Descripción: El cáncer de mama es, en nuestro país y a nivel mundial, la neoplasia mayormente diagnosticada y la principal causa de muerte por cáncer en mujeres. El cáncer de mama triple negativo (CMTN) es el subtipo más agresivo con un alto potencial proliferativo y metastásico, presenta las mayores tasas de recaída y al no presentar biomarcadores para el uso racional de tratamientos específicos, carece de terapias dirigidas, lo que contribuye a su mal pronóstico. De esta manera, la identificación de nuevos biomarcadores para el diagnóstico temprano, la determinación del pronóstico o la terapia dirigida son de suma importancia para mejorar los resultados del paciente con CMTN. En el contexto de la complejidad y heterogeneidad de esta enfermedad oncológica, existe una necesidad crítica de desarrollar terapias que se dirijan no sólo a las células tumorales, sino que también afecten a sus vías biológicas y a su interacción con las células del microentorno tumoral del CMTN. La histamina es una amina biogénica y presenta numerosas funciones fisiológicas y fisiopatológicas, las que ejerce a través de la activación de 4 receptores H1, H2, H3 y H4 (RH1, RH2, RH3, RH4). El RH4 se encuentra expresado en células del sistema inmune y, aunque su papel en trastornos inflamatorios y autoinmunes está siendo investigado, su potencial función inmunomoduladora en el cáncer es completamente desconocida. En este trabajo en primer lugar se investigó si la expresión de la histidina decarboxilasa (HDC), enzima responsable de la producción de histamina, y del RH4 podrían relacionarse con el pronóstico, en términos de supervivencia, con el objetivo de identificar potenciales biomarcadores de esta patología oncológica. Los datos genómicos del Atlas Genómico del Cáncer (The Cancer Genome Atlas, TCGA) mostraron que tanto la expresión de la HDC como del RH4 está regulada negativamente en el cáncer de mama en comparación con el tejido normal. Una mayor expresión de HDC predijo una mejor supervivencia global y supervivencia libre de enfermedad en todos los pacientes con cáncer de mama, así como en pacientes con CMTN. En el caso del RH4 la supervivencia libre de enfermedad fue mayor en los pacientes con cáncer de mama, incluidos los CMTN, con mayor expresión del receptor. Posteriormente, se evaluó el efecto del tratamiento sistémico con histamina y con ligandos del RH4 en la progresión tumoral y en la respuesta inmune en un modelo experimental murino de CMTN desarrollado mediante inoculación ortotópica de células 4T1 en ratones BALB/c. El tratamiento con histamina produjo un efecto concentración dependiente, donde la concentración más alta utilizada (5 mg/kg) resultó ser la efectiva al reducir el tamaño y el peso de los tumores, efecto que se asoció con una reducción en la proliferación y un aumento en la apoptosis tumoral. Solo en los animales tratados con histamina se observó una correlación inversa entre la proporción de linfocitos infiltrantes de tumor (LIT) y el peso de los tumores. Sin embargo, el análisis de la distribución de las subpoblaciones de células inmunitarias, no arrojo diferencias significativas tanto en tumor, ganglios linfáticos drenantes de tumor (GLDT), ganglios linfáticos no drenantes (GL) como en el bazo entre el grupo de animales controles y el tratado. Los estudios in vitro mostraron una contribución directa en el efecto antitumoral de la histamina y de los agonistas del RH4 sobre las células tumorales 4T1. Estudios in vivo utilizando ligandos farmacológicos específicos del RH4 JNJ7777120 (JNJ77, antagonista RH4, 10 mg/kg) y JNJ28610244 (JNJ28, agonista RH4, 1 o 5 mg/kg) mostraron que solamente la concentración de JNJ28 1 mg/kg mostró tener un efecto antitumoral, reduciendo el volumen y el peso tumoral. No se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de LIT o de subpoblaciones de células inmunitarias en los tumores de animales tratados con JNJ28. Sin embargo, este compuesto incrementó el porcentaje de linfocitos T CD4+ en GLDT respecto del correspondiente en los animales no tratados. La mayor concentración utilizada del agonista (5 mg/kg) no modificó el crecimiento tumoral, pero aumentó el porcentaje de células T regulatorias en GLDT junto con un aumento en la producción de la citoquina IL-10 y una reducción de los niveles de IFN? en medios condicionados de tumor. Por el contrario, el antagonista del RH4 JNJ77 produjo una reducción del porcentaje de linfocitos T CD4+ en tumor acompañada de una disminución del porcentaje de las células T regulatorias en GLDT. Estos resultados sugieren que la activación del RH4 produce un efecto inmunosupresor que podría explicar parcialmente el resultado terapéutico no efectivo del tratamiento con el agonista RH4 JNJ28 en la concentración más alta (5 mg/kg). Hipotetizamos que, en este caso, en el balance podría prevalecer la acción inmunosupresora sobre el efecto antiproliferativo directo sobre las células tumorales. Para comprender mejor el papel inmunomodulador del RH4, se estudió el efecto exclusivo del RH4 expresado en células involucradas en la inmunidad antitumoral en el modelo de CMTN desarrollado en ratones que no expresan el RH4 (Knockout, KO) en comparación con los ratones de tipo salvaje (wild-type, WT). Los ratones KO mostraron tumores de menor tamaño y peso, disminución del número de metástasis pulmonares y del porcentaje de células T CD4+ que infiltran el tumor, mientras que exhibieron un mayor infiltrado de células NK y linfocitos B CD19+ respecto de los tumores desarrollado en animales WT. El GLDT de los ratones KO mostró una disminución de las células T CD4+ y de la subpoblación de las células T regulatorias junto a un mayor porcentaje de células NK. Estos resultados demuestran el papel crítico de la histamina endógena y la activación del RH4 expresado en células del microambiente tumoral, en el desarrollo y la progresión como así también en la inmunidad antitumoral del CMTN. Finalmente, con el objetivo de verificar si el efecto inmunomodulador del RH4 podría observarse en otro modelo de cáncer de mama, se inocularon ratones BALB/c WT y KO con la línea de adenocarcinoma mamario murino LM3 (ErbB-2 positivo) y se evaluó el compartimento de los linfocitos T CD4+ en tumores y ganglios linfáticos. Aunque no hubo diferencias en el peso de los tumores, los resultados mostraron que también en este modelo, el porcentaje de células T regulatorias disminuyó significativamente en los GLDT en animales deficientes para el RH4. Hasta dónde llega nuestro conocimiento, este sería el primer reporte que demuestra la participación del RH4 en la inmunidad antitumoral. En conjunto los resultados sugieren una acción dual del RH4 en este modelo de cáncer de mama. Por un lado, produciendo un efecto antiproliferativo directo sobre las células tumorales y por otro, un efecto inmunosupresor, lo que resalta la complejidad de la patología oncológica. Además, estos indican que principalmente la histamina podría representar un potencial agente terapéutico en CMTN, como tratamiento único o incluso como terapia combinada.

Descripción: Las inmunofilinas son proteínas con actividad enzimática de peptidilprolyl-isomerasa que unen drogas inmunosupresoras. La inmunofilina FKBP51 forma complejos con la chaperona HSP90 y une al macrólido FK506. En este trabajo, demostramos que FKBP51 es una fosfoproteína cuyo grado de fosforilación condiciona su localización subcelular, siendo ello regulado por balance hormonal. Una importante fracción subcelular de FKBP51 es mitocondrial, migra al núcleo por estrés, cumple funciones antiapoptóticas, y es sobreexpresada por células tumorales. La subunidad hTERT de telomerasa también es una proteína-cliente de HSP90 fuertemente inducida en células cancerosas. Demostramos que FKBP51 co-inmunoprecipita con complejos hTERT?HSP90. Tanto el inhibidor de HSP90 radicicol como la sobreexpresión del dominio TPR de FKBP51 (el interactuante con HSP90) favorecen la relocalización citoplásmica de hTERT. La actividad enzimática de telomerasa es significativamente mejorada por FKBP51. Tratamientos de células tumorales con FK506 muestran una disminución de la vibilidad celular, y tratamientos de ratones Scid/Nod portando tumores xenográficos con FK506 mostraron una significativa reducción del crecimiento tumoral. Como FK506 muestra afinidad por otras inmunofilinas, ensayamos a una nueva droga sintética que es selectiva para FKBP51, SAFit1, la que mostró resultados similares. Estos estudios demuestran que FKBP51 es un nuevo factor antiapoptótico relacionado con el desarrollo tumoral.

Descripción: Se estudiaron los mecanismos antioxidantes y antihipertensivos del flavanol (?)-epicatequina, abundante en la dieta humana.In vitro se demostró que la capacidad de (?)-epicatequina atrapando radical alcoxilo y anión superóxido (mecanismo antioxidante directo)es alta, pero poco relevante comparadacon la deotroscompuestos a las concentraciones habituales en los tejidos. La (?)-epicatequina ejerció un efecto vasodilatador en aorta aislada, pero no significativo a la concentración que el compuesto alcanza en sangre. In vivo, en modelos experimentales de incremento de presión arterial en ratas por administración de L-NAME o por sobrecarga de fructosa, la (?)-epicatequina previno el aumento en presión arterial producido por los tratamientosa través del restablecimiento de la biodisponibilidad de óxido nítrico (NO)en aorta a valores controles asociado a: i) mayor actividad de NOsintasa, sin modificación en expresión de NO sintasa endotelial (con mayor fosforilación de Ser1177 y normalización de caveolina-1, en el modelo de fructosa) y ii) prevención del estrés oxidativo mediado por NADPH-oxidasa, regulando la expresión de p47phox (y de p22phox en el modelo de fructosa). Se concluye que la acción antihipertensiva de la (?)-epicatequina no involucra, al menos exclusivamente, mecanismos antioxidantes directos sino un conjunto de mecanismos antioxidantes indirectos.

Descripción: En los últimos años, ha cobrado importancia el estudio de los contaminantes ambientales en relación al desarrollo de cáncer, en especial para el cáncer de mama, debido a que muchos de los plaguicidas de uso corriente pueden actuar como disruptores endócrinos (DEs), afectando la fisiología de la glándula mamaria. En este trabajo, demostramos que bajas concentraciones del plaguicida organofosforado clorpirifos (CPF) inducen la proliferación de la línea celular MCF-7 en forma dependiente del RE?, mientras que, concentraciones mayores, conducen a una disminución de la capacidad clonogénica celular mediada por un incremento en los niveles de ERO y la fosforilación de la proteína ERK1/2. Asimismo, el CPF modificó la histología de la glándula mamaria de rata conduciendo a la aparición de lesiones proliferativas como la adenosis y la hiperplasia ductal, afectó el sistema endócrino modificando los niveles circulantes de las hormonas esteroideas e hipofisarias y alterando la esteroidogénesis ovárica. Finalmente, evidenciamos un efecto estimulante del CPF sobre la carcinogénesis mamaria mediante estudios en un modelo experimental en rata. Nuestros resultados aportan nueva información acerca de los mecanismos de acción del plaguicida CPF en las células mamarias. Además de interferir con el metabolismo redox, el CPF regula la activación de diferentes vías de señalización, desregula el sistema endócrino, modifica la histología del tejido mamario y afecta la carcinogénesis en este tejido.

