Descripción: El cáncer de mama es, en nuestro país y a nivel mundial, la neoplasia mayormente diagnosticada y la principal causa de muerte por cáncer en mujeres. El cáncer de mama triple negativo (CMTN) es el subtipo más agresivo con un alto potencial proliferativo y metastásico, presenta las mayores tasas de recaída y al no presentar biomarcadores para el uso racional de tratamientos específicos, carece de terapias dirigidas, lo que contribuye a su mal pronóstico. De esta manera, la identificación de nuevos biomarcadores para el diagnóstico temprano, la determinación del pronóstico o la terapia dirigida son de suma importancia para mejorar los resultados del paciente con CMTN. En el contexto de la complejidad y heterogeneidad de esta enfermedad oncológica, existe una necesidad crítica de desarrollar terapias que se dirijan no sólo a las células tumorales, sino que también afecten a sus vías biológicas y a su interacción con las células del microentorno tumoral del CMTN. La histamina es una amina biogénica y presenta numerosas funciones fisiológicas y fisiopatológicas, las que ejerce a través de la activación de 4 receptores H1, H2, H3 y H4 (RH1, RH2, RH3, RH4). El RH4 se encuentra expresado en células del sistema inmune y, aunque su papel en trastornos inflamatorios y autoinmunes está siendo investigado, su potencial función inmunomoduladora en el cáncer es completamente desconocida. En este trabajo en primer lugar se investigó si la expresión de la histidina decarboxilasa (HDC), enzima responsable de la producción de histamina, y del RH4 podrían relacionarse con el pronóstico, en términos de supervivencia, con el objetivo de identificar potenciales biomarcadores de esta patología oncológica. Los datos genómicos del Atlas Genómico del Cáncer (The Cancer Genome Atlas, TCGA) mostraron que tanto la expresión de la HDC como del RH4 está regulada negativamente en el cáncer de mama en comparación con el tejido normal. Una mayor expresión de HDC predijo una mejor supervivencia global y supervivencia libre de enfermedad en todos los pacientes con cáncer de mama, así como en pacientes con CMTN. En el caso del RH4 la supervivencia libre de enfermedad fue mayor en los pacientes con cáncer de mama, incluidos los CMTN, con mayor expresión del receptor. Posteriormente, se evaluó el efecto del tratamiento sistémico con histamina y con ligandos del RH4 en la progresión tumoral y en la respuesta inmune en un modelo experimental murino de CMTN desarrollado mediante inoculación ortotópica de células 4T1 en ratones BALB/c. El tratamiento con histamina produjo un efecto concentración dependiente, donde la concentración más alta utilizada (5 mg/kg) resultó ser la efectiva al reducir el tamaño y el peso de los tumores, efecto que se asoció con una reducción en la proliferación y un aumento en la apoptosis tumoral. Solo en los animales tratados con histamina se observó una correlación inversa entre la proporción de linfocitos infiltrantes de tumor (LIT) y el peso de los tumores. Sin embargo, el análisis de la distribución de las subpoblaciones de células inmunitarias, no arrojo diferencias significativas tanto en tumor, ganglios linfáticos drenantes de tumor (GLDT), ganglios linfáticos no drenantes (GL) como en el bazo entre el grupo de animales controles y el tratado. Los estudios in vitro mostraron una contribución directa en el efecto antitumoral de la histamina y de los agonistas del RH4 sobre las células tumorales 4T1. Estudios in vivo utilizando ligandos farmacológicos específicos del RH4 JNJ7777120 (JNJ77, antagonista RH4, 10 mg/kg) y JNJ28610244 (JNJ28, agonista RH4, 1 o 5 mg/kg) mostraron que solamente la concentración de JNJ28 1 mg/kg mostró tener un efecto antitumoral, reduciendo el volumen y el peso tumoral. No se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de LIT o de subpoblaciones de células inmunitarias en los tumores de animales tratados con JNJ28. Sin embargo, este compuesto incrementó el porcentaje de linfocitos T CD4+ en GLDT respecto del correspondiente en los animales no tratados. La mayor concentración utilizada del agonista (5 mg/kg) no modificó el crecimiento tumoral, pero aumentó el porcentaje de células T regulatorias en GLDT junto con un aumento en la producción de la citoquina IL-10 y una reducción de los niveles de IFN? en medios condicionados de tumor. Por el contrario, el antagonista del RH4 JNJ77 produjo una reducción del porcentaje de linfocitos T CD4+ en tumor acompañada de una disminución del porcentaje de las células T regulatorias en GLDT. Estos resultados sugieren que la activación del RH4 produce un efecto inmunosupresor que podría explicar parcialmente el resultado terapéutico no efectivo del tratamiento con el agonista RH4 JNJ28 en la concentración más alta (5 mg/kg). Hipotetizamos que, en este caso, en el balance podría prevalecer la acción inmunosupresora sobre el efecto antiproliferativo directo sobre las células tumorales. Para comprender mejor el papel inmunomodulador del RH4, se estudió el efecto exclusivo del RH4 expresado en células involucradas en la inmunidad antitumoral en el modelo de CMTN desarrollado en ratones que no expresan el RH4 (Knockout, KO) en comparación con los ratones de tipo salvaje (wild-type, WT). Los ratones KO mostraron tumores de menor tamaño y peso, disminución del número de metástasis pulmonares y del porcentaje de células T CD4+ que infiltran el tumor, mientras que exhibieron un mayor infiltrado de células NK y linfocitos B CD19+ respecto de los tumores desarrollado en animales WT. El GLDT de los ratones KO mostró una disminución de las células T CD4+ y de la subpoblación de las células T regulatorias junto a un mayor porcentaje de células NK. Estos resultados demuestran el papel crítico de la histamina endógena y la activación del RH4 expresado en células del microambiente tumoral, en el desarrollo y la progresión como así también en la inmunidad antitumoral del CMTN. Finalmente, con el objetivo de verificar si el efecto inmunomodulador del RH4 podría observarse en otro modelo de cáncer de mama, se inocularon ratones BALB/c WT y KO con la línea de adenocarcinoma mamario murino LM3 (ErbB-2 positivo) y se evaluó el compartimento de los linfocitos T CD4+ en tumores y ganglios linfáticos. Aunque no hubo diferencias en el peso de los tumores, los resultados mostraron que también en este modelo, el porcentaje de células T regulatorias disminuyó significativamente en los GLDT en animales deficientes para el RH4. Hasta dónde llega nuestro conocimiento, este sería el primer reporte que demuestra la participación del RH4 en la inmunidad antitumoral. En conjunto los resultados sugieren una acción dual del RH4 en este modelo de cáncer de mama. Por un lado, produciendo un efecto antiproliferativo directo sobre las células tumorales y por otro, un efecto inmunosupresor, lo que resalta la complejidad de la patología oncológica. Además, estos indican que principalmente la histamina podría representar un potencial agente terapéutico en CMTN, como tratamiento único o incluso como terapia combinada.

Descripción: Las inmunofilinas son proteínas con actividad enzimática de peptidilprolyl-isomerasa que unen drogas inmunosupresoras. La inmunofilina FKBP51 forma complejos con la chaperona HSP90 y une al macrólido FK506. En este trabajo, demostramos que FKBP51 es una fosfoproteína cuyo grado de fosforilación condiciona su localización subcelular, siendo ello regulado por balance hormonal. Una importante fracción subcelular de FKBP51 es mitocondrial, migra al núcleo por estrés, cumple funciones antiapoptóticas, y es sobreexpresada por células tumorales. La subunidad hTERT de telomerasa también es una proteína-cliente de HSP90 fuertemente inducida en células cancerosas. Demostramos que FKBP51 co-inmunoprecipita con complejos hTERT?HSP90. Tanto el inhibidor de HSP90 radicicol como la sobreexpresión del dominio TPR de FKBP51 (el interactuante con HSP90) favorecen la relocalización citoplásmica de hTERT. La actividad enzimática de telomerasa es significativamente mejorada por FKBP51. Tratamientos de células tumorales con FK506 muestran una disminución de la vibilidad celular, y tratamientos de ratones Scid/Nod portando tumores xenográficos con FK506 mostraron una significativa reducción del crecimiento tumoral. Como FK506 muestra afinidad por otras inmunofilinas, ensayamos a una nueva droga sintética que es selectiva para FKBP51, SAFit1, la que mostró resultados similares. Estos estudios demuestran que FKBP51 es un nuevo factor antiapoptótico relacionado con el desarrollo tumoral.

Descripción: El virus de la diarrea viral bovina (BVDV) es un patógeno importante del ganado bovino de gran impacto económico, por lo que la identificación de antivirales para el tratamiento de las infecciones y control de los brotes por BVDV resulta de interés. Mediante fármaco-modulación de 5,6-TSC, un compuesto previamente identificado como un inhibidor no nucleosídico (INN) de la ARN-polimerasa (RdRp) de BVDV, se sintetizaron una serie de tiosemicarbazonas (TSC) y N4-ariltiosemicarbazonas derivadas de 1-indanonas. A partir de esto, en este trabajo de tesis se identificaron dos compuestos con mayor actividad anti-BVDV: N4-(p-nitrofenil)-TSC derivada de la 5,6-dimetoxi-1-indanona (N4-TSC) y la TSC derivada de 6-nitro-1-indanona (6NO2-TSC), que fueron activos frente a BVDV de distintos genotipos y biotipos e inactivos frente a otros ARN virus. Se demostró que estos compuestos actúan en etapas intermedias del ciclo de replicación viral. Particularmente, N4-TSC actúa inhibiendo la síntesis del ARN viral, y mediante la selección de BVDV resistentes (N4-TSCR) se identificó a la RdRp como el blanco de acción. Mediante estudios de docking y dinámica molecular se demostró que las mutaciones encontradas en N4-TSCR (N264D y A392E) alteran la interacción de N4-TSC con RdRp y son responsables de la resistencia antiviral.

