capacidad metabolizadora de los CYPs y generando metabolitos que inhibirían a la URO-D. El objetivo general fue aportar evidencias adicionales sobre las posibilidades de manifestación de la PCT y ampliar nuestro conocimiento sobre la participación del sistema CYP en la expresión clínica de esta enfermedad. Para cumplir nuestro objetivo se genotipificaron las variantes: CYP1A1 (*4 ó m4, *2C ó m2, *2A ó m1), CYP1A2 (*1F) y CYP2E1 (*5B y *7B), las cuales se seleccionaron en base a trabajos previos donde se reporta su relación con el desarrollo del cáncer, pero con respecto a la Porfiria los resultados son discordantes. En este contexto decidimos estudiar las frecuencias genotípicas y alélicas y su relación con esta enfermedad en la población Argentina. Se estudió la siguiente población: 36 pacientes PCT-H, 76 PCT-A y 89 controles. En todos los casos los individuos firmaron el consentimiento informado y se contó con la aprobación del Comité de Ética. Se utilizó la técnica de PCR-RFLP seguida por secuenciación cuando el patrón de bandas obtenidas no fue claro. Se estimaron las frecuencias genotípicas y alélicas por conteo directo para cada SNP. Los genotipos y alelos de riesgo se calcularon por métodos bioinformáticos a través del VCCStats usando los parámetros: Odd Ratio, intervalos de confianza y p de Fisher; sólo se informaron los resultados cuando las diferencias fueron estadísticamente significativas (pf<0,05). Para el estudio de haplotipos de riesgo se utilizaron 64 muestras de las 112 estudiadas: 24 Controles, 23 PCT-H y 17 PCT-A, utilizando el programa SNPStats. Con el programa SNP predict fue estimado el efecto del cambio de aminoácido en la estructura de la enzima y su rol en el desencadenamiento de la PCT. El CYP1A2*1F (C/A) es un caso atípico en el cual el alelo de referencia es el menos frecuente, la misma tendencia se observó en nuestra población. El genotipo que contiene el alelo A o el alelo A per se fue de riesgo para desencadenarla PCT. Los resultados para la variante CYP1A1*4 (C/A) en nuestra población arrojaron que la frecuencia del genotipo homocigota alternativo fue significativamente mayor en PCT-H que en controles; este genotipo fue inexistente en PCT-A. En la alélica la frecuencia de A fue mayor en hereditarios que en adquiridos. Para los grupos: PCT-H vs Control y PCT-A el genotipo A/A y el alelo A resultó ser de riesgo. Si bien no está claramente reportado el efecto de esta variante alternativa la misma sería un factor de riesgo para PCT-H. En el caso del CYP1A1*2C(A/G) en cuanto a las frecuencias genotípicas los perfiles fueron diferentes a los esperados En ambos casos el homocigota alternativo suele presentarse en baja proporción o ser inexistente. El genotipo que contiene el alelo G en heterocigosis resultó ser de riesgo para PCT-H vs PCT-A. Para el CYP1A1*2A(T/C), en PCT-H vs PCT-A el genotipo T/T se halló en mayor proporción en este primer grupo y para T/C la frecuencia fue mayor en este último. Nuestros resultados no arrojan asociación de riesgo significativa al contrastar porfíricos con controles y hereditarios con adquiridos. El estudio de haplotipos de riesgo arrojó diferencias significativas para PCT-H vs Control siendo en este orden m4-m2-m1-1A2:C-G-C-C. En el CYP2E1*5B (C/T) el alelo C fue el más frecuente, las frecuencias del homocigota de referencia fueron similares a las del heterocigota, no se encontró el homocigota alternativo. No hubo diferencias significativas en ninguno de los grupos contrastados para cada genotipo y alelo. En nuestra población no se halló ninguna asociación entre la variable alternativa y la PCT. Para el CYP2E1*7B (G/T) el alelo ancestral fue el de mayor frecuencia y cada variante tiene una frecuencia similar para los diferentes grupos. El alelo T en homocigosis está en una baja frecuencia. En nuestros resultados para PCT-H vs PCT-AG/T vs G/G dio asociación significativa de riesgo. En el estudio de haplotipos de riesgo para el CYP2E1 se observó que T-T era el haplotipo de riesgo para todos los grupos de PCTs contrastados con controles.