Descripción: Biomphalaria tenagophila (d´Orbigny, 1835), es un vector de la esquistosomiasis mansónica en América del Sur. Argentina no presenta casos autóctonos de esquistosomiasis, pero la Provincia de Misiones, que limita con los Estados Brasileños de Paraná, Santa Catarina y Río Grande si poseen; además, tiene el clima favorable, las condiciones socio-económicas y la presencia de Biomphalaria tenagophila que pueden favorecer la propagación de la enfermedad. La esquistosomiasis se controlar por métodos quimioterapéuticos pero presentan inconvenientes tales como elevados costos y no evita la reinfección. La OMS prioriza el empleo de molusquicidas de origen vegetal para su control por el bajo costo y biodegradabilidad. Lemma, A. 1970 comprobó la propiedad molusquicida de Phytolacca dodecandra L?Herit sobre Biomphalaria pfeifferi ruppellii (Dunker). Como no se conoce el efecto molusquicida de Phytolacca dioica L sobre Biomphalaria tenagophila; se resolvió investigar dicha propiedad siguiendo a Lemma 1970 y WHO 1961 para los órganos crudos y decocciones, determinándose el LD50 y LD90 en los distintos estadio de su ciclo vital. Como resultado se pudo determinar que los cocimientos de hojas, frutos y flores tienes efecto molusquicida sobre Biomphalaria tenagophila. Así, se contaría con un medio adecuado para controlar el avance de la enfermedad.

Descripción: La enfermedad de Chagas, la leishmaniasis y el cáncer son tres patologías que afectan a millones de personas causando una gran carga ecónomico-sanitaria en relación a su morbi-mortalidad. Las diferentes quimioterapias disponibles para su tratamiento comparten muchos inconvenientes y es por ello que se necesitan nuevas drogas. Los productos naturales han sido una fuente productiva de moléculas líderes para el desarrollo de fármacos, en especial, aquellos metabolitos secundarios provenientes del reino vegetal. El objetivo del presente trabajo fue obtener compuestos bioactivos frente a Trypanosoma cruzi, Leishmania mexicana y células tumorales a partir de especies vegetales que crecen en nuestro país. La selección de las plantas se llevó a cabo según un criterio quimiotaxónomico. Se eligieron tres especies vegetales de la familia Asteraceae (Smallanthus sonchifolius, Vernonia rubricaulis y Vernonia scorpioides) por su composición fitoquímica, principalmente lactonas sesquiterpénicas (SLs). A partir del material vegetal se obtuvieron diferentes extractos acuosos y orgánicos y se evaluó su actividad tripanocida in vitro frente a epimastigotes de T. cruzi. A partir de los extractos orgánicos, que resultaron más activos (inhibición del crecimiento mayor al 75% a 100 ?g/ml), se llevaron a cabo sendos fraccionamientos guiados por bioensayo de actividad anti-T. cruzi. De los extractos orgánicos obtenidos a partir de V. rubricaulis y V. scorpioides se identificaron las fracciones y subfracciones más activas in vitro frente a epimastigotes de T. cruzi y se caracterizó su composición por técnicas cromatográficas. El fraccionamiento guiado por bioensayo del extracto orgánico obtenido a partir de las hojas de S. sonchifolius (clon LIEY 97-2) permitió identificar las fracciones más activas in vitro frente a epimastigotes de T. cruzi. A partir de ellas se aislaron 5 compuestos (1 - 5) con una pureza mayor al 90% que fue determinada por cromatografía instrumental. Los compuestos aislados (1 ? 5) fueron identificados por técnicas espectroscópicas como las SLs uvedalina (1), polimatina B (2), enhidrina (3), sonchifolina (4), que son metabolitos conocidos de S. sonchifolius. La SL 5 fue identificada como 8?-angeloiloxi-9?-hidroxi-14-oxo-acantospermólido, la cual no ha sido previamente aislada de fuentes naturales y por lo tanto se trata de un nuevo compuesto identificado por primera vez en la naturaleza. A partir de S. sonchifolius (clon LIEY 97-1) mediante un aislamiento dirigido se aisló otra SL conocida como fluctuanina (6). Todas estas lactonas pertenecen al grupo de los germacranólidos del tipo melampólido. Con el objetivo de aislar mayor cantidad de fluctuanina (6) se purificó por medio de técnicas cromatográficas una mezcla semipurificada de lactonas obtenida de Smallanthus connatus. Así, además de fluctuanina (6) se obtuvieron la mezcla ? compuesta por fluctuanina (6) y su derivado 2-metilbutirato; y la mezcla ? compuesta por fluctuanina (6), uvedalina (1) y otra SL que no pudo ser identificada aún. Se determinó la actividad in vitro de los compuestos puros así como de las mezclas ? y ? sobre T. cruzi. Los ensayos sobre la forma epimastigote (cepa RA) mostraron que uvedalina, polimatina B, enhidrina, sonchifolina y fluctuanina son activos frente a este estadio con valores de concentración inhibitoria 50% (CI50) menores a 8 ?M. Las mezclas ? y ? también son activas frente a epimastigotes de T. cruzi de esta misma cepa (CI50 < 0,25 ?g/ml). Por otra parte, uvedalina, polimatina B y enhidrina mostraron ser activas frente a otra cepa (Dm28c) con CI50 menores a 1,5 ?M. Uvedalina y enhidrina fueron menos activas frente a tripomastigotes de T. cruzi que frente a los epimastigotes (CI50 = 25,0 ?M y 33,4 ?M, respectivamente) y polimatina B no mostró actividad a las concentraciones y condiciones ensayadas. Sin embargo, las SLs uvedalina, polimatina B, enhidrina y fluctuanina resultaron activas sobre la forma intracelular del parásito con CI50 < 10 ?M. Las mezclas ? y ? fueron también activas (CI50 < 0,8 ?g/ml). La citotoxicidad de estos compuestos se evaluó frente a células de mamífero (Vero y células mononucleares de sangre periférica) y se observó que las lactonas 1 ? 6 presentan selectividad hacia los parásitos (concentraciones citotóxicas 50% > 20 ?M). De acuerdo a estos resultados, se evaluó la actividad in vivo, en un modelo murino agudo de enfermedad de Chagas, de los compuestos más activos in vitro: uvedalina y enhidrina. Se observó que los ratones tratados mostraron mejorías respectos al grupo control de manera similar a los ratones tratados con benznidazol. Se determinó también la toxicidad hepática de estos compuestos en un modelo murino. Asimismo se determinó el efecto in vitro de uvedalina, polimatina B y enhidrina sobre L. mexicana. Las tres lactonas fueron activas frente a la forma promastigote (CI50 < 1,1 ?M) mientras que uvedalina y enhidrina inhibieron también el crecimiento de la forma amastigote (CI50 < 4 ?M). Por medio de microscopia electrónica de transmisión se analizó el efecto de uvedalina, polimatina B y enhidrina sobre la utraestructura de T. cruzi y L. mexicana, observándose marcadas alteraciones en ambos parásitos incluyendo hinchamiento mitocondrial, y formación de vesículas multilamelares. El efecto citotóxico de las SLs 1 ? 6 se evaluó in vitro sobre tres líneas celulares tumorales pancreáticas y leucémicas. Todas las lactonas mostraron actividad siendo polimatina B y fluctuanina las más activas (CI50 = 0,6 ? 4,4 ?M). Se estudiaron los posibles mecanismos de acción de polimatina B sobre las líneas celulares observándose que el mecanismo de muerte celular es céluladependiente, y que se ve involucrado más de un tipo de muerte celular. Los resultados obtenidos muestran que las lactonas sesquiterpénicas aisladas de S. sonchifolius poseen potencial como moléculas líderes para el desarrollo de fármacos con actividad antiparasitaria y antitumoral.

Descripción: La búsqueda de nuevos antivirales es una necesidad actual y constante. Una estrategia para la identificación de nuevos compuestos bioactivos es el estudio de los metabolitos secundarios presentes en la flora mundial. El objetivo principal de este trabajo de tesis fue la búsqueda de nuevos compuestos con actividad antiviral en diferentes plantas medicinales argentinas frente a diversos virus de interés clínico, como ser poliovirus y herpes simplex virus. Para ello, se realizó un screening de actividad antiviral en dos extractos diferentes, un extracto orgánico (EO) y un extracto acuoso (EA), de siete especies argentinas de la familia Asteraceae: Baccharis gaudichaudiana, B. spicata, Bidens subalternans, Eupatorium buniifolium, Pluchea sagittalis, Tagetes minuta y Tessaria absinthioides. La concentración efectiva 50 (CE50) del EO de B. gaudichaudiana y E. buniifolium frente a PV-2 fueron de 14,8 ± 1,5 ?g/ml y 9,5 ± 3,5 ?g/ml; respectivamente, valores que justificaron su fraccionamiento bioguiado frente a PV para la identificación de el/los compuesto/s responsables de la actividad antiviral observada. A partir del EO de B. gaudichaudiana, fue posible el aislamiento e identificación de un flavonoide conocido, la apigenina, previamente ya reportado en esta especie. La actividad antiviral de este compuesto fue de CE50= 12,2 ± 3,3 ?M. A partir de E. buniifolium se aisló un benzofurano, la euparina, cuya CE50 frente a PV-2 fue de 0,6 ± 0,2 ?M. Del estudio del mecanismo de acción de la euparina, se pudo demostrar que su mecanismo de acción era la interferencia en la etapa de penetración y/o desnudamiento del virus y el blanco de acción fue el sitio hidrofóbico conocido como pocket hidrofóbico en la cápside viral, localizado por debajo de la región del canyon. La selección de mutantes resistentes y dependientes a la euparina, y su caracterización biológica permitió demostrar las mutaciones asociadas a cada fenotipo localizadas en las diferentes proteínas de la cápside viral. Los resultados obtenidos en este trabajo de tesis, aportan al conocimiento de las especies medicinales estudiadas respecto a su potencial antiviral e identifica a la euparina como un inhibidor de cápside, altamente selectivo para los tres tipos de poliovirus humano.

Descripción: El virus de la diarrea viral bovina (BVDV) es un patógeno importante del ganado bovino de gran impacto económico, por lo que la identificación de antivirales para el tratamiento de las infecciones y control de los brotes por BVDV resulta de interés. Mediante fármaco-modulación de 5,6-TSC, un compuesto previamente identificado como un inhibidor no nucleosídico (INN) de la ARN-polimerasa (RdRp) de BVDV, se sintetizaron una serie de tiosemicarbazonas (TSC) y N4-ariltiosemicarbazonas derivadas de 1-indanonas. A partir de esto, en este trabajo de tesis se identificaron dos compuestos con mayor actividad anti-BVDV: N4-(p-nitrofenil)-TSC derivada de la 5,6-dimetoxi-1-indanona (N4-TSC) y la TSC derivada de 6-nitro-1-indanona (6NO2-TSC), que fueron activos frente a BVDV de distintos genotipos y biotipos e inactivos frente a otros ARN virus. Se demostró que estos compuestos actúan en etapas intermedias del ciclo de replicación viral. Particularmente, N4-TSC actúa inhibiendo la síntesis del ARN viral, y mediante la selección de BVDV resistentes (N4-TSCR) se identificó a la RdRp como el blanco de acción. Mediante estudios de docking y dinámica molecular se demostró que las mutaciones encontradas en N4-TSCR (N264D y A392E) alteran la interacción de N4-TSC con RdRp y son responsables de la resistencia antiviral.