Descripción: Los pueblos indígenas del nordeste argentino (NEA) se hallan por lo común en estrecho contacto con la naturaleza, dependiendo de ella, en gran parte, para su subsistencia. Por lo que poseen un profundo conocimiento de las propiedades medicinales de las plantas. Este conocimiento ha sido practicado, documentado y transmitido a través de generaciones, y permitió a la industria farmacéutica desarrollar gran cantidad de fármacos. Para ello, las propiedades medicinales de las plantas deben someterse a un proceso de validación científica en términos de eficacia, seguridad y calidad. Estos tres conceptos rigen la actual terapéutica del siglo XXI inherente a cualquier fármaco convencional. Y permite que las plantas medicinales puedan intervenir en el desarrollo y avance de la medicina moderna, sirviendo como punto de partida para el desarrollo de nuevos fármacos. Determinadas plantas son utilizadas por los indígenas del NEA para el tratamiento de diversas enfermedades. Entre ellas, el uso de "tapekué", nombre vulgar de Acanthospermum australe (Loefl.) Kuntze y de ?carnicera?, nombre vulgar de Conyza bonariensis (L.) Cronquist, para la cura de infecciones de la piel, desinfección de heridas y úlceras, entre otras afecciones dérmicas. Las infecciones de piel y partes blandas (IPPB) son una razón común de consulta en los centros de atención primaria de salud. Son entidades clínicas de presentación, etiología y gravedad variables que implican una invasión microbiana de las capas de la piel y los tejidos blandos, que van desde infecciones leves hasta infecciones potencialmente mortales. Las bacterias más comunes implicadas en IPPB son Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus, mientras que las infecciones fúngicas superficiales son causadas principalmente por especies de Candida, Malassezia y dermatofitos. La mayoría de los habitantes del NEA viven en un contexto económicamente desfavorable en cuanto a sus posibilidades para acceder a los fármacos. Ante esta barrera, recurren a los conocimientos de la medicina tradicional para el tratamiento y cuidado de su salud. Este trabajo tuvo como objetivo: obtener y caracterizar el extracto acuoso, el extracto etanólico y el aceite esencial de hojas de tapekué y carnicera del NEA; determinar si los extractos y aceites esenciales no eran citotóxicos a las concentraciones necesarias para inhibir el crecimiento microbiano; evaluar su actividad inhibitoria in vitro frente a hongos y bacterias causantes de IPPB, y determinar si la interacción entre extracto-extracto y extracto-droga (droga de uso clínico) era sinérgica. La caracterización se realizó mediante: determinación del contenido de flavonoides y fenoles totales de los extractos por métodos espectrofotométricos; determinación de la composición química de los aceites esenciales por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas; y evaluación de la actividad antioxidante de los extractos y aceites esenciales en función de la capacidad reductora de hierro y la capacidad secuestradora de radicales DPPH. La toxicidad se evaluó frente a célula mononucleares de sangre periférica. La actividad inhibitoria in vitro se evaluó mediante la determinación de la CIM de acuerdo a los documentos de referencia del CLSI, con modificaciones. Y el efecto de la interacción entre los agentes antimicrobianos se evaluó por el método del tablero de ajedrez. Los extractos acuosos y etanólicos de ambas plantas mostraron la presencia de compuestos fenólicos, siendo el contenido de fenoles y flavonoides significativamente superior en los extractos etanólicos. Por otro lado, los principales componentes del aceite esencial de hojas de C. bonariensis fueron limoneno, espatulenol y ?-curcumeno. Mientras que los principales componentes del aceite esencial de hojas de A. australe fueron germacreno A, ?-cadineno y trans-cariofileno. La evaluación de la actividad antioxidante mostró que los extractos acuosos y etanólicos de ambas plantas presentaban valores significativamente superiores de actividad antioxidante en comparación con sus respectivos aceites esenciales. El ensayo de citotoxicidad evidenció que los extractos y aceites esenciales no son tóxicos a las concentraciones ensayadas para inhibir el crecimiento microbiano. De acuerdo con el criterio establecido, los extractos acuosos y etanólicos de ambas plantas fueron inactivos frente a los microorganismos ensayados. Por el contrario, el aceite esencial de tapekué mostró una fuerte actividad frente a Epidermophyton floccosum y Microsporum canis; moderada actividad frente a Malassezia globosa; baja actividad frente a Microsporum gypseum y Trichophyton tonsurans; e inactivo frente a los demás microorganismos ensayados. Por su parte, el aceite esencial de carnicera mostró una fuerte actividad frente a todos los dermatofitos y M. globosa; baja actividad frente a Malassezia furfur; e inactivo frente a los demás microorganismos. De acuerdo al método del tablero de ajedrez, la única combinación que presentó efecto sinérgico frente a Malassezia fue la combinación entre el aceite esencial de carnicera con el aceite esencial de tapekué. Las combinaciones entre ambos aceites esenciales y de cada aceite esencial con ketoconazol mostraron efectos sinérgicos frente a M. canis, M. gypseum, E. floccosum y T. tonsurans. Mientras que la mayoría de las combinaciones con terbinafina mostraron efectos de no interacción, excepto con el aceite esencial de carnicera frente a M. canis y M. gypseum, que presentó efecto sinérgico. Los resultados obtenidos proporcionan la evidencia científica que avala el uso ancestral de hojas de tapekué y carnicera para el tratamiento de las dermatofitosis y la pitiriasis versicolor, además de justificar el uso tradicional de combinaciones de plantas medicinales.

Descripción: La toxina Shiga 2 (Stx2) liberada por Escherichia coli productora de Stx (STEC) produce diarrea, colitis hemorrágica, síndrome urémico hemolítico (SUH) y encefalopatía. El índice de mortalidad por SUH aumenta significativamente cuando se involucra el sistema nervioso central (SNC). STEC secreta LPS y Stx2. Por lo tanto, se utilizó un modelo in vivo (modelo murino) e in vitro (cultivos primarios de células microgliales de ratas) con el objetivo de determinar los efectos sub letales de Stx2 sobre el SNC, la contribución del LPS y el rol de la microglía en la encefalopatía. Stx2 produjo déficits cognitivos, alteración en la unidad neurovascular del área CA1 del hipocampo, peroxidación lipídica, liberación de citoquinas pro-inflamatorias y activación de la vía de señalización de NF-kB independiente de ERK 1/2. Además, se reportó por primera vez que la microglía expresa el receptor Gb3, que al activarse participa del proceso inflamatorio por medio de la liberación de citoquinas y del aumento de la actividad fagocítica. Todos estos resultados se agravaron con LPS. En conclusión, esta tesis determinó que Stx2 produjo un daño directo en las células del parénquima cerebral y un daño indirecto por medio de un proceso inflamatorio siendo la microglía la célula pivotal en este proceso.

Descripción: Un desafío importante para la investigación es comprender las diferencias neuroadaptativas entre el uso controlado de drogas y la pérdida del control. La cafeína es la droga psicoactiva más popular y también es un adulterante que se encuentra en muchas drogas de abuso. Nuestros resultados muestran que la ingesta de cafeína y cocaína produce sensibilización locomotora y aumento de la astrogliosis en el estriado, corteza prefrontal y motora del ratón después de un tratamiento crónico además de cambios en la expresión génica de receptores de distintos sistemas de neurotransmisión. A nivel de órganos periféricos, los resultados de esta Tesis proporcionan evidencia de hepatotoxicidad y cambios en la expresión de la enzima productora de dopamina y sus receptores, en testículo. Mediante la prueba de condicionamiento de preferencia de lugar (CPP), la combinación de las drogas indujo un cambio de preferencia y un aumento en la locomoción en comparación con la cocaína solamente. El análisis de expresión génica luego de la prueba de CPP reveló un aumento específico en el grupo que recibió la combinación de drogas en genes de expresión temprana en el cerebro, sugiriendo cambios adaptativos inducidos por el contexto asociado a las drogas específico de la combinación cocaína-cafeína.

Descripción: El grado de compromiso cardíaco de la enfermedad de Chagas crónica se asocia con el agotamiento de los linfocitos T. La IL-7 es un mediador importante para el mantenimiento y función de los linfocitos T. En este trabajo, evaluamos si la producción de IFN-? en respuesta a Trypanosoma cruzi se asocia con la expresión y funcionalidad del IL-7R. Los pacientes con células productoras de IFN-? específicas para T. cruzi mostraron mayores niveles de células T de memoria con expresión regulada del IL-7R y una respuesta eficiente a IL-7, comparado a lo hallado en pacientes sin linfocitos T parásito-específicos. La regulación del IL-7R se asoció inversamente con los niveles séricos de IL-6 y positivamente con los de IL-8. Los niveles circulantes de IL-21 e IL-27 estuvieron disminuidos en estadios menos severos. La expresión y la funcionalidad del IL-27R se asociaron con la producción de IFN-? específica para T. cruzi. La estimulación in vitro de PBMCs con IL-7 o IL-27 aumentó la producción de IFN-? en pacientes productores de IFN-?, pero no en los no productores. Las alteraciones de la vía IL-7/IL-7R podrían ser responsables de la pérdida de los linfocitos T específicos de T. cruzi durante la infección crónica.