Descripción: La aparición de metástasis pulmonares representa un mal pronóstico durante la progresión del Osteosarcoma (OS). Para obtener información relevante sobre la adquisición de habilidades metastásicas en células de OS, evaluamos eventos funcionales y moleculares asociados a la progresión tumoral. Abordamos un estudio funcional y análisis de perfil proteómico en la línea celular de OS no metastásica SAOS2 y su línea celular derivada LM7 con capacidad metastásica a pulmón. Demostramos que los pasos implicados en la remodelación de la matriz extracelular, migración celular y eventos de cascada angiogénica, pero no la respuesta angiogénica in vivo, fueron funcionalmente relevantes en las células metastásicas. El análisis de términos de ontología génica (GO) y abundancia proteica demostraron similitud entre ambos tipos celulares, con un perfil proteómico diferencial a nivel del secretoma, asociado a respuestas migratorias y eventos de señalización relevantes a supervivencia en las células metastásicas, entre otros. Además, las células madre mesenquimales (MSCs) presentaron una interacción diferencial con las células de OS, con las MSCs exhibiendo una respuesta quimiotáctica elevada ante el secretoma de las células no metastásicas, mientras que las células metastásicas mostraron una mayor migración hacia el secretoma de las MSCs. También identificamos proteínas con potencial de biomarcador. En resumen, abordamos por primera vez una comparación funcional y molecular entre células de OS con distinta capacidad metastásica, destacando el rol del secretoma de las células metastásicas. La identificación de mecanismos y genes expresados de modo diferencial asociados a metástasis, contribuiría al descubrimiento de potenciales marcadores, colaborando en la generación de nuevos enfoques terapéuticos útiles en el control de la diseminación metastásica.

Descripción: Los glioblastomas (GB) son los tumores primarios cerebrales más frecuentes y agresivos en adultos. La prolactina (PRL) y su receptor (PRLR) han sido asociados al desarrollo de tumores hormono-dependientes y se han detectado en biopsias de GB, pero aún se desconoce su función en la patogenia del GB. Nuestro objetivo fue evaluar el papel esta vía en GB. Detectamos PRL y PRLR en todas las líneas y modelos de GB estudiados. La activación o sobreexpresión de PRLR aumentó la sobrevida y quimio-resistencia en células de GB, mientras que el antagonista de PRLR, ?1?9-G129R-hPRL (PRLR-A) favoreció la quimio-sensibilidad e inhibió la migración de estas células. El análisis de datos transcriptómicos de biopsias de glioma indicó que la expresión de PRL está asociada al grado tumoral. La estratificación por sexo biológico reveló que los hombres con GB PRL+/PRLRHIGH tuvieron peor evolución que aquellos con GB PRL+/PRLRLOW, mientras que en pacientes masculinos con GII-III los resultados fueron opuestos. Concluimos que la vía de PRL podría favorecer la progresión del GB, constituyendo un posible blanco terapéutico. La comparación de vectores adenovirales y baculovirales in vitro e in vivo indicó que estos últimos serían apropiados para la transferencia de PRLR-A en GB experimental.

Descripción: La célula de Sertoli (CS) constituye el componente somático del túbulo seminífero donde brinda soporte estructural y nutricional a las células germinales en desarrollo. La CS prolifera en los periodos fetal, neonatal y peripuberal y cesa su proliferación en la pubertad en la mayoría de las especies. Cada CS es capaz de sustentar un número limitado de células germinales de manera que el número alcanzado de CS durante los periodos proliferativos determinará la capacidad espermatogénica del individuo adulto. Simultáneamente con el cese de la proliferación comienza el proceso de maduración de la CS. Durante este proceso las células adquieren la capacidad de formar uniones estrechas entre células vecinas, siendo las mismas el componente fundamental de la barrera hemato-testicular (BHT). El establecimiento de la barrera trae como consecuencia que las células germinales presentes en el compartimiento adluminal queden aisladas de la circulación y dependan de los productos de secreción de la CS para su desarrollo. Una de las funciones más relevantes de la CS madura es la de nutrir a las células germinales. Para cumplir dicha función las CS poseen un metabolismo energético particular. Por un lado, la glucosa es metabolizada mayoritariamente