Descripción: Los pueblos indígenas del nordeste argentino (NEA) se hallan por lo común en estrecho contacto con la naturaleza, dependiendo de ella, en gran parte, para su subsistencia. Por lo que poseen un profundo conocimiento de las propiedades medicinales de las plantas. Este conocimiento ha sido practicado, documentado y transmitido a través de generaciones, y permitió a la industria farmacéutica desarrollar gran cantidad de fármacos. Para ello, las propiedades medicinales de las plantas deben someterse a un proceso de validación científica en términos de eficacia, seguridad y calidad. Estos tres conceptos rigen la actual terapéutica del siglo XXI inherente a cualquier fármaco convencional. Y permite que las plantas medicinales puedan intervenir en el desarrollo y avance de la medicina moderna, sirviendo como punto de partida para el desarrollo de nuevos fármacos. Determinadas plantas son utilizadas por los indígenas del NEA para el tratamiento de diversas enfermedades. Entre ellas, el uso de "tapekué", nombre vulgar de Acanthospermum australe (Loefl.) Kuntze y de ?carnicera?, nombre vulgar de Conyza bonariensis (L.) Cronquist, para la cura de infecciones de la piel, desinfección de heridas y úlceras, entre otras afecciones dérmicas. Las infecciones de piel y partes blandas (IPPB) son una razón común de consulta en los centros de atención primaria de salud. Son entidades clínicas de presentación, etiología y gravedad variables que implican una invasión microbiana de las capas de la piel y los tejidos blandos, que van desde infecciones leves hasta infecciones potencialmente mortales. Las bacterias más comunes implicadas en IPPB son Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus, mientras que las infecciones fúngicas superficiales son causadas principalmente por especies de Candida, Malassezia y dermatofitos. La mayoría de los habitantes del NEA viven en un contexto económicamente desfavorable en cuanto a sus posibilidades para acceder a los fármacos. Ante esta barrera, recurren a los conocimientos de la medicina tradicional para el tratamiento y cuidado de su salud. Este trabajo tuvo como objetivo: obtener y caracterizar el extracto acuoso, el extracto etanólico y el aceite esencial de hojas de tapekué y carnicera del NEA; determinar si los extractos y aceites esenciales no eran citotóxicos a las concentraciones necesarias para inhibir el crecimiento microbiano; evaluar su actividad inhibitoria in vitro frente a hongos y bacterias causantes de IPPB, y determinar si la interacción entre extracto-extracto y extracto-droga (droga de uso clínico) era sinérgica. La caracterización se realizó mediante: determinación del contenido de flavonoides y fenoles totales de los extractos por métodos espectrofotométricos; determinación de la composición química de los aceites esenciales por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas; y evaluación de la actividad antioxidante de los extractos y aceites esenciales en función de la capacidad reductora de hierro y la capacidad secuestradora de radicales DPPH. La toxicidad se evaluó frente a célula mononucleares de sangre periférica. La actividad inhibitoria in vitro se evaluó mediante la determinación de la CIM de acuerdo a los documentos de referencia del CLSI, con modificaciones. Y el efecto de la interacción entre los agentes antimicrobianos se evaluó por el método del tablero de ajedrez. Los extractos acuosos y etanólicos de ambas plantas mostraron la presencia de compuestos fenólicos, siendo el contenido de fenoles y flavonoides significativamente superior en los extractos etanólicos. Por otro lado, los principales componentes del aceite esencial de hojas de C. bonariensis fueron limoneno, espatulenol y ?-curcumeno. Mientras que los principales componentes del aceite esencial de hojas de A. australe fueron germacreno A, ?-cadineno y trans-cariofileno. La evaluación de la actividad antioxidante mostró que los extractos acuosos y etanólicos de ambas plantas presentaban valores significativamente superiores de actividad antioxidante en comparación con sus respectivos aceites esenciales. El ensayo de citotoxicidad evidenció que los extractos y aceites esenciales no son tóxicos a las concentraciones ensayadas para inhibir el crecimiento microbiano. De acuerdo con el criterio establecido, los extractos acuosos y etanólicos de ambas plantas fueron inactivos frente a los microorganismos ensayados. Por el contrario, el aceite esencial de tapekué mostró una fuerte actividad frente a Epidermophyton floccosum y Microsporum canis; moderada actividad frente a Malassezia globosa; baja actividad frente a Microsporum gypseum y Trichophyton tonsurans; e inactivo frente a los demás microorganismos ensayados. Por su parte, el aceite esencial de carnicera mostró una fuerte actividad frente a todos los dermatofitos y M. globosa; baja actividad frente a Malassezia furfur; e inactivo frente a los demás microorganismos. De acuerdo al método del tablero de ajedrez, la única combinación que presentó efecto sinérgico frente a Malassezia fue la combinación entre el aceite esencial de carnicera con el aceite esencial de tapekué. Las combinaciones entre ambos aceites esenciales y de cada aceite esencial con ketoconazol mostraron efectos sinérgicos frente a M. canis, M. gypseum, E. floccosum y T. tonsurans. Mientras que la mayoría de las combinaciones con terbinafina mostraron efectos de no interacción, excepto con el aceite esencial de carnicera frente a M. canis y M. gypseum, que presentó efecto sinérgico. Los resultados obtenidos proporcionan la evidencia científica que avala el uso ancestral de hojas de tapekué y carnicera para el tratamiento de las dermatofitosis y la pitiriasis versicolor, además de justificar el uso tradicional de combinaciones de plantas medicinales.

Descripción: S. aureus coloniza asintomáticamente a más del 20% de la población sana y es el agente causal de un amplio espectro de infecciones, tanto intrahospitalarias como adquiridas en la comunidad. Tal versatilidad se debe a la adaptación de S. aureus a vivir en un entorno dinámico donde varía la disponibilidad de nutrientes y la presencia de varias moléculas. Frente a condiciones hostiles S. aureus puede formar biopelículas lo que hace refractarias al tratamiento a las infecciones con estas características. La matriz extracelular que encierra a la comunidad bacteriana está constituida por el polisacárido intercelular de adhesión (PIA), proteínas de superficie y el ADN extracelular liberado por la autolisis. La formación de biopelícula por S. aureus está sujeta a una regulación compleja y aún no dilucidada en su totalidad. En este trabajo se propuso estudiar el efecto de señales del microambiente, como el ácido salicílico (SAL) y concentraciones subinhibitorias (Csub) de vancomicina (VAN) o ciprofloxacina (CIP), sobre los principales factores y reguladores de S. aureus involucrados en la formación de biopelícula y su implicancia como estrategia adaptativa hacia la persistencia de la bacteria en el hospedador. Al respecto, la disminución de la biodisponibilidad de hierro por acción del SAL contribuyó al incremento de la síntesis del exopolisacárido PIA, debido al descenso de la actividad del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) y al direccionamiento del metabolismo hacia la ruta fermentativa del lactato. Asimismo, el SAL provocó la disminución transcripcional de codY (regulador negativo de los genes que codifican para formar el PIA) y de los genes del sistema agr (regulador positivo de moléculas encargadas del desensamble de la biopelícula). Por medio de estos mecanismos, el SAL indujo el aumento de la biomasa de las biopelículas formadas por cepas de S. aureus relacionadas a los linajes genéticos USA100 y USA300 independientemente de la sensibilidad a la meticilina. Por lo cual, si bien el SAL aumentó la biomasa de las biopelículas de S. aureus, evita la dispersión de las bacterias que la conforman y por ende la posible generación de nuevos focos de infección. Además, la presencia del SAL propició el aumento de la colonización de este patógeno en narinas murinas debido a la generación de un fenotipo bacteriano más adherente. Por su parte, la VAN y la CIP en bajas concentraciones afectaron la formación de biopelícula de un modo cepa-dependiente. La inducción de la biomasa de la biopelícula por acción de Csub de ambos antibióticos, ocurrió por mecanismos que involucran principalmente el incremento de adhesinas. Al respecto, ambos antibióticos incrementaron la transcripción de sae, el cual regula positivamente la expresión de diversas adhesinas. Además, la VAN afectó negativamente al regulador MgrA el cual reprime la expresión de adhesinas. S. aureus responde a la acción de éstas señales adoptando una forma de vida sésil más robusta, al adaptar el metabolismo, la expresión de factores de virulencia y la red regulatoria de forma dinámica. Dicha respuesta podría modificar el curso de las infecciones causadas por S. aureus y conducir a la persistencia o cronicidad. A través de este trabajo se comprenden los mecanismos por los cuales S. aureus incrementa la biopelícula, aportando una pieza de conocimiento importante para ulteriores investigaciones basadas en el diseño de compuestos o estrategias que bloqueen o interfieran con el/los principal/es actor/es que participan en la formación de la biopelícula.

Descripción: Las hormonas tiroideas (TH) coordinan muchas respuestas fisiológicas y procesos madurativos durante el desarrollo; sin embargo, todavía no se conocen claramente los mecanismos por los cuales su deficiencia conduce a alteraciones en el mismo. Las mitocondrias juegan un papel esencial en la fisiología celular como productoras de energía y actuando como organelas de señalización, y su actividad y estructura se ve altamente regulada por la acción de TH. En trabajos previos en nuestro laboratorio, observamos que el hipotiroidismo condujo a un confinamiento de la enzima óxido nítrico sintasa neuronal en mitocondrias y que el aumento del óxido nítrico (NO) mitocondrial se asocia a la disminución del metabolismo basal observado en el hipotiroidismo. Además de los cambios metabólicos producidos por el NO, el aumento matrical del mismo en mitocondria conduce a un aumento en los niveles de oxidantes y la activación de vías de señalización asociadas a proliferación, diferenciación o muerte celular. La hipótesis de este trabajo se basa en que la modulación positiva de la mtNOS en el desarrollo de la rata hipotiroidea y el concomitante aumento de NO mitocondrial podrían estar ligados a las alteraciones en el crecimiento observadas frente a la deficiencia de hormonas tiroideas durante el periodo perinatal, que en humanos, resulta en el retardo físico y mental, conocido como cretinismo. En esta tesis nos propusimos analizar la utilización mitocondrial de NO como causa de alteraciones moleculares y fenotípicas definitivas en el hipotiroidismo neonatal. Nuestros estudios en hígado y cerebro de rata confirmaron que el hipotiroidismo congénito conduce a una modificación del patrón de expresión de la enzima óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS) y su confinamiento mitocondrial respecto al desarrollo normal. Demostramos que en el hígado de rata, el hipotiroidismo alteró el metabolismo oxidativo a través del incremento de NO mitocondrial y estimuló la transcripción temprana de mitofusina 2 y tardía de Drp1, proteínas involucradas en la dinámica mitocondrial pero no afectó su localización mitocondrial. En este órgano la respuesta que ejerce el NO sobre la actividad de los complejos de la cadena respiratoria y la producción de oxidantes parece estar más relacionada a un efecto metabólico generado por la deficiencia de HT. Comprobamos que en el desarrollo perinatal del cerebro de rata, el incremento de NO mitocondrial se efectúa de forma temprana, y a través de la producción de ROS, aumenta la expresión de la proteína de fisión mitocondrial Drp1, la activación de JNK en la etapa perinatal tardía y la liberación de citocromo c al citosol que iniciaría la apoptosis por la vía mitocondrial. Estos resultados nos condujeron al análisis de apoptosis y proliferación hipocampales mediante las técnicas histológicas de BrdU y TUNEL donde se comprobó que el hipotiroidismo congénito generó una modificación del patrón apoptótico/proliferativo en el hipocampo de cerebro consecuente temporalmente con la liberación de ciotcromo c. En los días 5 y 30 perinatales los animales hipotiroideos presentaron aumento en la apoptosis hipocampal respecto al desarrollo eutiroideo. Comprobamos que el tratamiento de los mismos con el inhibidor de la producción de NO fue capaz de revertir tanto la apoptosis observada a nivel mitocondrial como la muerte de células de hipocampo. Finalmente, ensayando la expresión de genes de estrés involucrados en el establecimiento de la memoria y aprendizaje comprobamos que se ven modificados por el hipotiroidismo en forma NO dependiente, y que finalmente algunos de los trastornos conductuales del hipotiroidismo como ansiedad y memoria espacial pueden ser regulados por el NO y revertidos por el tratamiento con inhibidor. Estos hallazgos nos permiten establecer nuevos mecanismos de acción para el NO mitocondrial en vías de señalización específicas durante el desarrollo perinatal en el hipotiroidismo congénito.