Descripción: El trasplante intestinal (TxI) constituye una opción terapéutica viable para pacientes con insuficiencia intestinal crónica e irreversible con complicaciones a la nutrición parenteral. Si bien la aplicación de distintos protocolos de inmunosupresión ha permitido incrementar la aplicabilidad del TxI, la incidencia del rechazo celular agudo (RCA) es mayor que en otros órganos y continúa siendo causa, tanto temprana como alejada, de pérdida del injerto y necesidad de retrasplante. En este trabajo, se investigaron los blancos celulares de la apoptosis en la cripta intestinal durante el RCA mediante inmunohistología en biopsias de pacientes TxI. Las células madre intestinales y las de Paneth permanecieron inalteradas, mientras que se evidenció mayor daño a nivel de los intermediarios de diferenciación de las células epiteliales. Además, se evaluó el rol de las células linfoides innatas subgrupo 3 (CLI3s) como reguladoras de la homeostasis intestinal mediante citometría de flujo. Dicha población no se ve afectada por la inmunosupresión y, en muestras con RCA, mostró un fenotipo proinflamatorio. Consistentemente la expresión de IL-22, citoquina fundamental en la regeneración epitelial, disminuyó. La reparación epitelial ineficiente durante el RCA, en presencia de células madre intactas, puede deberse al detrimento en la IL-22. Esto abre una opción terapéutica diferente al uso de inmunosupresores.

Descripción: Baccharis spicata (Lam.) Baill (Asteraceae) es empleada como sustituyente de especies medicinales del mismo género conocidas como ?carquejas?, aunque la evidencia científica disponible en la actualidad es escasa en cuanto a sus parámetros de eficacia, seguridad y calidad. El objetivo de este trabajo fue conocer la proporción de B. spicata presente en muestras comerciales de ?carqueja?, conocer el momento óptimo de cosecha para obtener el mayor contenido de metabolitos polifenólicos posible, caracterizar los metabolitos polifenólicos principales y conocer la seguridad toxicogenética y la actividad farmacológica en modelos de patologías hepáticas. Se encontró que B. spicata sustituye a las especies oficiales de ?carqueja? en más de la mitad de las muestras obtenidas en comercios y que el mayor contenido de polifenoles se encuentra en la hoja recolectada en la primavera, la cual contiene ácido 5-cafeoilquínico, ácido 3,5- dicafeoilquínico y rutina como componentes principales. Respecto de las actividades biológicas, la infusión de hojas no indujo daño significativo al material genético determinado en ensayos en células bacterianas y eucariotas. Además, se observó que inhibe la replicación del virus de la hepatitis B en células HepG2.2.15 y que produce un aumento del flujo biliar al ser administrado por vía oral en animales sanos.

Descripción: Los camélidos sudamericanos (CS), son un ganado atractivo, que brinda beneficios a las comunidades andinas, siendo la carne la principal fuente de proteína para estas comunidades. Desafortunadamente, Sarcocystis aucheniae, que dan lugar a la producción de quistes macroscópicos similares a granos de arroz, ocasionando pérdidas económicas. Se desarrolló una PCR capaz de detectar ADN de S. aucheniae con alta especificidad y sensibilidad en sangre de llamas, pero a su vez se logró aplicar este método para detectar ADN del parásito en otros CS así como también en materia fecal de perros. Si bien no logró ser un método útil para el diagnóstico pre-faena, si puede ser útil en estudios epidemiológicos, para evaluar la efectividad de los tratamientos con parasiticidas, y para la vigilancia y localización de los huéspedes definitivos. Por otra parte, se secuenció el transcriptoma de S. aucheniae y se realizaron diversos análisis bioinformáticos para buscar proteínas candidatas para ser usadas como antígenos para el diagnóstico. creación de fármacos y enfoques de inmunoterapia. La presente Tesis aporta información importante sobre S. aucheniae, un parásito muy poco estudiado así como herramientas para su control.

Descripción: En el presente trabajo de tesis se evaluó la participación del transportador de eflujo ABCG2/BCRP en la distribución transplacentaria de AZT y la relevancia para la seguridad fetal, en comparación con 3TC. Se administraron diariamente AZT (60 mg/kg), 3TC (30 mg/kg) o vehículo entre los días E11 y E20 a ratas gestantes. Sólo AZT indujo la expresión de ABCG2 en placenta y en feto (hígado y cerebro). Ambos fármacos dañaron igualmente el ADN nuclear en sangre materna, pero 3TC produjo un nivel mayor daño en hígado fetal y sólo esta droga alteró la función mitocondrial en cerebro fetal. En E21, los animales tratados con AZT o vehículo recibieron 60 mg de AZT mg/kg iv en presencia o no del inhibidor de ABCG2 gefitinib (20 mg/kg, ip). El AUC de AZT disminuyó marcadamente en cerebro fetal en el grupo AZT respecto de los VEH. Este efecto fue abolido por inhibición de ABCG2. Nuestros resultados sugieren que la ausencia de toxicidad mitocondrial en el cerebro fetal en el grupo AZT, en comparación con 3TC, podría atribuirse a su baja acumulación en el tejido causada por la inducción de ABCG2. Cualquier interferencia con la actividad de ABCG2 aumentaría la cantidad de AZT que llega al cerebro fetal, aumentando su riesgo de toxicidad.

Descripción: El objetivo general de este trabajo fue evaluar el potencial de remoción de PCBs de hongos de pudrición blanca nativos de la provincia de Misiones para su posterior uso en estrategias de biorremediación. Se seleccionaron tres cepas con elevada tolerancia a los PCBs y productoras de enzimas ligninolíticas en medio sólido. Lentinus sajor-caju LBM 105 presentó el mayor porcentaje de remoción de PCBs, 95% y 92% en un medio de cultivo complejo y en un medio sintético deficiente en nitrógeno respectivamente luego de 35 días de incubación. Los PCBs produjeron cambios en el crecimiento fúngico, en la morfología y en la actividad enzimática lacasa de las tres cepas evaluadas. La aplicación de tratamientos de bioestimulación con bagazo de caña de azúcar y de bioaumentación con monocultivos y co-cultivos de L. sajor-caju LBM 105 y Pycnoporus sanguineus LBM 105 resultó efectiva para remediar suelo contaminado con PCBs. El tratamiento de bioaumentación con el co-cultivo removió 91% de PCBs, seguido del tratamiento con L. sajor-caju LBM 105 (90%). El tratamiento con P. sanguineus LBM 105 y el tratamiento de bioestimulación removieron el 88% de la concentración de PCBs. Además, se redujo la toxicidad y mejoró la calidad del suelo tratado.

Descripción: Hay evidencias que el mecanismo de acción de las drogas utilizadas para el tratamiento de la enfermedad de Chagas, nifurtimox y benznidazol, como de las naftoquinonas (NQs) es la reducción de dichos compuestos por reductasas parasitarias. Nuestro grupo de trabajo previamente identificó una aldo-ceto reductasa dependiente de NADPH de Trypanosoma cruzi, agente etiológico de esta enfermedad, denominada TcAKR. A fin de identificar nuevas reductasas involucradas en el metabolismo de drogas tripanocidas, los objetivos de este trabajo fueron: i- realizar la caracterización biológica y bioquímica de la TcAKR, ii- evaluar su participación en el mecanismo de acción de drogas tripanocidas y iii- dilucidar su rol fisiológico. Los resultados indican que la TcAKR es una proteína oligomérica, citosólica y que se expresa en todos los estadíos del parásito. La TcAKR posee actividad reductasa con o-NQs, entre ellas, el agente tripanocida ?-lapachona, con producción de radicales libres y con benznidazol. Estudios con epimastigotes que sobre-expresan TcAKR sugieren que esta enzima está involucrada en la activación de la ?-lapachona y, contrariamente, en la detoxificación del benznidazol. A nivel fisiológico, se muestran indicios de la participación de esta enzima en el catabolismo del glicerol cumpliendo el rol de glicerol dehidrogenasa.

Descripción: Burkholderia contaminans es la especie del complejo Burkholderia cepacia prevalente en pacientes con fibrosis quística (FQ) de Argentina. Además es detectada en productos contaminados y está asociada a infecciones hospitalarias en pacientes no FQ. Caracterizamos fenotípica y genotípicamente aislamientos clínicos e industriales de B. contaminans (n=24). La mayoría de los aislamientos presentaron comportamientos similares a la cepa tipo, aunque algunas características como la producción de hemólisis y la formación de biofilms resultaron cepa dependientes. Se demostró la resistencia a diversos antibióticos y virulencia en modelos alternativos de infección. En seis aislamientos la reacción que detecta la isla genómica BCESM fue positiva y en ninguno se encontró el sistema cable pili. Mediante herramientas de epidemiología molecular observamos la co-localización de aislamientos clínicos e industriales. Por otro lado, secuenciamos el genoma de un aislamiento obtenido de un paciente FQ; y observamos un gran número de genes asociados virulencia y resistencia a antibióticos. Finalmente demostramos que los métodos de conjugación y electroporación pueden ser empleados exitosamente en la manipulación genética de esta especie. Estos conocimientos podrían generar una mejora en el tratamiento de pacientes; permiten señalar a los productos contaminados como potencial fuente de infección; y orientan posibles futuros estudios con B. contaminans.