a lactato, principal sustrato energético para las células germinales. Por otro lado, los ácidos grasos son utilizados como principal fuente energética propia y además sirven para la producción de cuerpos cetónicos que también serán aportados como nutrientes a las células germinales. La Metformina es un antihiperglucemiante ampliamente utilizado para el tratamiento de la diabetes. Recientemente ha sido aprobada para el tratamiento en niños y adolescentes que no logran un control adecuado de la patología mediante cambios en la dieta y en el estilo de vida. Sin embargo, no se ha estudiado en detalle si Metformina administrada en etapas tempranas de la vida puede alterar la función testicular. En particular, no se conoce si la exposición a Metformina podría modificar el normal funcionamiento de la CS. El objetivo general de la Tesis es dilucidar si el tratamiento con Metformina en etapas tempranas de la vida puede alterar la proliferación y las funciones diferenciadas de las CS y por lo tanto 146 condicionar la fertilidad futura. Para alcanzar este objetivo se analizó: 1) el efecto del tratamiento con Metformina in vitro sobre la regulación hormonal de la proliferación de las CS inmaduras y sobre los mecanismos moleculares involucrados, 2) el efecto del tratamiento con Metformina de ratas macho neonatas sobre la proliferación de las CS inmaduras y su posible efecto a largo plazo sobre la capacidad espermatogénica de los animales adultos, 3) el efecto del tratamiento con Metformina in vitro sobre el metabolismo energético y la función nutricional de las CS madura y 4) el efecto del tratamiento con Metformina in vitro e in vivo sobre el establecimiento de una barrera de permeabilidad entre CS vecinas. En cuanto a la proliferación celular, los resultados obtenidos in vitro en cultivos de CS inmaduras indican que el tratamiento con Metformina es capaz de activar la AMPK e inhibir la vía mTORC1/p70S6K. Asimismo, muestran que Metformina disminuye el estímulo ejercido por FSH en la proliferación de la CS y que dicha disminución se acompaña de una reducción en la expresión de ciclinas (ciclinas D1-D2 y E1-E2) y de un incremento en la expresión del inhibidor del ciclo celular p21Cip1. Adicionalmente, el tratamiento neonatal de ratas con Metformina desde el dpn3 al dpn7, periodo en el cual la CS prolifera activamente, es capaz de reducir la proliferación de la CS. Esta disminución se acompaña de una menor expresión de ciclinas D1 y E2 y de un incremento en la expresión del inhibidor p21Cip1 en las CS. En cuanto a los efectos a largo plazo, se demostró que el tratamiento neonatal con Metformina disminuye la producción diaria de esperma sin modificar la morfología y motilidad espermática, sugiriendo que la disminución en la proliferación de las CS impactaría sobre la capacidad espermatogénica de los animales adultos. En cuanto al perfil metabólico, Metformina incrementa la producción de cuerpos cetónicos y de lactato, esenciales para la función nutricional que ejerce la CS. Sin embargo, Metformina disminuye la oxidación completa de ácidos grasos que se acompaña con una disminución en la expresión de CPT1 y de MCAD, proteínas que participan en dicho proceso oxidativo. Dado que los ácidos grasos son la principal fuente energética para la CS, la disminución observada podría alterar la homeostasis energética del túbulo seminífero. 147 Con respecto al efecto sobre la barrera de permeabilidad entre CS en cultivo, Metformina causó una disminución en la TER acompañada de un descenso en los niveles de expresión de claudina 11, ocludina, ZO-1 y conexina 43, proteínas que forman parte de las uniones que componen la BHT. Asimismo, el tratamiento de ratas con Metformina desde el dpn15 al dpn30, periodo clave en la formación de la BHT, produce un incremento en el porcentaje de túbulos permeados, sugiriendo una alteración en la permeabilidad de la BHT. El presente trabajo pone en evidencia que Metformina puede interferir con el normal funcionamiento de la célula de Sertoli en diferentes etapas de maduración. En particular, es capaz de modificar la proliferación, el metabolismo energético y la formación de la barrera de permeabilidad que establecen las células de Sertoli. Este trabajo intenta ser un aporte más hacia la compresión de los factores y mecanismos moleculares que en etapas tempranas de la vida podrían alterar la función reproductiva masculina y condicionar la fertilidad futura.