Descripción: La toxina Shiga 2 (Stx2) liberada por Escherichia coli productora de Stx (STEC) produce diarrea, colitis hemorrágica, síndrome urémico hemolítico (SUH) y encefalopatía. El índice de mortalidad por SUH aumenta significativamente cuando se involucra el sistema nervioso central (SNC). STEC secreta LPS y Stx2. Por lo tanto, se utilizó un modelo in vivo (modelo murino) e in vitro (cultivos primarios de células microgliales de ratas) con el objetivo de determinar los efectos sub letales de Stx2 sobre el SNC, la contribución del LPS y el rol de la microglía en la encefalopatía. Stx2 produjo déficits cognitivos, alteración en la unidad neurovascular del área CA1 del hipocampo, peroxidación lipídica, liberación de citoquinas pro-inflamatorias y activación de la vía de señalización de NF-kB independiente de ERK 1/2. Además, se reportó por primera vez que la microglía expresa el receptor Gb3, que al activarse participa del proceso inflamatorio por medio de la liberación de citoquinas y del aumento de la actividad fagocítica. Todos estos resultados se agravaron con LPS. En conclusión, esta tesis determinó que Stx2 produjo un daño directo en las células del parénquima cerebral y un daño indirecto por medio de un proceso inflamatorio siendo la microglía la célula pivotal en este proceso.

Descripción: El término insuficiencia hepática, independientemente de su etiología, se define como la claudicación en las funciones del hígado que resulta en un amplio espectro de alteraciones clínicas, bioquímicas y neurofisiológicas. La enfermedad hepática puede presentarse de forma aguda o crónica. La etapa crónica, y con menor frecuencia la aguda, tiene como complicaciones de mayor importancia el síndrome de Hipertensión Portal y la Encefalopatía Hepática. La Encefalopatía Hepática es un cuadro clínico sobre el cual la ciencia médica ha tenido menos control que sobre otras patologías que surgen como complicaciones de la cirrosis hepática. Se define a la Encefalopatía Hepática como un síndrome potencialmente reversible que se manifiesta por un amplio espectro de alteraciones en la conciencia, que pueden ir desde sutiles cambios en el comportamiento hasta el coma profundo y la muerte. Este síndrome neuropsiquiátrico es secundario a una disfunción hepatocelular, al desarrollo de circuitos porto-sistémicos o a una combinación de ambos. El cuadro clínico es complejo y puede afectar a cualquier área cerebral. La alteración es una reacción mental orgánica con un trastorno neurológico y psiquiátrico. Un hallazgo importante es la variabilidad, especialmente en las formas crónicas. Los hallazgos dependen de la naturaleza e intensidad de los factores etiológicos y predisponentes. Actualmente, se considera a la Encefalopatía Hepática un gran desafío intelectual en los diferentes campos de la medicina debido a su cuadro clínico variado, a su fisiopatología compleja, a la multiplicidad de factores precipitantes, a la carencia de un fenómeno causal único, así como también debido a la falta de estudios complementarios confirmatorios y diagnósticos. La Encefalopatía Hepática Mínima es un estadio subclínico que presenta un desarrollo fisiopatológico crónico asociado a un proceso adaptativo cerebral. El estudio exhaustivo de la Encefalopatía Hepática Mínima es una herramienta de gran utilidad para identificar las vías que inician o desencadenan los mecanismos fisiopatológicos que posteriormente se interrelacionan en los estadios avanzados. Una vez disparada esta interrelación se establece una condición muy compleja que dificulta el poder dilucidar cuál ha sido el mecanismo o su vía iniciadora. La presente Tesis Doctoral tuvo como objetivo principal estudiar las alteraciones tempranas del Sistema Nervioso Central en un modelo experimental de Hipertensión Portal Prehepática y caracterizar la Encefalopatía Hepática Mínima inducida por la Ligadura Parcial de la Vena Porta, a partir de un estudio morfológico y funcional a nivel neuronal, astrocitario y vascular. Por primera vez, en esta Tesis, en un modelo experimental de Encefalopatía Hepática Mínima, se describen alteraciones estructurales y funcionales en el hipocampo y en la corteza cerebral de animales con de Hipertensión Portal Prehepática y Encefalopatía Hepática Mínima. A los 10 días de la cirugía, el grupo de animales con Encefalopatía Hepática Mínima inducida por la Ligadura Parcial de la Vena Porta cumple con las características principales de la Encefalopatía Hepática de tipo B asociada con derivaciones porto-sistémicas sin enfermedad hepatocelular intrínseca. Los hallazgos descriptos en esta Tesis Doctoral sugieren que en la Encefalopatía Hepática Mínima inducida por la Ligadura Parcial de la Vena Porta, existen alteraciones a nivel del Sistema Nervioso Central que son focales y diferenciales según la zona afectada y que se encuentran asociadas con la hiperamonemia moderada, característica principal de la Encefalopatía Hepática. Comprender la patogénesis de la Encefalopatía Hepática Mínima proporcionaría un marco teórico que aportaría a la comprensión de la fisiopatología de la Encefalopatía Hepática con el fin de encontrar un marcador bioquímico precoz. Además aportaría en gran medida al desarrollo de terapéuticas adecuadas para su diagnóstico y tratamiento.

Descripción: Un desafío importante para la investigación es comprender las diferencias neuroadaptativas entre el uso controlado de drogas y la pérdida del control. La cafeína es la droga psicoactiva más popular y también es un adulterante que se encuentra en muchas drogas de abuso. Nuestros resultados muestran que la ingesta de cafeína y cocaína produce sensibilización locomotora y aumento de la astrogliosis en el estriado, corteza prefrontal y motora del ratón después de un tratamiento crónico además de cambios en la expresión génica de receptores de distintos sistemas de neurotransmisión. A nivel de órganos periféricos, los resultados de esta Tesis proporcionan evidencia de hepatotoxicidad y cambios en la expresión de la enzima productora de dopamina y sus receptores, en testículo. Mediante la prueba de condicionamiento de preferencia de lugar (CPP), la combinación de las drogas indujo un cambio de preferencia y un aumento en la locomoción en comparación con la cocaína solamente. El análisis de expresión génica luego de la prueba de CPP reveló un aumento específico en el grupo que recibió la combinación de drogas en genes de expresión temprana en el cerebro, sugiriendo cambios adaptativos inducidos por el contexto asociado a las drogas específico de la combinación cocaína-cafeína.

Descripción: El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de terapias combinadas de nanoquimoterapéuticos con mifepristona (MFP) utilizando modelos experimentales que expresan distintas relaciones de isoformas A y B del receptor de progesterona (RP). Demostramos utilizando el modelo de carcinomas mamarios murinos inducidos por MPA y xenoinjertos de las líneas celulares T47D modificadas para expresar sólo RPA o RPB, que MFP mejora los efectos terapéuticos de liposomas pegilados de doxorubicina (DOX) o de paclitaxel (PAX) unido a albúmina, sólo en los tumores con niveles mayores de la isoforma A (RPA) que de la isoforma B del RP (RPB). En estos tumores MFP incrementa la remodelación tisular y el número de vasos funcionales favoreciendo la acumulación de drogas en el tumor. En estudios preliminares utilizando cultivos tisulares de cáncer de mama humano con distinta relación RPA/RPB no se observaron efectos aditivos de MFP y DOX corroborando los resultados obtenidos con los modelos in vivo. Se observó asimismo que los tumores con niveles de expresión de RPA ? RPB serían más sensibles a DOX que los de proporción opuesta quienes son más sensibles al PAX. Postulamos que MFP podría ser utilizada junto con nanoquimioterápicos en carcinomas mamarios con RPA?RPB.

Descripción: Los agentes quimioterapéuticos empleados en el tratamiento de la enfermedad de Chagas luego del período agudo son poco efectivos y con graves efectos secundarios por lo que es prioritario el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para controlar la infección. En este trabajo de tesis evaluamos la inmunoterapia con el ADN de Cruzipaína (Cz) para controlar una infección en ratones infectados con T. cruzi. Se evaluaron tratamientos con plásmido desnudo (d) por vía intramuscular, y por vía oral usando Salmonella (S) como sistema de transporte de los antígenos; tanto en etapas tempranas como tardías de la infección. La coadministración de Cz+GM-CSF, por ambas vías logró reducir la parasitemia, aumentando la sobrevida con incremento de la respuesta humoral y celular, esencial para la protección del daño en tejidos musculares. Ambas vacunas dCz+dGM-CSF y SCz+SGM-CSF, al ser aplicadas durante la etapa crónica de la infección desencadenaron una fuerte respuesta celular y una mejora en el estado general de los tejidos musculares, respecto a los controles que presentaban daños característicos de la patología chagásica. Incorporamos Chagasina (Chg), inhibidor fisiológico de Cz, en la inmunoterapia combinada SCz+SChg+SGM-CSF, logrando mejorar la eficacia protectora de Cz+SGM-CSF, presentando menores niveles de parásitos en sangre y un mejor estado de cortes histológicos de tejidos musculares, con una menor actividad de enzimas séricas marcadoras de daño tisular. La vacuna terapéutica multicomponente SCz+SChg+SGM-CSF, aplicada durante la fase crónica de la infección, previene la patología tisular. Nuestros resultados indican que la inmunoterapia de la infección por T. cruzi con el ADN codificante para Cz, Chg y GM-CSF, tanto al ser administrado en etapas tempranas como tardías de la infección, estimula la respuesta inmune, reduce la carga parasitaria y disminuye la inflamación tisular característica de la enfermedad. El empleo de SCz+SChg+SGM-CSF podría ser una promisoria alternativa para el tratamiento de la enfermedad de Chagas.