Descripción: El género Cladorrhinum (Phylum Ascomycota) incluye hongos saprótrofos del suelo, entre sus representantes, C. foecundissimum, ha sido reportado como un potencial agente de biocontrol y como promotor de crecimiento como endófitos en raíces de algodón. Entre sus habilidades biotecnológicas, se reportó la síntesis de endo-1,4-?-glucanasas y celobiohidrolasas. En este trabajo de tesis se planteó un estudio polifásico del género Cladorrhinum spp., incluyendo aislamientos nativos de Argentina. El estudio fue abordado analizando el rol de estas cepas en la promoción del crecimiento vegetal, como agente de biocontrol y su habilidad para sintetizar enzimas de importancia biotecnológica, así como también su bioprospección a nivel genómico. Con el fin de seleccionar algunas de estas cepas con potencial como biofungicidas y biofertilizantes, se desarrollaron ensayos en laboratorio y en cámara de cultivo, analizando aspectos relacionados a su fisiología y sus potenciales aplicaciones biotecnológicas. Se comprobó que la especie C. samala superó a C. foecundissimum en las actividades reportadas para esta especie. La alta variabilidad intra-específica encontrada en cepas nativas de Cladorrhinum spp. avala la importancia de este tipo de estudios y la conservación en bancos de germoplasma. De este modo se resguarda la biodiversidad fúngica del suelo.

Descripción: Diversas estrategias han sido propuestas en la búsqueda de una cura a la infección por HIV, muchas dependen de la actividad antiviral de los LT CD8+ (LTCD8). El objetivo de esta tesis fue investigar la funcionalidad y el fenotipo LTCD8 HIV-específicos expandidos in vitro, obtenidos de individuos HIV+ bajo tratamiento antirretroviral combinado (cART). Según el momento de inicio del cART, se reclutaron dos grupos, grupo de inicio del tratamiento temprano (TTe) o tardío (TTa). Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica y fueron expandidas con pooles de péptidos de Nef y Gag. Post-expansión se evaluó sobre los LTCD8 la especificidad, funcionalidad, diferenciación del fenotipo de memoria, expresión de PD-1, y la actividad antiviral. A pesar de que la respuesta se encuentra disminuida post-cART, ésta pudo ser específicamente expandida in vitro, demostrando un perfil polifuncional y de memoria efectora, y elevada capacidad de mediar actividad antiviral. El momento de inicio del tratamiento impactó en la diferenciacion del fenotipo de memoria, posiblemente reflejando diferencias en la duración de la estimulación antigénica sobre el sistema inmune. En ambos grupos, se encontraron características de la respuesta inmune antes del cART que podrían actuar como biomarcadores de las células que persisten post-cART. Estos resultados tienen implicancias importantes en el diseño de estrategias que busquen modular la respuesta LTCD8.

Descripción: El virus de Epstein-Barr (VEB) es un herpesvirus humano que infecta B y se mantiene silente a lo lardo de toda la vida, ocasionando, sólo en ciertos individuos el desarrollo de linfomas. Es un virus que afecta a más del 90% de la población mundial, quienes presentan serología de tipo IgG positiva. La infección se desarrolla en forma diferencial en pacientes de países desarrollados en comparación con países en vías de desarrollo como Argentina. En el primer caso la infección primaria se manifiesta como Mononucleosis infecciosa (MNI), mientras que en el segundo caso en forma asintomática. En Argentina la mayoría de los niños son seropositivos a la edad de tres años y en dicha población se demostró además una asociación entre el EBV y el linfoma en niños menores de 10 años. Se han descripto dos modelos de infección del EBV, por un lado del modelo de centro germinal (CG), donde el virus accede a linfocitos B ?naive?, sigue el proceso de maduración de linfocitos B a lo largo de CG, hasta terminar formando parte de linfocitos B de memoria. Por otro lado el modelo de infección directa describe que el EBV accede en forma directa a linfocitos B de memoria sin experimentar el CG. Dado que en Argentina la infección primaria es mayormente subclínica a edades tempranas, las amígdalas de los niños representan una población interesante donde analizar la infección por EBV, especialmente considerando que la mayoría de los estudios generalmente se realizan en sangre de pacientes adultos y en países desarrollados. El objetivo fue caracterizar la infección por el EBV en pacientes pediátricos, para definir si la carga viral, el perfil de expresión de proteínas virales, el tipo de célula infectada y/o el microambiente son responsables de la presentación subclínica y/o de la potencial participación del virus en el desarrollo de linfomas. Se estudiaron 142 amígdalas de pacientes pediátricos de entre 1-15 años de edad. Se utilizó la técnica de inmunohistoquímica (IHQ) para detectar LMP1 con el fin de determinar el estatus de EBV, o la técnica de inmunofluorescencia indirecta para detectar, en un subgrupo de pacientes, IgM contra antígenos de la cápside viral (VCA). Del total de 92 pacientes, estudiados a través de la IHQ para LMP1 (76 evaluables), 69 casos resultaron positivos y fueron llamados ?pacientes infectados?, 7 casos fueron LMP1-, y en una etapa posterior del trabajo de tesis, se estudiaron 50 pacientes por serología y se seleccionaron 12 casos para caracterizar a los ?pacientes primoinfectados?, dada su serología positiva para IgM contra el antígeno VCA del EBV. Se realizó un Análisis cualitativo de las características virales mediante HIS, IHQ, qPCR-MCL para dianas, entre ellas, LMP1, LMP2A, EBNA2, 3A y 3C, BMRF1 y BHRF1; se estudió el tipo de célula infectada por medio de la doble marcación EBERs y ya sea, CD20, CD3, IgD o CD27, además de la carga viral por qPCR y del análisis por HIS para ARN virales utilizando sondas específicas. Dichos datos permitieron establecer las características cualitativas de la infección por EBV en pacientes pediátricos. Se realizó también un Análisis cuantitativo del microambiente inmunológico mediante IHQ para CD8, GzB, CD60, IL10, Foxp3, PD1, CD56, CD4. Finalmente, se compararon los datos obtenidos entre casos EBV+ vs EBV- y entre ?pacientes infectados? vs ?pacientes primoinfectados?. Observamos expresión de antígenos a lo largo de todas las regiones de la amígdala: subepitelial (SE), CG, interfolicular (IF) y en el epitelio. Se observó marcación de antígenos virales en los linfocitos SE de niños con bajas edades, lo que probablemente indica una infección reciente. En pacientes mayores, el EBV se detectó principalmente en las células epiteliales, lo que sugiere que podrían haberse infectado hace algún tiempo. Además los ?pacientes primoinfectados? presentan llamativamente el perfil de latencia LI y LII, mientras que los ?pacientes infectados? son los que presentan el perfil LII o la clásica expresión de antígenos asociada a MNI (LIII). La falta de síntomas clínicos probablemente se deba a la baja carga viral, a la baja expresión de antígenos, y a la respuesta inmunológica local en el sitio de ingreso del virus al organismo. Los modelos e infección no son mutuamente excluyentes en nuestra población, ya que se observa la infección por el EBV en linfocitos B ?naive? preferentemente localizados en la región IF, pero el perfil LII asociada a NO CG y LIII asociada a CG, con prevalencia de las proteínas LMP1 y LMP2A en la región que se encuentra fuera del CG (No CG). El incremento de las poblaciones CD8, GrB y CD68 en la región SE podría indicar una respuesta específica en el sitio de entrada del virus al organismo, que podría contrarrestarse con la citoquina inmunosupresora como IL10. En relación con desarrollo de linfomas, la respuesta sostenida de CD4 en CG de amígdalas de pacientes pediátricos, se pierde en pacientes con linfomas derivados de centro germinal, elemento que podría tener que ver con la patogenia del EBV asociado a linfomas. El aumento de poblaciones CD4 y de CD58 en el CG podría estar involucrado en el control del crecimiento de linfocitos B inducido por EBV. La expresión de LMP1 y de otras proteínas virales con características oncogénicas en CG podría ayudar en este proceso. Una falla en la respuesta del microambiente y/o la expresión de antígenos virales específicos con capacidad oncogénica en ciertas regiones histológicas podrían eventualmente asociarse al desarrollo posterior de linfomas en pacientes de corta edad como una complicación de la infección en nuestro país.