Descripción: El cáncer de mama es, en nuestro país y a nivel mundial, la neoplasia mayormente diagnosticada y la principal causa de muerte por cáncer en mujeres. El cáncer de mama triple negativo (CMTN) es el subtipo más agresivo con un alto potencial proliferativo y metastásico, presenta las mayores tasas de recaída y al no presentar biomarcadores para el uso racional de tratamientos específicos, carece de terapias dirigidas, lo que contribuye a su mal pronóstico. De esta manera, la identificación de nuevos biomarcadores para el diagnóstico temprano, la determinación del pronóstico o la terapia dirigida son de suma importancia para mejorar los resultados del paciente con CMTN. En el contexto de la complejidad y heterogeneidad de esta enfermedad oncológica, existe una necesidad crítica de desarrollar terapias que se dirijan no sólo a las células tumorales, sino que también afecten a sus vías biológicas y a su interacción con las células del microentorno tumoral del CMTN. La histamina es una amina biogénica y presenta numerosas funciones fisiológicas y fisiopatológicas, las que ejerce a través de la activación de 4 receptores H1, H2, H3 y H4 (RH1, RH2, RH3, RH4). El RH4 se encuentra expresado en células del sistema inmune y, aunque su papel en trastornos inflamatorios y autoinmunes está siendo investigado, su potencial función inmunomoduladora en el cáncer es completamente desconocida. En este trabajo en primer lugar se investigó si la expresión de la histidina decarboxilasa (HDC), enzima responsable de la producción de histamina, y del RH4 podrían relacionarse con el pronóstico, en términos de supervivencia, con el objetivo de identificar potenciales biomarcadores de esta patología oncológica. Los datos genómicos del Atlas Genómico del Cáncer (The Cancer Genome Atlas, TCGA) mostraron que tanto la expresión de la HDC como del RH4 está regulada negativamente en el cáncer de mama en comparación con el tejido normal. Una mayor expresión de HDC predijo una mejor supervivencia global y supervivencia libre de enfermedad en todos los pacientes con cáncer de mama, así como en pacientes con CMTN. En el caso del RH4 la supervivencia libre de enfermedad fue mayor en los pacientes con cáncer de mama, incluidos los CMTN, con mayor expresión del receptor. Posteriormente, se evaluó el efecto del tratamiento sistémico con histamina y con ligandos del RH4 en la progresión tumoral y en la respuesta inmune en un modelo experimental murino de CMTN desarrollado mediante inoculación ortotópica de células 4T1 en ratones BALB/c. El tratamiento con histamina produjo un efecto concentración dependiente, donde la concentración más alta utilizada (5 mg/kg) resultó ser la efectiva al reducir el tamaño y el peso de los tumores, efecto que se asoció con una reducción en la proliferación y un aumento en la apoptosis tumoral. Solo en los animales tratados con histamina se observó una correlación inversa entre la proporción de linfocitos infiltrantes de tumor (LIT) y el peso de los tumores. Sin embargo, el análisis de la distribución de las subpoblaciones de células inmunitarias, no arrojo diferencias significativas tanto en tumor, ganglios linfáticos drenantes de tumor (GLDT), ganglios linfáticos no drenantes (GL) como en el bazo entre el grupo de animales controles y el tratado. Los estudios in vitro mostraron una contribución directa en el efecto antitumoral de la histamina y de los agonistas del RH4 sobre las células tumorales 4T1. Estudios in vivo utilizando ligandos farmacológicos específicos del RH4 JNJ7777120 (JNJ77, antagonista RH4, 10 mg/kg) y JNJ28610244 (JNJ28, agonista RH4, 1 o 5 mg/kg) mostraron que solamente la concentración de JNJ28 1 mg/kg mostró tener un efecto antitumoral, reduciendo el volumen y el peso tumoral. No se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de LIT o de subpoblaciones de células inmunitarias en los tumores de animales tratados con JNJ28. Sin embargo, este compuesto incrementó el porcentaje de linfocitos T CD4+ en GLDT respecto del correspondiente en los animales no tratados. La mayor concentración utilizada del agonista (5 mg/kg) no modificó el crecimiento tumoral, pero aumentó el porcentaje de células T regulatorias en GLDT junto con un aumento en la producción de la citoquina IL-10 y una reducción de los niveles de IFN? en medios condicionados de tumor. Por el contrario, el antagonista del RH4 JNJ77 produjo una reducción del porcentaje de linfocitos T CD4+ en tumor acompañada de una disminución del porcentaje de las células T regulatorias en GLDT. Estos resultados sugieren que la activación del RH4 produce un efecto inmunosupresor que podría explicar parcialmente el resultado terapéutico no efectivo del tratamiento con el agonista RH4 JNJ28 en la concentración más alta (5 mg/kg). Hipotetizamos que, en este caso, en el balance podría prevalecer la acción