Descripción: El grado de compromiso cardíaco de la enfermedad de Chagas crónica se asocia con el agotamiento de los linfocitos T. La IL-7 es un mediador importante para el mantenimiento y función de los linfocitos T. En este trabajo, evaluamos si la producción de IFN-? en respuesta a Trypanosoma cruzi se asocia con la expresión y funcionalidad del IL-7R. Los pacientes con células productoras de IFN-? específicas para T. cruzi mostraron mayores niveles de células T de memoria con expresión regulada del IL-7R y una respuesta eficiente a IL-7, comparado a lo hallado en pacientes sin linfocitos T parásito-específicos. La regulación del IL-7R se asoció inversamente con los niveles séricos de IL-6 y positivamente con los de IL-8. Los niveles circulantes de IL-21 e IL-27 estuvieron disminuidos en estadios menos severos. La expresión y la funcionalidad del IL-27R se asociaron con la producción de IFN-? específica para T. cruzi. La estimulación in vitro de PBMCs con IL-7 o IL-27 aumentó la producción de IFN-? en pacientes productores de IFN-?, pero no en los no productores. Las alteraciones de la vía IL-7/IL-7R podrían ser responsables de la pérdida de los linfocitos T específicos de T. cruzi durante la infección crónica.

Descripción: La OMS en el 2008 incluyó una nueva entidad provisoria, el LDGCB EBV+ del adulto mayor, en pacientes mayores de 50 años inmunocompetentes, probablemente por la inmunosenescencia inherente al envejecimiento. Nuestro objetivo fue determinar la participación del virus de EBV en la patogénesis del LDGCB en pacientes pediátricos, adultos menores y mayores de 50 años de nuestro país, y caracterizar ciertos marcadores del microambiente tumoral. Se analizaron 102 casos de LDGCB. Se realizó hibridación in situ para EBERs e inmunohistoquímica para los antígenos virales y marcadores del microambiente tumoral. Se determinó la expresión relativa de transcriptos virales y de citoquinas y quimioquinas por PCR en tiempo real y se compararon los casos EBV+ y ? en los 3 grupos. El LDGCB EBV+ (con ?20% de células tumorales EBERs+) se vio en todos los grupos etarios y prevaleció el perfil de latencia II y III junto con perfil lítico. PD-1 prevaleció en todos los LDGCB, mientras que los casos EBV+ tuvieron un aumento significativo en la población de células citotóxicas GrB+ y una tendencia a una menor sobrevida libre de eventos. El virus cumpliría un rol en la patogénesis del LDGCB EBV+ en todos los grupos etarios. Este hallazgo avala la sugerencia de revisión del criterio de edad definido por la OMS.

Descripción: La complejidad de la vagina humana hace que su microbioma cambie en periodos cortos de tiempo. El riesgo de infección y de contraer enfermedades en una mujer puede modificarse a lo largo de los años. El balance del contenido vaginal o BACOVA es el estudio morfológico integral del contenido vaginal y contribuye al control, seguimiento clínico y terapéutico de las disfunciones vaginales en laboratorios de todo tipo de complejidad. Se invitó a participar del proyecto a las mujeres en edad fértil de Posadas (Misiones), que concurrieron entre los años 2011 y 2013 al laboratorio del Instituto de Previsión Social-Misiones con el objetivo de caracterizar los estados vaginales básicos (EVBs), identificar y determinar la frecuencia de Levaduras, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis y Virus Papiloma Humano (VPH), analizar posibles asociaciones y la utilidad del BACOVA frente a estos agentes. Se estudiaron 505 muestras de mujeres que aceptaron participar, 265 correspondieron a mujeres sintomáticas incorporadas de manera consecutiva y 240 fueron asintomáticas. Ciento seis (20,99%) estaban embarazadas, y de éstas 57 presentaron síntomas. El 45,42% de las mujeres que no refirieron síntomas presentaron disfunciones vaginales. La distribución de los EVBs en mujeres sintomáticas y asintomáticas respectivamente fue: EVB I (microbiota normal) 20,75% y 54,58%; EVB II (microbiota normal con respuesta inflamatoria) 20,37% y 10,41%; EVB III (microbiota intermedia) 6,79% y 10,83%; EVB IV (vaginosis bacteriana) 26,41% y 15,83%; y EVB V (vaginitis microbiana inespecífica) 25,66% y 8,33%. El porcentaje de agentes infecciosos en mujeres sintomáticas y asintomáticas respectivamente fue: HPV 29,4% y 32,1%; Levaduras 12,5% y 4,6%; C. trachomatis 11,3% y 5,4%; y T. vaginalis 4,5% y 0,8%. En este estudio no se obtuvo desarrollo de N. gonorrhoeae en ninguna de las muestras estudiadas. La detección de levaduras se observó con mayor frecuencia en mujeres sintomáticas comparado con las asintomáticas, tanto en toda la población de estudio (p=0,002) como en las embarazadas (p=0,019). Se observó una mayor frecuencia de infección por T. vaginalis y C. trachomatis en mujeres sintomáticas y en mujeres con EVB V. La infección por HPV se asoció a mujeres con mayor número de parejas sexuales. Al genotipificar los HPV, predominaron los genotipos de alto riesgo y el más frecuente fue el HPV16 (35,13%). Los resultados de valores predictivos y de razones de verosimilitud indican la escasa utilidad del manejo sindrómico en la consulta médica para predecir correctamente la VB. Los VPP resultaron bajos para infección por T. vaginalis (6,58%), C. trachomatis (11,97%) y HPV (31,66). El VPN resultó 99,11% en la infección por T. vaginalis indicando que en presencia de EVB sin RIV la probabilidad de padecer esta infección es muy baja. Del análisis de los parámetros de exactitud de la prueba de RIV en mujeres sintomáticas y asintomáticas se observó que la mayor fuerza de esta prueba como poder discriminante, correspondió a los valores obtenidos para predecir infecciones por T. vaginalis respecto a infección por C. trachomatis o HPV. Los resultados obtenidos en el estudio de la distribución de los EVBs en muestras de mujeres atendidas en la mayor obra social de la Provincia de Misiones mostraron, una frecuencia elevada de disfunciones vaginales con predominio de vaginosis bacteriana y vaginitis microbiana inespecífica. El EVB V mostró una fuerte asociación con la infección por T. vaginalis (p<0,001, OR=19,70 IC95%=5,30-72,30) y en menor grado con C. trachomatis (p<0,001,OR=3,21 IC95%=1,64-6,25) y con levaduras (p=0,036,OR=2,15 IC95%=1,07-4,31) El BACOVA permitió una diferenciación eficaz de vaginosis y vaginitis independientemente de la presencia de síntomas clínicos en el grupo de estudio. El conocimiento epidemiológico de las disfunciones vaginales en las mujeres estudiadas contribuirá a la optimización de medidas de prevención y control de las infecciones transmitidas sexualmente y a la protección de la salud sexual y reproductiva en las mujeres afiliadas al Instituto de Previsión Social de Misiones El hallazgo de un porcentaje elevado de disfunciones vaginales sin etiología demostrada, mediante BACOVA, promueve la búsqueda de agentes de transmisión sexual. Del mismo modo sería importante avanzar en la implementación de métodos más sensibles en la investigación de T. vaginalis y en la investigación de genotipos de C. trachomatis circulantes en la región.

Descripción: El trasplante intestinal (TxI) constituye una opción terapéutica viable para pacientes con insuficiencia intestinal crónica e irreversible con complicaciones a la nutrición parenteral. Si bien la aplicación de distintos protocolos de inmunosupresión ha permitido incrementar la aplicabilidad del TxI, la incidencia del rechazo celular agudo (RCA) es mayor que en otros órganos y continúa siendo causa, tanto temprana como alejada, de pérdida del injerto y necesidad de retrasplante. En este trabajo, se investigaron los blancos celulares de la apoptosis en la cripta intestinal durante el RCA mediante inmunohistología en biopsias de pacientes TxI. Las células madre intestinales y las de Paneth permanecieron inalteradas, mientras que se evidenció mayor daño a nivel de los intermediarios de diferenciación de las células epiteliales. Además, se evaluó el rol de las células linfoides innatas subgrupo 3 (CLI3s) como reguladoras de la homeostasis intestinal mediante citometría de flujo. Dicha población no se ve afectada por la inmunosupresión y, en muestras con RCA, mostró un fenotipo proinflamatorio. Consistentemente la expresión de IL-22, citoquina fundamental en la regeneración epitelial, disminuyó. La reparación epitelial ineficiente durante el RCA, en presencia de células madre intactas, puede deberse al detrimento en la IL-22. Esto abre una opción terapéutica diferente al uso de inmunosupresores.

Descripción: El reciente hallazgo de transcriptos primarios carentes de capacidad para codificar proteínas provee una nueva perspectiva acerca de la centralidad funcional del RNA en la regulación génica. Estructuralmente, los RNAs no codificantes (ncRNA) se subdividen en dos grandes categorías: los ncRNAs pequeños (sncRNA) y ncRNAs largos (lncRNAs). Los microRNAs (miRNAs) constituyen la categoría de mayor representación dentro de los sncRNAs pudiendo regular la expresión génica y participando en diversos procesos como proliferación, apoptosis, desarrollo, diferenciación y metabolismo celular entre otros. Por otra parte, los lncRNAs, constituyen una clase novel de moléculas reguladoras ampliamente distribuidas y escasamente caracterizadas en nuestro genoma. Los mismos representan la mayor parte de nuestro transcriptoma, constituyendo importantes modificadores de la expresión génica, involucrados en numerosos procesos de nuestra economía celular. Numerosas evidencias han establecido una coordinada relación entre la expresión aberrante de miRNAs y lncRNAs en el desarrollo de numerosos tipos de cáncer. Paralelamente, el clúster SOXC constituido por SOX4, SOX11 y SOX12 integran un grupo de 20 factores de transcripción de la superfamilia HMG. SOX11 y SOX12 poseen importantes funciones en el desarrollo del sistema nervioso central, participando en el control de la proliferación celular, diferenciación y mantenimiento de la identidad celular durante la embriogénesis. Ambos genes no se expresan en tejido linfoide normales, pero se ha visto que SOX11 muestra expresión aberrante en diversos tipos de cáncer. SOX4 es el único miembro de la familia con función definida y de relevancia durante el desarrollo y diferenciación de células B. En el presente trabajo se realizó el análisis de expresión génica de los genes SOXC y del clúster miR17-92 en 70 pacientes con Linfoma de Células del Manto (LCM). En paralelo se analizó el perfil transcripcional del set completo de los 481 Transcribed Ultraconserved Regions (T-UCRs) en 85 pacientes con Leucemia Linfocítica Crónica (LLC) tratadas (T) y no tratadas (NT) in vitro con agonistas de TLRs (Toll like receptors) oligo CpG ODN2006. Asimismo se realizó una indagación exhaustiva de los perfiles transcripcionales de lncRNAs y genes codificantes en 76 pacientes con Linfoma Folicular (LF). El análisis de los clústeres SOXC y miR17-92 permitió evidenciar dos grupos de pacientes: con sobreexpresión de SOX11/SOX12/miR19b/miR92a (Clúster A) y con aumento de los niveles de SOX4/mir17/miR18a (Clúster B). La correlación con características clínicas mostró diferencias significativas en la localización ganglionar, niveles de proliferación, morfología blastoide y sobrevida más corta, con peor pronóstico para el Clúster A respecto del Clúster B, permitiendo distinguir por primera vez en LCM, pacientes asociados a un perfil de expresión de genes codificantes y no codificantes específico. El análisis transcripcional de T-UCRs en pacientes con LLC T y NT con ODN2006 permitió identificar que la expresión del lncRNA uc.70 estratifica de manera más precisa la progresión de los pacientes con LLC, tanto en individuos asociados a buen pronóstico, como aquellos asociados a una enfermedad agresiva. En relación a los patrones transcripcionales de lncRNAs y genes codificantes descubiertos en pacientes con LF, se seleccionaron lncRNAs candidatos potencialmente involucrados con vías y caminos de señalización relacionados a la agresividad y heterogeneidad de la patología, haciendo foco en lncRNAs diferencialmente expresados (DE) que pudieran ser reguladores putativos de genes codificantes DE basándose en la coexpresión de los mismos. Los hallazgos encontrados en el presente trabajo apuntan a una íntima relación entre los perfiles de expresion de ncRNAs y las patologías analizadas, sugiriendo a este nuevo estrato transcripcional del genoma como potenciales nuevos targets en cáncer. Estos resultados constituyen un aporte original al conocimiento de las características biológicas de las entidades en estudio permitiendo así, evidenciar con mayor especificidad la diversidad y heterogeneidad de procesos involucrados en su desarrollo.