Descripción: Durante las últimas etapas del ciclo de replicación del VIH-1, la poliproteína viral Gag es reclutada a un dominio particular de la membrana plasmática, denominado plataforma de ensamblado viral. Allí, Gag interactúa con el fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato para iniciar el ensamblado de VIH-1. Las vías de tráfico intracelular implicadas en el tráfico de Gag hacia el sitio de ensamblado viral, así como aquellas requeridas para la formación de este particular dominio de la membrana son poco conocidas, principalmente en Linfocitos T CD4+. En esta tesis doctoral nos propusimos estudiar el papel desempeñado por las proteínas RabGTPasa, reguladoras centrales de las vías de tráfico intracelular, en el proceso de ensamblado del VIH-1. A través de un tamizaje con ARN de interferencias, demostramos que 12 miembros de esta familia de proteínas son necesarios para la replicación viral. Mediante un minucioso estudio de biología celular, demostramos que la proteína Rab27a participa en la formación de un dominio de la membrana plasmática que funciona como plataforma para el ensamblado viral en linfocitos T CD4+. En efecto, Rab27a promueve la llegada de la enzima fosfatidilinositol 4-quinasa tipo 2 ? (PI4KII?) desde los endosomas tardíos hasta la membrana plasmática. En consecuencia, se produce un incremento localizado de los niveles de fosfatidilinositol 4-fosfato y subsiguientemente de PI(4,5)P2. Estos dominios ricos en PI(4,5)P2 son utilizados como sitio de reclutamiento de Gag, dando inicio de esta manera al ensamblado viral. A fin de adentrarnos aún más en el mecanismo responsable de la formación de la plataforma viral, investigamos e identificamos que tres efectores de Rab27a (Slac2-b, Slp3 y Slp2-a) son reclutados por esta GTPasa para llevar a cabo esta vía de tráfico. Concluimos que, al dirigir el tráfico de los endosomas tardíos que cargan la PI4KIIa hacia la membrana plasmática, Rab27a controla la síntesis localizada de PI(4,5)P2 y la replicación de VIH1.

Descripción: Trypanosoma cruzi, parásito causante de la enfermedad de Chagas-Mazza, divergió tempranamente del tronco común de los eucariotas, por lo que exhibe mecanismos atípicos en procesos muy conservados a lo largo de la evolución. Particularmente el proceso de transcripción ha sido muy estudiado, observándose diferencias como la ausencia de regulación pre-transcripcional, transcripción policistrónica y el agregado de la región no traducidas 5? por trans-splicing. Estas diferencias sugieren que la síntesis de proteínas podría también presentar características únicas; sin embargo el proceso de traducción en tripanosomátidos no ha sido estudiado en profundidad. En trabajos previos del laboratorio demostramos que los ribosomas de tripanosomátidos son resistentes a tricosantina, una toxina proteica que inhibe la actividad de ribosomas eucariotas. Además construimos un mapa de densidades electrónicas del ribosoma 80S de T. cruzi, donde se observaron características estructurales distintivas no encontradas en otros eucariotas. También encontramos particularidades en las secuencias y en los patrones de interacción de las proteínas que conforman el tallo ribosomal de T. cruzi, un complejo pentamérico esencial para la síntesis proteica ya que, junto con otras proteínas ribosomales y ARNr, median la interacción de distintos factores de traducción con el ribosoma, y controlan la actividad GTPasa de algunos de estos, entre ellos el Factor de Elongación 2 (EF2), responsable de la translocación del ribosoma durante la fase de elongación. Continuando con esta línea de trabajos es que decidimos abordar la caracterización del EF2 de T. cruzi (TcEF2). Debido a que existe una gran variabilidad genética dentro de la especie T. cruzi, esta ha sido subdividida en seis Unidades Discretas de Tipificación (UDT I-VI). Para evaluar la diversidad del TcEF2 en las distintas UDT, diseñamos primers a partir de las secuencias disponibles de la cepa CL Brener (UDT VI) y clonamos y secuenciamos el gen a partir de cepas pertenecientes a las demás UDT. A nivel de secuencias de ADN, si bien observamos una identidad mayor al 99% entre todas las UDT, encontramos 35 variaciones. De estas, 29 corresponden a transiciones y sólo 7 a transversiones únicamente de dos tipos (G?T y G?C). El 80% de las variantes afectan la tercera posición de los codones y no producen cambios en la secuencia aminoacídica, mientras que las restantes generan 6 cambios no-sinónimos. En reconstrucciones filogenéticas, las UDT I y II forman líneas independientes, mientras que las UDT III y IV, y las UDT V y VI, forman parte de sendos clados, acorde a los estudios existentes sobre la filogenia de T. cruzi. Construimos un modelo de la estructura proteica del TcEF2 unida a GDP e ión Magnesio, basándonos en el cristal de su ortólogo en Saccharomyces cerevisiae, con el que comparte una identidad en su secuencia aminoacídica del 57,6%. En el modelo observamos los seis sub-dominios clásicos de los EF2 eucariotas, así como la conservación de diversos residuos con importancia funcional: las cuatro hélices canónicas que forman el bolsillo GTPasa están conservadas, los aminoácidos que estabilizan el GDP y el ión Magnesio, la Histidina que es diftamidada posttraduccionalmente (His703), una de las dos Treoninas fosforilables (Thr57), las dos Lisinas (Lys511 y Lys617), y 8 de las 11 Argininas metilables. Este modelo se utilizó además para simular el efecto de las variaciones observadas en las distintas UDT, sobre su estabilidad estructural. Los resultados mostraron un aumento en la estabilidad de todos los TcEF2, excepto para las UDT III y IV en donde una Alanina en la posición 360 presenta un efecto altamente desestabilizante, si bien este efecto es disminuido gracias a la introducción de otra Alanina, en posición 367. Para estudiar la similitud a nivel funcional entre el TcEF2 y otros EF2, realizamos ensayos de complementación en levaduras, utilizando la cepa de S. cerevisiae GB2, la cual es knock-out para el EF2 y contiene una copia del factor endógeno bajo un promotor inducible por galactosa. Además de utilizar el EF2 de S. cerevisiae (ScEF2) como control positivo, clonamos el factor de Mus musculus (MmEF2), como representante de un organismo mamífero. Al estudiar la velocidad de crecimiento de cultivos de levaduras en condiciones de co-expresión del TcEF2 con ScEF2, observamos una aumento en los tiempos de duplicación, sugiriendo una posible inhibición competitiva. En los ensayos de complementación realizados, ni el TcEF2 ni el MmEF2, rescataron el crecimiento en la cepa GB2. Sin embargo, no fue posible concluir ningún efecto del TcEF2, ya que al analizar los niveles de expresión por Western Blot, encontramos que los factores heterólogos eran producidos en cantidades menores comparados con el factor endógeno. Para salvar este obstáculo, utilizamos un sistema de complementación in vitro donde, el TcEF2 rescató la traducción en polisomas de T. cruzi y de Rattus norvegicus. El TcEF2 tiene una similitud a nivel de amioácidos del 75%, con R. norvegicus, M. musculus y Homo sapiens, sin embargo, los residuos que contactan con los distintos componentes del ribosoma presentan una similitud del 83%. Por su parte, los residuos de las proteínas ribosomales (L9, L12, S23, S30 y P0) que contactan el EF2, presentan una similitud del 96,1%, y los ARNr (28S y 18S), una identidad del 88,2%, entre las de T. cruzi y las de los mamíferos estudiados. Nuestros resultados sugieren que, pese a las diferencias entre los EF2 de T. cruzi y mamíferos, el TcEF2 podría reemplazar funcionalmente al factor de mamíferos, probablemente debido a la alta conservación de los residuos que participan formando puentes de Hidrógeno y enlaces hidrofóbicos entre el EF2 y el ribosoma.

Descripción: El objetivo del presente trabajo de tesis fue caracterizar el papel del sistema de los IGFs en diferentes etapas del proceso tumoral en dos modelos de importancia en pediatría: el feocromocitoma, relacionado con enfermedad endócrina familiar y los gliomas, que son los tumores sólidos más frecuentes en los niños. Nuestros resultados in vitro e in vivo demuestran que en etapas tempranas del establecimiento tumoral la deficiencia del IGF-1R en células del microambiente tumoral determina la disminución de factores solubles y componentes de la matriz extracelular importantes para la supervivencia del feocromocitoma. Utilizando muestras de pacientes, demostramos una mayor expresión de IGF-1 en gliomas de alto grado, remarcando la importancia del circuito IGF1R/IGF1 en estos tumores. La caracterización in vitro de la localización diferencial del IGF-1R demostró que su localización nuclear podría contribuir a un fenotipo más agresivo de las células de glioblastoma incrementando su motilidad y metabolismo. Esto se manifestó in vivo en la aparición más temprana de tumores de crecimiento más rápido. Finalmente, la realización de un trabajo de tesis de estas características permitió la articulación entre grupos de investigación básica y clínica, consolidando de esta forma el objetivo de investigación básica traslacional.

Descripción: Las ATPasas de tipo P son un importante grupo de proteínas cuya función es el transporte activo. Comparten la característica de presentar intermediarios fosforilados durante el ciclo de reacción. La PMCA es uno de los mecanismos principales que determinan la homeostasis de Ca2+ citosólico modulando señales como segundo mensajero. Los fluoruros de aluminio, berilio y magnesio estabilizan análogos de los intermediarios fosforilados. En esta tesis caracterizamos su efecto sobre PMCA, mostrando que: (1) Los compuestos de fluoruro forman complejos estables e inhiben las actividades de la PMCA. (2) La fluorescencia de sondas que se unen al sitio de unión del nucleótido de la PMCA se reduce frente a la unión de complejos de fluoruro (3) La variación de la fluorescencia permite seguir los cambios conformacionales y estudiar el mecanismo de unión de los complejos de fluoruro a PMCA, así como detectar la actividad Ca2+-ATPasa en tiempo real. (5) La unión de calmodulina a PMCA produce cambios significativos de los segmentos transmembrana, no modificados por los complejos de fluoruro, indicando que la calmodulina puede unirse en E2-P. Estos resultados constituyen un aporte significativo para dilucidar la relación estructura-función de la PMCA durante el su complejo ciclo de reacción.