inmunosupresora sobre el efecto antiproliferativo directo sobre las células tumorales. Para comprender mejor el papel inmunomodulador del RH4, se estudió el efecto exclusivo del RH4 expresado en células involucradas en la inmunidad antitumoral en el modelo de CMTN desarrollado en ratones que no expresan el RH4 (Knockout, KO) en comparación con los ratones de tipo salvaje (wild-type, WT). Los ratones KO mostraron tumores de menor tamaño y peso, disminución del número de metástasis pulmonares y del porcentaje de células T CD4+ que infiltran el tumor, mientras que exhibieron un mayor infiltrado de células NK y linfocitos B CD19+ respecto de los tumores desarrollado en animales WT. El GLDT de los ratones KO mostró una disminución de las células T CD4+ y de la subpoblación de las células T regulatorias junto a un mayor porcentaje de células NK. Estos resultados demuestran el papel crítico de la histamina endógena y la activación del RH4 expresado en células del microambiente tumoral, en el desarrollo y la progresión como así también en la inmunidad antitumoral del CMTN. Finalmente, con el objetivo de verificar si el efecto inmunomodulador del RH4 podría observarse en otro modelo de cáncer de mama, se inocularon ratones BALB/c WT y KO con la línea de adenocarcinoma mamario murino LM3 (ErbB-2 positivo) y se evaluó el compartimento de los linfocitos T CD4+ en tumores y ganglios linfáticos. Aunque no hubo diferencias en el peso de los tumores, los resultados mostraron que también en este modelo, el porcentaje de células T regulatorias disminuyó significativamente en los GLDT en animales deficientes para el RH4. Hasta dónde llega nuestro conocimiento, este sería el primer reporte que demuestra la participación del RH4 en la inmunidad antitumoral. En conjunto los resultados sugieren una acción dual del RH4 en este modelo de cáncer de mama. Por un lado, produciendo un efecto antiproliferativo directo sobre las células tumorales y por otro, un efecto inmunosupresor, lo que resalta la complejidad de la patología oncológica. Además, estos indican que principalmente la histamina podría representar un potencial agente terapéutico en CMTN, como tratamiento único o incluso como terapia combinada.

Descripción: La disponibilidad de nitrógeno es un factor crítico para la productividad de los cultivos. La aplicación de fertilizantes nitrogenados sintéticos derivados del petróleo ha logrado disminuir parcialmente la deficiencia de nitrógeno en muchos cultivos. Sin embargo, la producción, la distribución y la aplicación de estos fertilizantes nitrogenados son procesos costosos que producen altas emisiones de gases de efecto invernadero, incluyendo el óxido nitroso (N2O). Una alternativa sustentable para mitigar el uso de fertilizantes nitrogenados es el cultivo de leguminosas capaces de fijar nitrógeno en asociación con bacterias simbiontes en órganos específicos denominados nódulos. Muchas leguminosas, entre las cuales se destacan la alfalfa, no solo son capaces de crecer sin fertilización nitrogenada, sino que además, aportan nitrógeno al suelo. Si bien las leguminosas juegan un papel clave en la sustentabilidad de la agricultura, los nódulos senescentes pueden constituir una fuente vasta de nitrógeno orgánico que derive en altas emisiones de N2O. En esta tesis doctoral, se presentan las bases moleculares que explican la alta emisión de N2O en el cultivo de alfalfa. Específicamente, se encontró que, durante el proceso de domesticación, las cepas utilizadas actualmente para inocular alfalfa a nivel comercial (Sinorhizobium meliloti B399 y Sinorhizobium meliloti B401) conservaron su capacidad de fijar nitrógeno en forma eficiente, pero perdieron su habilidad para degradar el N2O. Esta deficiencia se debe a la deleción del cluster NOS que codifica para el complejo enzimático N2O reductasa (NOS-). Durante la búsqueda de nuevos rizobios naturales amigables con el medio ambiente que contengan el cluster NOS (NOS+), se detectó la presencia de rizobios conteniendo genes de resistencia a antibióticos en plásmidos sintéticos. De esta forma, sería necesario una secuenciación genómica de los rizobios hipotéticamente naturales para garantizar una alta inocuidad ambiental y de salud pública de las bacterias promotoras del crecimiento vegetal. Por otra parte, el análisis bioinfomático y experimental de nuevos aislamientos de rizobios, mostró que en la naturaleza surgen mutantes espontáneas del gen napC que combinan alta eficiencia de fijación de nitrógeno con baja emisión de N2O. Además, un subgrupo de estas cepas naturales mostró tener similar eficiencia de fijación de nitrógeno y de nodulación en relación a la cepa comercial B399. De esta forma, los resultados de esta tesis doctoral sugieren que es posible avanzar hacia una producción sustentable de alfalfa, tanto en términos económicos como ecológicos.