Descripción: El presente trabajo describe aspectos de la epidemiología de las meningitis agudas pediátricas, en el departamento Capital de la provincia de Misiones, dirigido a sus principales agentes etiológicos. Para ello se diseñó un estudio descriptivo, transversal para el período 1994-2009, que incluyó todos los casos atendidos en el Hospital Provincial de Pediatría. Se utilizó la definición de meningitis aséptica y bacteriana, según criterios internacionales propuesto por la OMS, investigándose por diversas técnicas los agentes etiológicos. Para el almacenamiento y análisis de datos se utilizó el programa Epi Info 6; y la prueba de Chi2 (error de estimación de 0,05%) para determinar asociación significativa entre las variables. El análisis factorial de correspondencias múltiples (AFCM) se realizó utilizando el paquete estadístico SPAD-N V 4.01 1987-1999 (CISIA CERESTA) del programa PRESTA (Programme de Recherche et D´Esignement en Statistique Apliquee). En este período se detectaron 1.073 casos de meningitis de etiologías infecciosas en pacientes pediátricos. La distribución de los mismos y las tasas de incidencia no siguieron un patrón uniforme denotándose picos; mientras las meningitis bacterianas (MB) variaron entre 77,8 (1995) y 14,8 (2009) casos/105 niños, con una tendencia en disminución, las meningitis asépticas (MA) lo hicieron entre 153,1 (2005) y 13,7 (1998) casos/ 105 chicos con una tendencia en ascenso. Ambos afectaron más a los varones que a las niñas con una razón de género de 2,4 en MB y 1,6 en MA niños por cada chica. La morbilidad media para ambos tipos de meningitis fue superior entre los niños < 1 año y su incidencia respecto a cualquier grupo fue significativamente mayor. Las tasas de MB corregidas por edad, fueron más elevadas que las asépticas salvo para los niños > 4 años. De los 581 episodios de MB se documentó agente etiológico en el 73%. Los patógenos detectados fueron Streptococcus pneumoniae (Spn) en 167 (39%) episodios, Neisseria meningitidis (Nme) 22% (95), Haemophilus influenzae (Hin) 19% (80) y 86 (20%) microorganismos diferentes a los capsulados. Todos mostraron una tendencia en disminución, con variaciones importantes en las frecuencias anuales. La incidencia de meningitis por Spn cada 105 niños varió entre 19,2 (1997) y 4,3 (2009), con una media de 10,6. El grupo más afectado fue el de niños entre 1 y 11 meses (94/167, 56 %). El 30,7 % de los aislamientos (46/150) fueron resistentes a penicilina y el 16,7 % (25/150) no sensibles a cefotaxima. Se detectaron 19 serotipos, predominó el 14 (32%; 40/125). El 84,8% de los aislamientos quedaron circunscritos a nueve serotipo: 14, 5, 1, 7F, 18C, 6B, 9N, 9V y 4. La resistencia a penicilina estuvo reducida a 8 (14, 6B, 6A, 9V, 4, 23B, 1 y 19A), y la no sensibilidad a cefotaxima a 3 (14, 9V y 1), el más importante fue en ambos casos el serotipo 14. La incidencia por Nme varió entre 23,7 (1996) y 1,7 (2009)/105 niños, con una media de 5,6. Afecto especialmente a los niños > 2 años (62,1%; 59/95), aunque las tasas más elevadas se observaron en niños < 1 año. Durante 1996 se detectó un brote por Nme C que comprometió a niños de todas las edades, aunque los más perjudicados fueron los > 4 años. Circularon 4 serogrupos: C (50%; 47/94), B (33%; 31/94), W135 (15%; 14/94) y en el 2% Y (2), con variaciones temporales. La tasa por Hin varió entre 17,5 (1995) y 0,87 (2009)/105 niños, con una media de 5,6. Los más afectados, con tasas más elevadas, fueron los niños < 1 año (59/80, 73%). Observamos una reducción de la incidencia, superior al 90%, en todos los grupos una década después de la implementación de la vacuna. Todos los aislamientos fueron seroagrupados como H.influenzae b, no detectándose ningún otro tipo capsular o aislamientos no tipables. La tasa para los otros agentes etiológicos varió entre 10,1 (1995) y 0,8 (2009)/105 niños. La mediana de edad fue de 2 años y 3 meses y el 78% (57/73) de los aislamientos se efectuaron en niños < 1 año. La tasa de meningitis tuberculosa varió entre 2,19 (1995)/105 niños y 0,87 (2009), con una media de 0,81 y una tendencia leve al descenso. Comprometió a 1,16 varones por cada niña implicada, con una mediana de edad de 4 años y 4 meses. El mayor número de aislamientos se obtuvo en los niños de más de 4 años de edad (7/13, 54%). En el 42% (207/492) de las MA se logró arribar a un diagnóstico etiológico. Los enterovirus (EV) constituyeron un importante agente etiológico de estas meningitis en el departamento Capital al detectar 62 episodios (73%) en el período 2005-2009 y confirmar un brote epidémico, que comprometió a 143 niños, entre agosto y diciembre de 2005. El mismo, provocado por EV Echo 4, elevó la tasa a 136 casos /105 niños. El 79,8% de los niños afectados fueron > 4 años y el 55,2% varones, con una mediana de edad de 8 años. Durante el resto del período la tasa varió entre 22,3(2008) y 5,3 (2006) casos/105 niños, con una media de 13,9 y una tendencia en ascenso. La mediana fue de 6 años y 7 meses; el 62% de los niños tenían más de 4 años y el 56,8% eran varones (razón V:M = 2,1:1). La tasa más elevada se registró para < 1 año (69,6) grupo responsable del incremento observado. El presente trabajo constituye un aporte a la epidemiología de la región, y contribuye a mejorar la situación de la salud en la provincia, brindando herramientas para la toma de decisiones en cuanto a prevención y el establecimiento de normas para tratamiento empírico adecuado.

Descripción: Baccharis spicata (Lam.) Baill (Asteraceae) es empleada como sustituyente de especies medicinales del mismo género conocidas como ?carquejas?, aunque la evidencia científica disponible en la actualidad es escasa en cuanto a sus parámetros de eficacia, seguridad y calidad. El objetivo de este trabajo fue conocer la proporción de B. spicata presente en muestras comerciales de ?carqueja?, conocer el momento óptimo de cosecha para obtener el mayor contenido de metabolitos polifenólicos posible, caracterizar los metabolitos polifenólicos principales y conocer la seguridad toxicogenética y la actividad farmacológica en modelos de patologías hepáticas. Se encontró que B. spicata sustituye a las especies oficiales de ?carqueja? en más de la mitad de las muestras obtenidas en comercios y que el mayor contenido de polifenoles se encuentra en la hoja recolectada en la primavera, la cual contiene ácido 5-cafeoilquínico, ácido 3,5- dicafeoilquínico y rutina como componentes principales. Respecto de las actividades biológicas, la infusión de hojas no indujo daño significativo al material genético determinado en ensayos en células bacterianas y eucariotas. Además, se observó que inhibe la replicación del virus de la hepatitis B en células HepG2.2.15 y que produce un aumento del flujo biliar al ser administrado por vía oral en animales sanos.

Descripción: Dentro de las acuaporinas vegetales, las PIPs son una de las principales responsables del intercambio eficiente de agua a través de la membrana plasmática (MP). Existe un subtipo - PIP1- que si bien se expresan ampliamente, su rol y propiedades restan de ser dilucidados, dado que no llegan a la MP salvo que se co-expresen junto con una PIP2. Nuestro trabajo fue demostrar que una PIP1 específica de fruto (Fragaria x ananassa, FaPIP1;1)- contribuye a modular la permeabilidad al agua de la membrana (Pf). Utilizando un modelo matemático aplicado a resultados de Pf obtenidos experimentalmente co-expresando FaPIP1;1 y FaPIP2;1 o una mutante de FaPIP2;1 en diferentes relaciones de masa se logró dilucidar la contribución individual de cada PIP a la Pf de la MP. Demostramos que: i) FaPIP1;1 tiene alta capacidad de transporte de agua; ii) la Pf de FaPIP2;1 aumenta al interaccionar físicamente con FaPIP1;1; iii) entre FaPIP1;1 y FaPIP2;1 se produce heterotetramerización aleatoria a partir de monómeros. Finalmente, caracterizamos la sensibilidad del gatillado dependiente de pH citosólico para ambas acuaporinas y cómo influye el estado de fosforilación de una Serina específica. Proponemos que existe una interacción entre los diferentes mecanismos de regulación que gobernarían la permeabilidad de una membrana que expresa ambas PIPs.

Descripción: La familia de genes Asr (ABA, stress, ripening) está implicada en las vías de respuestas generales a estrés y en el control del transporte de hexosas. Para profundizar en el estudio funcional del parálogo ASR1 en Solanáceas, se evaluaron plantas de tabaco y tomate que sobreexpresan y silencian Asr1 desde una perspectiva metabólica, fisiológica y molecular. El estudio de las plantas de tabaco silenciadas mostró que tienen alteraciones en los niveles foliares de glucosa así como disminuciones en los niveles de expresión del transportador de hexosas Ht1. Asimismo, esas mismas plantas muestran modificaciones en los niveles de las hormonas ABA y giberelinas. Por el contrario, el principal efecto metabólico observado en los frutos de tomate es a nivel del metabolismo de los aminoácidos. Los niveles de expresión de los genes asociados a vías de respuesta frente a estrés en los frutos de las líneas silenciadas sugieren que ASR1 reprime esas vías en esos tejidos. Asimismo se encontraron evidencias que indican que ASR1 estaría relacionado con el metabolismo de la pared celular y con la vía de las citoquininas en los frutos de tomate. En conclusión, ASR1 está involucrado en el metabolismo primario, hormonal y en vías de respuesta a estrés en las Solanáceas estudiadas.