Descripción: Las inmunodeficiencias primarias (IDP) son enfermedades congénitas de presentación clínica heterogénea y representan trastornos hereditarios causados por mutaciones que afectan el desarrollo y/o función de diversos compartimentos del sistema inmune, que predisponen a los pacientes a infecciones, autoinmunidad, alergia y cáncer. Al día de la fecha se han descripto más de 300 genes responsables de diversas IDP. En las IDP con disregulación inmune, los mecanismos normales para mantener la homeostasis de la respuesta inmune fallan y conducen a una respuesta inapropiada (por falta o exceso), acompañada de daño a las células del huésped. En este trabajo de Tesis de Doctorado se realizó la caracterización fenotípica y funcional de subpoblaciones de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con mutaciones en CD25, STAT5b, STAT1 y STAT3 que cursan con síndromes disregulatorios. Este estudio nos ha permitido revelar el rol crítico del eje IL-2/CD25/STAT5b en la maduración de las células NK y en la regulación de la respuesta mediadad por anticuerpos a través de efectos sobre células T helper foliculares (Tfh) y su consiguiente impacto sobre la diferenciación de los linfocitos B (LB) con cambio de isotipo y células plasmáticas, lo que impacta en la disregulación del centro germinal (CG) y síntesis de autoanticuerpos. Por ello, STAT5b juega también un papel crucial en la respuesta inmune humoral y el mantenimiento de la tolerancia del sistema inmune. En resumen, empleando muestras de sangre periférica de pacientes con IDP hemos elucidado nuevos circuitos regulatorios en el sistema inmune humano, confirmando el hecho de que estos pacientes constituyen ?modelos naturales? que brindan una excelente oportunidad para elucidar mecanismos todavía desconocidos del sistema inmune humano.

Descripción: La activación inmune crónica y la inflamación son características de la infección por VIH-1 y una de las principales causas de eventos graves no relacionados con el SIDA en personas infectadas bajo tratamiento antirretroviral (TAR). En este trabajo de tesis, presentamos evidencias de que el ADN citosólico (ADNc) producido durante el ciclo de replicación del VIH-1 en células T CD4+ infectadas aumenta la actividad del Factor Inducible por Hipoxia 1 alfa (HIF-1?) que, a su vez, promueve la replicación viral. Además, demostramos que la inducción de HIF-1? promueve la liberación de vesículas extracelulares (VE) proinflamatorias. Estas VE fomentan la inflamación al inducir la secreción de interferón-? por parte de linfocitos T CD4+ y de IL-6 e IL-1? por macrófagos a través de una vía dependiente de HIF-1?. Cabe resaltar que las VE obtenidas del plasma de individuos infectados con VIH-1 también inducen la actividad de HIF-1? e inflamación en macrófagos. En conclusión, este estudio demuestra que HIF-1? juega un papel crucial en la patogénesis del VIH-1 al promover la replicación viral y la liberación de VE que orquestan respuestas inflamatorias mediadas por linfocitos y macrófagos.

Descripción: El ligando Wnt5a se encuentra sobre-expresado en melanoma y posee un rol en la motilidad, invasión y metástasis de estas células. Nuestros resultados indican que Wnt5a activa la vía de NF-kB, promoviendo la fosforilación y traslocación nuclear de p65, la fosforilación del complejo IKK y la degradación de IkBa. Este proceso es dependiente de ROR1 y Dvl2, miembros de la vía Wnt, y de TRAF2 y NIK, componentes de la vía NF-kB. Esta respuesta requiere de Akt y su inhibición impide la activación de p65. No obstante, en la línea SK-Mel 28, Akt es dispensable y la respuesta es mediada por PKCo y GSK3b. También demostramos que mediante un circuito autócrino Wnt5a regula la expresión y actividad basal de NF-kB. Finalmente, Wnt5a aumenta la actividad transcripcional de NF-kB y promueve la liberación de citoquinas pro-inflamatorias. En suma, demostramos un nuevo rol de Wnt5a en cáncer, que gracias a la activación de NF-kB, promueve la síntesis de citoquinas inflamatorias y contribuiría a crear el entorno inflamatorio e inmunosupresor que permite a las células de melanoma evadir la respuesta inmune del paciente en el microambiente tumoral. Estos resultados refuerzan la caracterización de Wnt5a como un nuevo y promisorio blanco terapéutico en melanoma.

Descripción: La esquizofrenia es un síndrome complejo del neurodesarrollo, afectado por factores genéticos y ambientales, y caracterizado por una colección heterogénea de síntomas. Para el diagnóstico de pacientes con esquizofrenia no existen aún hoy métodos de diagnósticos confiables. El tratamiento farmacológico por excelencia prescripto hoy en día son los antipsicóticos, que se unen y bloquean al receptor de dopamina D2. Se han relacionado a las disrupciones del sistema dopaminérgico con desordenes psiquiátricos como la esquizofrenia. Se postula que existe un sistema dopaminérgico hiper responsivo con la presencia de un hipocampo hiperactivo. Esto podría resultar por un funcionamiento anormal de las interneuronas GABAérgicas inhibitorias, particularmente las de parvalbúmina. Constituye un desafío construir modelos animales que permitan estudiar enfermedades psiquiátricas con etiología aún desconocida como la esquizofrenia. En este trabajo, se generó un modelo animal de ratón en donde se delecionó selectivamente el DRD2 de las interneuronas de PV (IPV), observándose características reminiscentes a la esquizofrenia. La misma exhibió alteraciones a nivel celular, molecular, fisiológico y de comportamiento, presentando fenotipos que son observados en pacientes con esta enfermedad. Además, los experimentos farmacológicos indicaron la importancia del DRD2 en las IPV para la efectividad de algunos antipsicóticos. La línea de ratón generado en el presente trabajo pretende constituirse en un nuevo modelo animal para poder estudiar la esquizofrenia en un camino hacia comprender su etiología.

Descripción: Esta tesis tuvo como objetivo desarrollar y caracterizar formulaciones de aplicación tópica, para su uso en piel y mucosas, que vehiculicen una combinación de extractos de Lippia turbinata y Lippia alba con actividad antibacteriana y antiinflamatoria. Los extractos hidroalcohólicos se obtuvieron mediante lixiviación con etanol 70º y se evaluaron sus propiedades fisicoquímicas y actividades biológicas ya mencionadas. Se elaboraron geles y emulgeles para aplicación en piel, y películas para aplicación en mucosa oral. Las formulaciones se caracterizaron en cuanto a sus caracteres organolépticos, propiedades físico-químicas, propiedades mecánicas, actividad antibacteriana y permeación in vitro; también se les realizó un control microbiológico. Luego fueron sometidos a estudios de estabilidad en distintas condiciones de temperatura y humedad. Los emulgeles no fueron estables. De los geles formulados, la formulación conteniendo Sepigel al 4% (p/p) presentó mejores características. Respecto a las formulaciones tipo película, el polímero HPMC al 1% (p/p) fue el más adecuado para el fin propuesto. Los resultados obtenidos demostraron la factibilidad de vehiculizar el extracto en una formulación de tipo gel y en películas ensayadas, logrando conservar el efecto antibacteriano del extracto y manteniendo la estabilidad en el tiempo sin el uso de conservantes antimicrobianos durante 18 meses.

Descripción: El presente trabajo de tesis propuso el desarrollo de un novedoso biomaterial compuesto, elaborado a partir de alginato y nanopartículas de biovidrio, con potencial aplicación en la ingeniería tisular ósea para el desarrollo de andamios tridimensionales multifuncionales con capacidad de liberar agentes terapéuticos como iones Cu2+ o Ca2+, y un bisfosfonato como el alendronato. El estudio preliminar del desarrollo de los biomateriales, sobre matrices en dos dimensiones, permitió evaluar la viabilidad de su aplicación en la elaboración de andamios tridimensionales. Luego, se demostró que los andamios desarrollados poseen propiedades interesantes en términos de morfología, porosidad, resistencia mecánica, bioactividad, biodegradabilidad y citocompatibilidad. Asimismo, es importante destacar que los andamios mostraron un perfil de liberación de Cu2+, Ca2+ y alendronato, adecuado para favorecer la proliferación de células óseas y endoteliales, así como la formación de vasos sanguíneos en un modelo considerado in vivo. Además, el trabajo de tesis planteó, por primera vez, el desarrollo y la validación de técnicas analíticas basadas en la electroforesis capilar para la cuantificación de los mencionados agentes liberados desde las matrices elaboradas. Dichos métodos resultaron simples, versátiles, económicos y eficientes, teniendo en cuenta que dichos agentes terapéuticos son liberados desde las matrices en concentraciones del orden de las partes por millón.