Descripción: En esta Tesis Doctoral demostramos que el bloqueo de la señalización del receptor GABAB en periodos críticos del desarrollo postnatal causa alteraciones permanentes en factores esenciales para un correcto desarrollo y funcionamiento del eje gonadotrófico. Describimos claramente que un input GABAérgico, a través de los RGABAB, durante la ventana postnatal temprana es necesario para la correcta expresión de genes que son críticos para la función reproductiva, como Kiss1, Tac2 y Gnrh1; y genes que codifican para las enzimas de síntesis de neurotransmisores comoGad1 y Th. Cambios en los patrones normales de expresión de estos genes debido a alteraciones en la señalización de GABA provocan efectos río abajo en el eje reproductivo, impactando no solo el desarrollo neonatal, sino estadios más tardíos como la adultez. Este tratamiento impacta principalmente en el núcleo arcuato. Así mismo, demostramos que GABA a través de sus receptores GABAB puede modularla expresión de genes clave para la reproducción más allá de la ventana perinatal. Al prolongar el tratamiento hasta el DPN21 se observan alteraciones que comprometen de diversas maneras eje reproductivo en desarrollo y adulto. De manera llamativa, en este caso también se impacta la expresión de Kiss1 en el núcleo antero ventro-periventricular en las hembras.

Descripción: La terapia antirretroviral combinada (TARc) disminuye eficazmente los niveles circulantes de VIH-1, pero no erradica el virus, que persiste en un pequeño grupo de células infectadas de forma latente, que se asocia con inflamación persistente durante la TARc. La galectina-1 (Gal1) es una lectina endógena con importantes funciones inmunomoduladoras. En este trabajo, demostramos que Gal1 revierte la latencia del VIH-1 en células J-LAT de una manera dependiente de glicanos y mediante la activación de la vía NF-?B. Además, Gal1 promueve la producción viral en células T CD4 + primarias infectadas con VIH-1. Hallamos un aumento en los niveles plasmáticos de Gal1 en individuos VIH-1+, en comparación con los donantes no infectados, independientemente de la carga viral y del número de células T CD4+. Esto correlacionó positivamente con el tamaño del reservorio de VIH-1, lo que sugiere que Gal1 podría estar modulando la actividad transcripcional del reservorio viral in vivo. Finalmente, mostramos que las vesículas extracelulares aisladas del plasma de individuos infectados con VIH-1 inducen la secreción de Gal1 por parte de macrófagos. En conclusión, proponemos que al modular la dinámica del reservorio, Gal1 y VEc vinculan la inflamación con la persistencia del VIH-1 en individuos tratados con TARc.