Descripción: PER-2 fue históricamente la segunda ß-lactamasa de espectro extendido plasmídica más frecuente en aislamientos clínicos de enterobacterias en Argentina. Si bien no se han reportado variantes mutacionales de PER-2, debido a las constantes presiones selectivas ejercidas por el uso masivo de antibióticos e inhibidores, y a los antecedentes de evolución en otras enzimas, nos planteamos si la misma puede evolucionar y modificar sus aptitudes hidrolíticas y/o ser menos susceptible a la inhibición. Por modelados computacionales se pudo apreciar que Arg220 de PER-2 ocupa estructuralmente un espacio equivalente a Arg244 en TEM-1/SHV-1. Ya que en enzimas resistentes a inhibidores derivadas de TEM/SHV la sustitución en Arg244 es suficiente para conferir el fenotipo resistente, se postula que modificaciones en Arg220 de PER-2 podrían tener un efecto similar. También postulamos que Thr237, cercana a Arg220 según nuestros modelos, tendría un potencial papel en la estructura-función de PER-2. En el presente trabajo se realizó la caracterización bioquímica de variantes mutacionales en posiciones 220 y 237 obtenidas in vitro determinando la participación de estos residuos en la hidrólisis e inhibición, la resolución de la estructura cristalográfica de PER-2 y la caracterización preliminar de un plásmido portador del gen blaPER-2.

Descripción: Las Distrofinopatías son enfermedades monogénicas, recesivas ligadas al X, originadas por mutaciones en el gen DMD. El objetivo principal del trabajo consistió en realizar una caracterización genética/molecular del gen DMD. La identificación de la alteración molecular resulta clave para la confirmación del diagnóstico clínico presuntivo, establecer la prognosis del paciente y establecer la estrategia terapéutica mutación-dependiente que se adecúe a cada caso particular. No obstante, continúa siendo necesario brindar un completo asesoramiento genético a las familias afectadas empleando estudios de detección de portadores, prenatales y preimplantatorios de modo de evitar el nacimiento de varones enfermos. En este trabajo fueron analizados 200 varones con diagnóstico clínico de Distrofinopatía y 12 mujeres con sintomatología, corroborándose el cuadro en el 71,7% (152/212). Se estableció la prognosis, identificó a los candidatos para las terapias disponibles y caracterizaron las mutaciones halladas. Se estableció el estado de portadora de 69/240 (28,8%) mujeres y se descartó a 132/240 (55%). Se realizaron 15 estudios prenatales: 7 descartados de ser afectados, 4 no portadoras y 3 portadoras. Pudimos además demostrar que la expresión de distrofina se encuentra alterada en tumores no miogénicos, corroborando la implicancia fisiopatológica del gen DMD en el desarrollo tumoral.

Descripción: La enfermedad de Chagas es una zoonosis transmitida al hombre por Triatoma infestans, un insecto hematófago que se encuentra en América Central y América del Sur. El control de este insecto depende principalmente del uso de insecticidas. Sin embargo en lo últimos años aumentó en Argentina y Bolivia los informes del fracaso de los rociados con insecticidas asociados a resistencia a insecticidas piretroides. Si bien existen algunos trabajos sobre expresión y mecanismos de resistencia en ninfas de T. infestans, existen muy pocos estudios sobre la expresión de la resistencia en huevos de poblaciones resistentes, y no existe estudios sobre la expresión de la resistencia a lo largo del desarrollo embrionario y sus posibles causas. El objetivo de este trabajo de tesis fue analizar la expresión de resistencia a deltametrina en el huevo en desarrollo de dos poblaciones de campo provenientes de Campo Largo-Argentina, y Entre Ríos-Bolivia. Además analizar los mecanismos enzimáticos y moleculares potencialmente asociados con la resistencia a deltametrina durante el desarrollo embrionario. Las ninfas de ambas poblaciones de campo mostraron niveles altos de resistencia a deltametrina comparadas con la población susceptible de referencia (Entre Ríos: 173x y Campo Largo: 1.108X) Los grados de resistencia a deltametrina estimados para ambas poblaciones resistentes en huevos de 4, 7 y 12 días de desarrollo, indicaron que la resistencia se expresa desde el desarrollo temprano en huevos de T. infestans, y que a lo largo de todo el desarrollo embrionario los niveles de resistencia fueron mayores en Campo Largo que en Entre Ríos (1.144x, 1.193x y 822x para Campo Largo y 21x, 15x y 39x para Entre Ríos). Tanto para la población de referencia como para las poblaciones de campo, la efectividad de la deltametrina fue menor en huevos de 12 días respecto a huevos de 4, y 7 días de desarrollo. La actividad de las enzimas monooxigenasas P-450 no mostró incremento significativo en las poblaciones resistentes. Este resultado sugiere que no es un mecanismo contributivo a la resistencia a deltametrina. O bien que la metodología empleada no permitió detectar un incremento de alguna fracción de ese complejo enzimático. La actividad de piretroide-esterasas mostró un incremento durante el desarrollo embrionario de todas las poblaciones estudiadas, siendo los valores más altos de actividad los correspondientes a huevos de 12 días. La actividad promedio se incrementó de 13,60 a 16,27, y a 22,21 picomoles de 7- hidroxicumarina/minuto (7-OHC) en huevos de 4-, 7-, y 12 días de la población de referencia. Los valores medios para las poblaciones resistentes fueron de 16,17, 21,44 y 26,14 picomoles de 7- OHC/minuto en el caso de Entre Ríos, y de 16,04, 17,98 y 28,87 picomoles de 7-OHC/minuto para la población Campo Largo en huevos de 4-, 7- y 12 días respectivamente. Los estudios moleculares detectaron la presencia de la mutación kdr (knockdown resistance) L1014F en las dos poblaciones de campo, indicando que el sitio de acción alterado es un mecanismo de resistencia a deltametrina en las poblaciones de campo estudiadas. La mutación kdr L925I descripta en otros hemípteros no fue detectada en ninguna de las poblaciones estudiadas. Los resultados de este trabajo de tesis, demuestran que la resistencia a deltametrina expresada en huevos en desarrollo, se deben en parte a la mayor actividad de las piretroide-esterasas y a la modificación del sitio de acción. El avance del conocimiento sobre los mecanismos de resistencia a insecticidas involucrados, permitirán optimizar las campañas de control de T. infestans, vector de la enfermedad de Chagas.

Descripción: Los oligonucleótidos cuya función se encuentra asociada a procesos catalíticos o de reconocimiento molecular se los conoce como oligonucleótidos funcionales (ribozimas, DNAzimas, aptámeros) y sus aplicaciones abarcan el silenciamiento génico, el desarrollo de herramientas de diagnóstico y sensores, la biocatálisis y la nanotecnología. En este trabajo se estudió cómo optimizar el uso de estos oligonucleótidos mediante la incorporación de modificaciones químicas. Inicialmente, se estudió el efecto modulador de 2?-desoxi-2?-C-metilpirimidín nucleósidos sobre: la actividad hidrolítica y estabilidad en medios biológicos de la DNAzima 8-17 al ser incorporados en distintas posiciones de su núcleo catalítico; la potencia silenciadora y la especificidad de siRNAs al ser incorporados en distintas posiciones de las cadenas antisentido y sentido; la estabilidad termodinámica de oligonucleótidos de ADN formadores de dúplex e i-motif. Por último, se amplió el estudio a la DNAzima peroxidasa utilizando el oligonucleótido modificado en su totalidad con L-nucleótidos y el oligonucleótido inmovilizado, empleando un amplio repertorio de sustratos, entre ellos sulfuros y paracetamol.

Descripción: Dada la necesidad de una estrategia novedosa para la búsqueda de inhibidores de la proteína K-Ras, en este trabajo se decidió abordar la exploración de moléculas con actividad inhibitoria de dicha proteína siguiendo un protocolo de trabajo original e integrativo. En una primera etapa de docking in silico, se evaluaron las interacciones de cada molécula con la proteína blanco, dando como resultado un score de interacción. Habiendo identificado los mejores candidatos, se adquirieron aquellas moléculas que mostraron una unión más favorable al sitio propuesto y se hizo uso de modelos in vivo simples como el nematodo C. elegans y del pez D. rerio para evaluar su actividad y toxicidad. De esta manera, se identificaron dos moléculas que continuaron el proceso hacia una tercera etapa, de experimentos en cultivo de células in vitro y de uso de roedores para pruebas in vivo. Estas moléculas fueron evaluadas in vitro, modificadas químicamente y vueltas a evaluar, hasta que se obtuvo una molécula con la potencia adecuada. Ésta fue probada en un modelo in vivo de cáncer colorrectal con metástasis hepática, evaluando tanto su actividad anti-metastásica como su toxicidad a nivel macromolecular, dando resultados favorables.

Descripción: Se evaluó el aporte potencial de hierro, calcio y zinc en alimentos y/o dietas destinados a diferentes grupos vulnerables: niños entre 6 meses y 2 años, embarazadas y adultos mayores de contextos socioculturales diversos. Se analizaron dietas caseras, alimentos de planes sociales, alimentos comerciales y regionales y matrices alimentarias no tradicionales. El aporte potencial se calculó en base al contenido total y la dializabilidad mineral, evaluada mediante un método in vitro. Se estudió el efecto de diversos promotores (ácidos cítrico y ascórbico, Na2EDTA) e inhibidores (fitatos, polifenoles, calcio, proteínas lácteas y oxalatos) y la efectividad de distintas fuentes de hierro (sulfato ferroso, bisglicinato férrico y NaFeEDTA). El aporte potencial de los alimentos infantiles mostró diferencias significativas, debido a las interacciones en las diversas combinaciones estudiadas y con los promotores o inhibidores presentes. En los alimentos complementarios comerciales sería adecuada una reformulación. Los alimentos regionales aportan cantidades importantes de hierro y moderadas de zinc y calcio. Las harinas de plátano verde y snacks resultaron pobres aportadores de minerales. En las infusiones de yerba mate la dializabilidad de hierro fue mínima pero el ácido ascórbico podría aumentarla. Estos resultados aportarían una base apropiada para formular recomendaciones relativas a dietas de grupos vulnerables.