Descripción: En los últimos años, la nanotecnología ha sido de interés creciente en los campos de la medicina y la fisiología debido a que su aplicación podría mejorar considerablemente la detección y el tratamiento de enfermedades y, aunque el potencial es considerable, todavía hay muchos desafíos que deben abordarse antes de que se acepte el uso de los mismos rutinariamente a nivel clínico. En ese sentido, en este trabajo se sintetizaron, caracterizaron y evaluaron nanopartículas con el objetivo de aplicarlas en el diagnóstico y tratamiento del cáncer. Se observó que las NPs al ingresar al torrente sanguíneo podían interaccionar con los componentes de la sangre y en particular del sistema inmune, afectando las funciones de la cascada de coagulación, las plaquetas, los glóbulos rojos y activando a los macrófagos. Además, se desarrollaron protocolos de síntesis para obtener nanopartículas aptas para la encapsulación de fármacos y la unión de agentes de diagnóstico. También se observó que las mismas pueden degradarse en ambientes fisiológicos y patológicos, pudiendo liberar la carga que transporten. Asimismo se demostró que nanopartículas con anticuerpos monoclonales adsorbidos en su superficie fueron capaces de activar perfiles antitumorales en macrófagos y neutrófilos, y células tumorales, disminuyendo el tamaño de los tumores.

Descripción: La alergia a la leche de vaca es la alergia alimentaria más frecuente en lactantes. Las fórmulas hipoalergénicas hidrolizadas (HIF), altamente recomendadas para bebés alérgicos, prácticamente no poseen inmunorreactividad. Hoy en día, las metodologías de evaluación disponibles se desarrollan para detectar rastros de alérgenos. Por lo tanto, el objetivo de la presente tesis fue el desarrollo de estrategias, tanto de procesamiento como de control, para obtener un alimento hipoalergénico. Se diseñaron ELISA competitivos, capaces de detectar proteínas de la leche en el rango analítico requerido para la producción de HIF. Estas metodologías se utilizaron para evaluar el efecto de la aplicación de diferentes tecnologías de procesamiento sobre la antigenicidad de las proteínas. Los resultados mostraron que la aplicación de hidrólisis asistida por alta presión hidrostática fue capaz de disminuir la antigenicidad de las proteínas del suero lácteo en un tiempo corto de procesamiento. Los hidrolizados obtenidos se validaron in vivo mediante el uso de un modelo de ratón alérgico. Este trabajo permitió el diseño de una estrategia tecnológica efectiva, capaz de procesar suero en poco tiempo, logrando una reducción significativa en su alergenicidad.

Descripción: El interferón alfa (IFN?), es una proteína aprobada para tratar patologías virales y oncológicas que debe administrarse por vía parenteral. Nos propusimos desarrollar un sistema portador de IFN?-2b mediante una metodología simple, reproducible y económica que posibilite su administración oral. Se obtuvieron por gelificación ionotrópica nanopartículas de quitosano (NPsCT) de 47nm, esféricas, estables a pH 5,0-7,0 y mucoadhesivas. Además, resultaron seguras y de permeabilidad moderada a través de células colónicas in vitro. En el sistema cargado (NPsCT-IFN), la eficiencia de encapsulación fue del 98%; las características fisicoquímicas no se alteraron respecto al sistema blanco. La actividad antiviral in vitro de las NPsCT-IFN fue comparable al IFN? comercial. Tras la administración oral de NPsCT-IFN (0,3 MUI) a ratones Balb/C, el IFN? logró detectarse en plasma. Luego de 3 dosis diarias, las NPsCTIFN indujeron la producción de citocinas pro-inflamatorias en bazo, en mayor medida que el IFN? prístino por vía subcutánea, sugiriendo funcionalidad biológica de la droga. Así, reportamos por primera vez el desarrollo de una formulación que posibilitó la absorción del IFN? por vía oral, elucidando la posibilidad de que un medicamento biológico sumamente lábil pueda ser administrado de manera no invasiva y eventualmente más segura que la terapia convencional.

Descripción: En este trabajo de tesis se abordó el desarrollo y aplicación de tres materiales novedosos en el área de la química analítica y la remediación del medio ambiente. En primera instancia se desarrolló un biosensor con una fase de reconocimiento molecular altamente funcionalizada derivada de epóxido para contener la enzima. La etapa clave en la obtención del material modificador de la superficie del electrodo fue la polimerización radicalaria de la anilina (ANI) mediada por la enzima peroxidasa de soja (SBP) usando peróxido de hidrógeno como oxidante. Esta reacción se realizó in-situ sobre la superficie de un electrodo de carbón vítreo y juntamente con la copolimerización de ácido acrílico (AA) y etilenglicol diglicidil éter (EGDE), que cumplieron un rol estructural formando un entorno propicio para mantener la enzima activa sobre la superficie del electrodo y contribuir a la estabilidad del conjunto. La formación tanto de polianilina (PANI) como de poliacrilatos y aductos de EGDE fue verificada por espectroscopía UV-Visible y ATR-FTIR. SBP no sólo fue usada durante la síntesis del polímero conductor, sino que también fue el elemento de reconocimiento en el sensor electroquímico formado. El modo de detección elegido fue la amperometría en flujo, dando una buena una respuesta con elevada relación señal/ruido, buena precisión y selectividad. Para evaluar la aplicabilidad del sensor se analizó el contenido de peróxido de hidrógeno en una muestra comercial de blanqueador dental tanto por adición de estándar como por estándar externo, sin que hubiera diferencia significativa. En segundo lugar, se co-inmovilizaron complejos formados entre un nuevo material oligomérico y Cu junto con SBP para combinar sus capacidades catalíticas. El nuevo 156 material presentó grupos funcionales similares a otros oligómeros desarrollados previamente por el grupo de investigación, corroborado por FTIR, y con una capacidad similar de captación de iones metálicos. La comparación del perfil cromatográfico obtenido en la separación de ambos oligómeros por una columna de exclusión molecular y de sus electroferogramas mostró que los materiales obtenidos eran heterogéneos y presentaban una mezcla de productos similares, pero con una proporción diferente de las distintas poblaciones. Los nuevos oligómeros sintetizados sin peróxido de benzoilo conservaron la aplicabilidad de la variante precedente, pero presentaron la ventaja adicional de reducir el tiempo de síntesis en 12hs y también de poseer una menor citotoxicidad. Se utilizó el nuevo sistema catalítico para el tratamiento de efluentes textiles, tomándose como modelo el colorante naranja de metilo (MO). El catalizador para el proceso de decoloración se formuló en esferas por gelación ionotrópica entre alginato / oligómeros y clorhidrato de polietilenimina en presencia de SBP, y se usaron Ca(II) y Cu(II) para su endurecimiento. La distribución de los distintos elementos (N ,O, Cu, Ca) fue estudiada por medio de EDAX. Se comprobó la propiedad de los complejos formados entre Cu(II) y oligómeros, por medio de EPR y medición de oxígeno disuelto, para producir especies reactivas a partir del peróxido de hidrógeno El uso de la mezcla alginato / oligómeros evitó la coagulación del oligómero con el cobre, mejorando la accesibilidad de los sitios activos y facilitando su dosificación. La co-inmovilización de la enzima SBP en las esferas con los complejos con Cu(II) dio lugar a un efecto sinérgico en el proceso oxidativo. 157 El ultimo material desarrollado en esta tesis consistió en una resina de intercambio iónico basada en la reacción entre EGDE e imidazol (IM), el primer paso en la síntesis de los oligómeros previamente mencionados. El IM se utilizó tanto como catalizador en la apertura de los grupos epóxido, así como también aportando las cargas positivas permanentes provenientes de su disustitución y necesarias para la fijación de aniones; este uso dual es una innovación en esta clase de materiales. Al igual que el material anterior se investigó su aplicabilidad en el tratamiento de efluentes textiles, esta vez buscando la adsorción del colorante azo aniónico Remazol Black (RB). Los resultados de los estudios cinéticos e isotérmicos indicaron que la adsorción se producía de forma espontánea y con una afinidad sumamente alta. También se evaluó el efecto de sales interferentes sin hallar un impacto cuantificable. Se estudió el impacto del flujo, la concentración del adsorbato y la masas de adsorbente en un sistema de lecho fijo por medio de un diseño experimental, obteniéndose datos valiosos, como una relación positiva entre el aumento del caudal y la concentración del adsorbato, para facilitar en un futuro el escalado del proceso a un nivel industrial. Los intentos por regenerar la columna luego de la adsorción de RB por medio del tratamiento con sales, ácidos y álcalis no resultaron satisfactorios. Se probó la adsorción de MO, el cual pudo ser eficientemente recuperado al lavar la columna con una solución ácida que anulaba su carga neta negativa, corroborando el mecanismo de intercambio iónico. La microscopía SEM mostró cambios estructurales en el material luego de la adsorción del RB; esto se debió al apantallamiento de las cargas positivas en el material que le otorgaban su capacidad de hinchamiento, lo que coincidió con la 158 reducción de su volumen luego del proceso de adsorción. Pese a esta estrecha unión, no se evidenciaron cambios en los grupos funcionales al estudiar el colorante adsorbido en la resina por FTIR. La caracterización estructural se completó mediante un estudio de HR-MAS NMR. Se estudiaron las propiedades térmicas mediante calorimetría diferencial y termogravimetría, por medio de los cuales se pudo apreciar una reducción de la resistencia térmica al aumentar la proporción de EGDE en la mezcla de reacción.