Descripción: Los alimentos pueden contaminarse con microorganismos patógenos en cualquier etapa desde su producción hasta la disposición para el consumo. Entre éstos, los virus son un motivo de preocupación dada su incidencia creciente. La Organización Mundial de la Salud (OMS) reconoce al virus de hepatitis A (HAV) y al norovirus (NoV) como los más relevantes, a los que se suma el virus de hepatitis E (HEV) por su carácter zoonótico. Los últimos dos han sido encontrados como contaminantes en recursos hídricos y en aguas residuales en Argentina, así como en muestras clínicas, lo que revela su circulación en la población y su existencia como peligro ambiental. En este trabajo, la hipótesis planteada es que, dado que en nuestro país no se realiza la detección de virus en alimentos en forma rutinaria y los virus entéricos pueden encontrarse en el ambiente, algunos alimentos frescos de origen vegetal y cárnico comercializados localmente están contaminados con virus de transmisión entérica, aun cuando presentaran buena calidad bacteriológica, y constituyen un riesgo para la salud de los consumidores. El objetivo general fue realizar un relevamiento y estudio de la posible contaminación viral de diferentes tipos de alimentos, como también en una de sus potenciales fuentes contaminantes para poder establecer rutas probables de contaminación y evaluar el impacto que esto pudiera tener en la salud pública. De manera que este estudio abarcó 3 instancias. La primera fue un relevamiento local de la circulación de virus en aguas residuales colectadas en zonas de CABA y Provincia de Buenos Aires, como potenciales fuentes de contaminación de alimentos. Se realizó en períodos de tiempo previos y simultáneos al de muestreo de alimentos, que cubría la misma área geográfica. En esa primera aproximación, se identificó la presencia de 7 genotipos circulantes de norovirus: GII.P2, GII.P4, GII.P16, GII.P17, GII.P31, GII.P33 y GIX.1, cuyas frecuencias fueron diferentes según el período de tiempo analizado. Estos resultados, junto a los antecedentes de circulación de virus entéricos en aguas superficiales del país, motivaron la búsqueda de norovirus en los alimentos como primer paso en la identificación del peligro, lo que constituyó la segunda etapa de estudio. Para eso, se implementaron métodos de elución alcalina y concentración viral por precipitación con polietilenglicol acoplados a determinación molecular de los virus de interés en lechugas, frutillas, ostras e hígado de cerdo, en este último caso para estudiar en forma preliminar la presencia de HEV. Estos métodos se evaluaron mediante la recuperación de dos virus controles de proceso: uno con genoma de ARN (bacteriófago PP7) y otro de ADN (adenovirus recombinante, rAdV). Entre ambos controles, PP7 resultó de mayor utilidad en todos los alimentos evaluados, ya que permitió recuperaciones aceptables de acuerdo con lo establecido por la norma ISO 15216-1 (?1 %) para vegetales y moluscos bivalvos, en un rango de inóculos generalmente entre 6E6 y 2E10 copias genómicas/muestra. Además, se evaluó su aplicación como modelo de recuperación de norovirus en lechugas. Si bien no se encontró correlación entre las recuperaciones de ambos virus a las concentraciones ensayadas, norovirus se recuperó en un porcentaje significativamente mayor que el control, incluso cuando este último presentó recuperaciones por debajo del 1%. Este hecho permitió confiar en el resultado negativo para norovirus en muestras con recuperaciones del control bajas o inferiores al 1% obtenidas en este trabajo. En el caso de rAdV, su utilidad no pudo Resumen 73 definirse a las concentraciones ensayadas, a las que presentó eficiencias no aptas para validar los ensayos de concentración. Como resultado de la segunda etapa, no se encontró norovirus en los vegetales ni en las ostras, como tampoco HEV en el muestreo preliminar de hígado de cerdo. Sin embargo, se evidenció contaminación viral, de orígenes tanto humano como animal, y contaminación bacteriana, mediante las detecciones de poliomavirus humanos y bovinos, bacteriófagos F-ARN y Salmonella spp., según el caso. En el análisis de muestras de vegetales, los tipos de poliomavirus humanos detectados indicarían que las vías más probables de contaminación en estos alimentos serían principalmente la manipulación por parte de personas portadoras de una infección viral, mayoritariamente asintomática y el riego con aguas con contaminación de origen humano. Los resultados del análisis de las ostras señalan como fuentes de contaminación no sólo excretas humanas sino también bovinas, probablemente presentes en las aguas de cultivo. Es decir, frente a un brote de infección por norovirus asociado al consumo de estos alimentos, dichas vías darían una explicación posible de su ocurrencia. De modo que la tercera etapa de estudio comprendió una evaluación de riesgo semicuantitativa que, a pesar de haberse aplicado sobre un muestreo reducido, considerando datos generales y asumiendo como prevalencias de contaminación a la de los indicadores y la de Salmonella en ostras, permitió identificar a las lechugas y a las ostras como los alimentos con mayor riesgo potencial de portar agentes patógenos. Contrariamente a la hipótesis planteada, no se detectó contaminación con virus entéricos patógenos para el hombre en los alimentos analizados. No obstante, las otras detecciones realizadas servirían para orientar la vigilancia hacia estos alimentos con mayor probabilidad de encontrarse vinculados a brotes, así como al seguimiento de las prácticas de producción que pudieran favorecer su ocurrencia, con el objetivo de prevenirlos. Por otro lado, pueden servir como antecedentes que justifiquen la inclusión de los virus como agentes de enfermedades alimentarias en las reglamentaciones nacionales, no solo como tema de salud pública en el país sino para mejorar la competitividad en el mercado internacional.