Descripción: La resistencia natural (R) a ciertas enfermedades se refiere a la capacidad inherente del animal de resistir la enfermedad cuando queda expuesto al patógeno que la origina. Se sabe que un componente significativo del carácter R es heredable y, si bien la R es poligénica, se ha observado que hay genes individuales que tienen un efecto mayor sobre este carácter. El gen SLC11A1, Solute Carrier Protein 1 of 11 (inicialmente denominado NRAMP1 -Natural Resistance Associated Macrophage Protein 1-) es el mejor candidato en estudios de resistencia natural a infecciones por patógenos intracelulares. En las especies pecuarias, los polimorfismos mayormente estudiados se encuentran en la región 3´ no codificante (3´ UTR) del gen SLC11A1 y están determinados por la existencia de dos microsatélites, cuyos alelos se definen por la cantidad de repeticiones cortas en tándem de un dinucleótido (guanina-timina), quedando los diferentes alelos establecidos por las longitudes de los microsatélites. En esas especies, los polimorfismos de la región 3´ UTR del gen SLC11A1 se han asociado con R a Brucella abortus en bovinos y en bubalinos, a Brucella melitensis en caprinos, a Mycobacterium avium subsp paratuberculosis en bovinos y caprinos, y a M. bovis en bovinos. En la región 3´UTR del gen SLC11A1 bovino se han identificado dos microsatélites, llamados en el transcurso de este trabajo Ms1 (microsatélite 1, el más próximo a la región codificante) y Ms2 (microsatélite 2, el más lejano a la región codificante). El objetivo general de este trabajo fue evaluar el grado de asociación de los polimorfismos en los microsatélites de la región 3? UTR del gen SLC11A1 con la R a las infecciones bacterianas intracelulares que afectan a los bovinos. En primera instancia, se analizó la frecuencia de distribución de los polimorfismos en los microsatélites de la región 3´ UTR del gen SLC11A1 en diversas razas puras de ganado bovino de las especies Bos taurus (razas Criolla, Angus, Hereford y Holando Argentina), Bos indicus (razas Brahman y Nelore) y razas cruzas B. taurus X B. indicus (Braford y Brangus). Se encontró una diferencia significativa en la distribución de los polimorfismos de la región 3´ UTR del gen SLC11A1 entre las especies bovinas y entre las razas índicas, las razas cruzas y las europeas. Coincidentemente, para ambos microsatélites, se encontró la mayor variabilidad alélica en las razas bovinas pertenecientes a la especie Bos indicus, una variabilidad intermedia en las razas resultantes de cruzas, y la menor variabilidad se detectó en las razas Bos taurus. Como dato relevante de esta investigación, se detectaron dos nuevos alelos para el Ms1 de la región 3´ UTR del gen SLC11A1: los alelos 161 y 163, y una nueva variante para el Ms2 en Holando: el alelo 177. Posteriormente, se evaluó el grado de asociación entre los polimorfismos en los microsatélites de la región 3´ UTR del gen SLC11A1 y la ausencia o presencia de infección natural (como indicadores del carácter de resistencia o susceptibilidad, respectivamente). Se llevaron a cabo estudios casos-controles en rodeos Bos taurus con alto riesgo de infección natural por brucelosis y tuberculosis. Los resultados indicaron falta de asociación (p>0,05) entre las variantes de ambos microsatélites de la región 3´ UTR del gen SLC11A1 y la ausencia o presencia de infección natural por Brucella abortus y Mycobacterium bovis en los bovinos Bos taurus analizados. Como la capacidad de los fagocitos de restringir el crecimiento intracelular de B. abortus está relacionada con la resistencia a la infección, se planteó corroborar los resultados previos mediante un estudio in vitro. Lamentablemente, la homogeneidad genotípica encontrada en los rodeos Bos taurus evaluados (la gran mayoría de los animales presentaban los genotipos 159/159 -Ms1, 100%- y 175/175 -Ms2, 96%-), impidió seleccionar animales portadores de distintos polimorfismos para la región 3? UTR del gen SLC11A1 y poder comparar la capacidad brucelicida natural de sus fagocitos mononucleares. Ante la imposibilidad de continuar con el objetivo original, el trabajo se enfocó en evaluar la influencia de los parámetros sexo, edad y vacunación con Brucella abortus S19 sobre la capacidad brucelicida natural de los fagocitos mononucleares en bovinos Bos taurus portadores de un mismo genotipo (159/159 - 175/175) para la región 3´ UTR del gen SLC11A1. Los resultados obtenidos indicaron que las hembras adultas presentaron la menor capacidad para restringir el crecimiento intracelular de B. abortus, resultando las más susceptibles al desafío in vitro con este patógeno. Además, se observó que la capacidad natural de los macrófagos para restringir el crecimiento intracelular de B. abortus, estuvo influenciada por el sexo y la madurez sexual de los animales estudiados. Como conclusión, los resultados de este trabajo no muestran asociación entre los polimorfismos en los microsatélites de la región 3? UTR del gen SLC11A1 con la resistencia natural a la infección por B. abortus y M. bovis en el ganado bovino Bos taurus.

Descripción: Staphylococcus aureus es un patógeno oportunista que causa enfermedad en el hombre y en los animales. Desde 1997 se han reportado a nivel mundial cepas de S. aureus con sensibilidad disminuida a vancomicina (VISA), y cepas con resistencia heterogénea (hVISA). El mecanismo responsable de dicha resistencia aún no ha sido completamente elucidado. Sumado a esto, la detección del fenotipo hVISA es dificultosa en laboratorios clínicos. Este trabajo describe por primera vez la prevalencia y la caracterización molecular de aislamientos hVISA en un hospital de Argentina y evalúa distintas metodologías para su detección. Adicionalmente, se estudian las bases moleculares posiblemente implicadas en la susceptibilidad disminuida a vancomicina. No se encontraron aislamientos VISA y el fenotipo hVISA ocurrió en el 3,3% de las bacteriemias por S. aureus estudiadas. Se encontró una asociación entre el fenotipo hVISA y episodios múltiples de bacteriemias, y se propuso la combinación de métodos para alertar de un posible hVISA en aquellos laboratorios en donde no se puede realizar la metodología confirmatoria de rutina. La modificación en el metabolismo del peptidoglicano en cepas hVISA/VISA hallada en esta tesis podría deberse a diversos cambios genéticos. Asimismo se encontró un aumento de la transposición de IS256 asociado a dicho fenotipo.

Descripción: Microorganismos poco frecuentes tales como Achromobacter spp., Pseudomonas putida y Sphingobacterium spp. son recuperados cada vez con mayor frecuencia de muestras clínicas de diversos tipos de pacientes, tanto inmunocompetentes como inmunosuprimidos. Esto se debe probablemente a un incremento en la sobrevida de los pacientes, a la mejora de las técnicas de aislamiento e identificación bacteriana en el laboratorio así como a la presión ejercida por la exposición repetida a la terapia antibiótica. Achromobacter, particularmente A. xylosoxidans puede asociarse a neumonía, bacteriemia e incluso meningitis. Generalmente se presenta en pacientes inmunodeprimidos, pero también se ha descripto en pacientes inmunocompetentes. Los pacientes con fibrosis quística tienen una mayor predisposición de padecer infección por este microorganismo. La identificación certera de las especies del género Achromobacter resulta difícil y generalmente los aislamientos clínicos de dicho género son referidos como A. xylosoxidans. Asimismo, otras especies del género, diferentes a A. xylosoxidans, son habitualmente consideradas microorganismos ambientales y en escasas ocasiones fueron asociadas a infecciones en humanos. Esta dificultad en la identificación determina que no sea posible evaluar la prevalencia real y el impacto clínico de las diferentes especies, siendo necesario contar con métodos confiables y específicos para identificar de manera certera las especies de Achromobacter. Uno de los objetivos del presente estudio fue contribuir a la identificación de estas especies a través de técnicas rápidas y sencillas que permitan un rápido diagnóstico y la implementación de terapias adecuadas. Hemos evaluado la eficiencia de diferentes técnicas feno y genotípicas empleadas en la identificación de aislamientos de Achromobacter spp. Las técnicas basadas en la secuenciación de múltiples alelos (MLST) y la secuenciación de nrdA resultaron las más apropiadas para arribar a la correcta identificación de las especies de Achromobacter. Asimismo, como parte de este trabajo, hemos descripto la presencia de nuevos genes blaOXA, ubicuos y específicos de A. ruhlandii, A. insuavis y A. dolens, que resultaron útiles en la identificación, constituyendo marcadores especie específicos. La correcta identificación de las especies de Achromobacter ha permitido reportar el hallazgo de especies diferentes a A. xylosoxidans en muestras clínicas, tales como A. ruhlandii, A. dolens, A. spiritinus, A. marplatensis, A. insolitus, A. spanius, A. pulmonis. Achromobacter spp. presenta naturalmente multirresistencia a antibióticos como muchos ?-lactámicos de amplio espectro, fluoroquinolonas, aminoglucósidos y trimetoprima-sulfametoxazol. En este trabajo se reporta la emergencia de aislamientos que presentaron resistencia a carbapenemes, cuyos mecanismos fueron parte del estudio. Distintos ensayos indicaron la presencia de una enzima con actividad de carbapenemasa. Se caracterizó una de las enzimas identificadas en el estudio, OXA-258a, la cual no sería responsable de dicha resistencia. Asimismo se identificó una nueva enzima de tipo AmpC, la cual se pretende caracterizar. Si bien son poco frecuentes, en este estudio hemos caracterizado dos brotes debidos a aislamientos de Achromobacter genogrupo 20, identificando en uno de ellos el posible nexo epidemiológico. Cabe señalar la importancia de contar con herramientas que permitan un rápido análisis de estas situaciones con el fin de instaurar medidas tendientes a evitar la diseminación de este microorganismo. Las especies del género Sphingobacterium son bacilos gram negativos no fermentadores ubicuos en la naturaleza, y que rara vez producen infecciones en humanos. Los carbapenemes resultan activos frente a aislamientos de este género si bien hemos detectado en este estudio la emergencia de cepas con resistencia disociada (resistentes a imipenem y sensibilidad a meropenem). Se evidenció que esta resistencia podría deberse a la pérdida o disminución de la expresión de una proteína de membrana externa (OMP) de aproximadamente 50 kDa, la cual se intentó identificar por distintas metodologías. La proteína fue digerida y los péptidos resultantes se analizaron mediante MALDI-TOF. Aún no se ha podido dilucidar la secuencia completa de la proteína dado que hasta el momento en la base de datos empleada no existe ninguna proteína que comparta cierto grado de identidad. Pseudomonas putida es un bacilo gram negativo no fermentador que se encuentra con frecuencia en el medio ambiente. Sin embargo, durante las últimas tres décadas, se ha reportado como agente causal de diferentes infecciones asociadas al cuidado de la salud. La resistencia a carbapenemes es infrecuente en esta especie y no se ha reportado previamente la resistencia disociada a estos agentes. Se estudiaron 3 aislamientos de P. putida, recuperados de pacientes internados que presentaron resistencia a meropenem y sensibilidad a imipenem. Se estudió fenotípicamente la expresión de bombas de eflujo empleando inhibidores y se evaluó el nivel de expresión de la bomba de eflujo ArpABC por RT-PCR. Se determinó que la sobreexpresión de la misma podría contribuir a la resistencia a meropenem en aquellos aislamientos de P. putida que presentan resistencia disociada a carbapenemes, similar a lo observado para los sistemas de eflujo en Pseudomonas aeruginosa.

Descripción: Los camélidos sudamericanos (CS), son un ganado atractivo, que brinda beneficios a las comunidades andinas, siendo la carne la principal fuente de proteína para estas comunidades. Desafortunadamente, Sarcocystis aucheniae, que dan lugar a la producción de quistes macroscópicos similares a granos de arroz, ocasionando pérdidas económicas. Se desarrolló una PCR capaz de detectar ADN de S. aucheniae con alta especificidad y sensibilidad en sangre de llamas, pero a su vez se logró aplicar este método para detectar ADN del parásito en otros CS así como también en materia fecal de perros. Si bien no logró ser un método útil para el diagnóstico pre-faena, si puede ser útil en estudios epidemiológicos, para evaluar la efectividad de los tratamientos con parasiticidas, y para la vigilancia y localización de los huéspedes definitivos. Por otra parte, se secuenció el transcriptoma de S. aucheniae y se realizaron diversos análisis bioinformáticos para buscar proteínas candidatas para ser usadas como antígenos para el diagnóstico. creación de fármacos y enfoques de inmunoterapia. La presente Tesis aporta información importante sobre S. aucheniae, un parásito muy poco estudiado así como herramientas para su control.