Descripción: La leptospirosis es la zoonosis de mayor distribución en el mundo y se encuentra subdiagnosticada en muchos países, como en la Argentina. La enfermedad produce grandes pérdidas económicas en la producción pecuaria, especialmente, la producción bovina que cursa desde una sintomatología inaparente hasta grandes problemas reproductivos como el aborto y la mastitis. La región pampeana es donde se concentra la mayor cantidad de bovinos en la Argentina. La Microaglutinación (MAT) es el método diagnóstico serológico de referencia, pero la ejecución de la técnica requiere un operador experimentado y tiempo para obtener el resultado; solo se puede realizar en laboratorios especializados. Con el fin de disminuir y controlar la diseminación de la infección y reducir las pérdidas económicas, es importante un diagnóstico rápido y específico. El objetivo de la presente tesis fue desarrollar y validar un ELISA indirecto para la detección de anticuerpos IgG anti-leptospira en suero bovino de la región pampeana Argentina. Un extracto proteico de L. interrogans serovar Copenhageni, M20 se caracterizó y evaluó su inmunoreactividad frente a sueros controles positivos y negativos, mediante SDS-PAGE y WB. Se optimizó un ELISA indirecto usando como agente sensibilizante al extracto proteico obtenido. Se seleccionaron 316 sueros bovinos de la región pampeana de la Argentina de los años 2016, 2017 y 2018 para formar cinco paneles necesarios para la validación del método de ELISA. Se realizó la prueba MAT usando los siguientes serovares como antígeno: Leptospira interrogans Pomona Pomona, L. i. Canicola Hond Utrecht IV, L. borgpetersenii Castellonis Castellon 3, L. i. Wolffi 3705, L. i. Hardjo Hardjoprajitno, L. i. Copenhageni M 20, L. i. Tarassovi Perepelicin y L. kirschneri Grippotyphosa Moskva V. Panel A (sueros positivos fuertes): Wolffi (69.2%), Pomona (41.7%), Hardjo (12.1%), Copenhageni (3.3%) y Canicola (2.1%); Panel B (sueros positivos débiles): Wolffi (47.3%), Pomona (24.5 %), Hardjo (56.1%) y Canicola (5.2%); Panel C (sueros negativos): 100% negativos; Panel D: (sueros positivos a neospora, diarrea viral bovina (DVB) y brucella): 100% negativos y Panel E: (sueros bovinos vacunados con vacuna comercial): 100% <1/800. Se determinó la precisión del método de ELISA IgG. El coeficiente de variación (CV) con un intervalo de confianza del 95% (IC95%) para el control positivo fuerte (CPF) fue de 3.5% (2.86-4.46) y para el control positivo débil (CPD) fue de 7.1% (5.81-9.05) mostrando una excelente precisión del método. Se determinó la sensibilidad y especificidad diagnóstica del método, siendo 98.6% y 97.9%, respectivamente, en el punto de corte óptimo de 0.297, según el mayor índice de Youden. Se determinó la especificidad analítica del método de ELISA IgG. El presente trabajo demostró la no existencia de interferencia por interacciones cruzadas con neosporosis, brucelosis y DVB pero si con anticuerpos vacunales hasta el cuarto mes postvacunal. Se comparó el desempeño diagnóstico del ELISA desarrollado con extracto proteico como agente sensibilizante con un ELISA desarrollado con la proteína recombinante LipL32 como agente sensibilizante. Los resultados obtenidos para rLipL32 y Extracto respectivamente son: AUC=0,929 (0,891- 0,968), p<0,05 y 0,998 (0,994-1,0), p<0,05. Ambas AUC presentaron diferencias estadísticamente significativas (z=-3.825; p=0.00007). Se estimaron los valores de desempeño diagnóstico (sensibilidad=Se y especificidad=Sp) de ambos métodos con sus respectivos intervalos de confianza del 95% (IC95%) y se determinó el punto de corte óptimo (CO) mediante el mayor Índice de Youden (J=Se+Sp-1). El desempeño diagnóstico para rLipL32 fue: CO=0,203; Se=85,5%; Sp=86,6%; J=0,71 y el de lisado: CO=0,297; Se=98,6%; Sp=97,9%; J=0,95. La diferencia entre ambos métodos fueron: Dif (Se)= 13,04% (4,03-23,28); Dif (Sp)= 11,34% (4,07-19,59). Todos los análisis realizados permiten concluir que el ELISA con extracto tiene un desempeño diagnóstico mejor que el de la proteína rLipL32 para la detección de rodeos bovinos infectados con leptospiras. El presente ELISA desarrollado y validado podría ser una alternativa útil para la detección de bovinos infectados con leptospiras y colaborar con la técnica de MAT en el diagnóstico de leptospirosis en la región pampeana argentina. Actualmente no se encuentran disponibles sistemas de diagnóstico de leptospirosis accesibles para la aplicación en los grandes rodeos bovinos; por lo tanto el desarrollo de pruebas simples y accesibles de producción nacional permitiría la detección de los casos de leptospirosis en esa especie. Un diagnóstico correcto de la leptospirosis en los bovinos en la Argentina, mejoraría la producción bovina, como así también disminuiría la prevalencia de ésta importante zoonosis rural y urbana.

Descripción: El sistema renina angiotensina (SRA) y el sistema dopaminérgico renal (SDR) son capaces de modificar el manejo renal del sodio y de modular la inflamación, controlando funciones cuyas alteraciones conducen al desarrollo de hipertensión arterial y al daño renal. El presente trabajo de tesis doctoral tuvo como objetivo demostrar la existencia de un desbalance entre el SRA y el SDR asociado al desarrollo de hipertensión arterial y daño renal inflamatorio en un modelo experimental de síndrome metabólico por sobrecarga de fructosa, así como establecer la prevención de los procesos nocivos, mediante la inhibición farmacológica del SRA por tratamiento con losartan. Por último, estudiamos el comportamiento del índice urinario L-dopa/dopamina como potencial biomarcador de disfunción renal. Los resultados de esta tesis señalan que un sistema prohipertensivo y proinflamatorio como el SRA regula en menos a otro sistema antihipertensivo y antiinflamatorio como el SDR, estableciendo un circuito de retroalimentación positiva que conduce a la hipertensión arterial y la inflamación renal por sobrecarga de fructosa. Adicionalmente, demostramos la potencial utilidad del índice L-dopa/dopamina como marcador bioquímico más precoz que la microalbuminuria y como predictor de respuesta al tratamiento y seguimiento de la hipertensión arterial y el daño renal inflamatorio.

Descripción: Las leucemias agudas constituyen la neoplasia más frecuente en pacientes en edad pediátrica, y dentro de ellas, las Leucemias Linfoblásticas Agudas (LLA) representan aproximadamente el 75% de los casos. Actualmente, el 75% de los niños con LLA de diagnóstico inicial logran curarse con quimioterapia convencional, pero el 25% de los mismos presentarán una reaparición de la enfermedad, llamada recaída. En los últimos años, se han centrado los esfuerzos en identificar factores pronóstico que permitan adaptar la intensidad del tratamiento quimioterápico de acuerdo al riesgo individual de cada paciente. De esta manera, los pacientes con mayor riesgo de presentar recaídas reciben un tratamiento más intenso, mientras que los pacientes con menor riesgo de recaer reciben un tratamiento de menor intensidad. Esta adecuación del tratamiento permite, por un lado, disminuir la probabilidad de recaídas en los pacientes de mayor riesgo, y en los pacientes de menor riesgo, evitar la administración de tratamiento más agresivo, y por lo tanto de la potencial toxicidad aguda y secuelas, lo cual redunda a la vez en una mejor calidad de vida a mediano y largo plazo. Uno de los factores pronóstico independiente de mayor importancia lo constituye la enfermedad mínima residual (EMR), que permite evaluar la respuesta de la enfermedad al tratamiento instituido. El concepto de EMR hace alusión a la detección de células leucémicas que se encuentran en tan bajos niveles que no son detectables por los métodos estándares de estudio de la médula ósea ni por los estudios citogenéticos. Estos bajos niveles de enfermedad remanente, detectables sólo con métodos altamente sensibles, son los responsables de las posteriores recaídas de la enfermedad. Los métodos que cuentan con la sensibilidad adecuada para realizar la determinación de EMR son la citometría de flujo multiparamétrica (CFM) y las técnicas de diagnóstico molecular. Con respecto a las determinaciones por diagnóstico molecular, las técnicas descriptas a ser aplicadas para LLA son: cuantificación por PCR en tiempo real del transcripto de fusión BCR-ABL1, en pacientes LLA-Phi+, y de los rearreglos génicos de inmunoglobulinas (Ig) y receptores de linfocitos T (TCR). La mayoría de los protocolos de tratamiento internacionales actuales utilizan la EMR mediante rearreglos clonales de Ig/TCR para la estratificación de los pacientes, considerando a esta metodología como la técnica gold standard. Determinación de EMR en LLA pediátrica mediante PCR cuantitativa. Utilidad clínica. Es importante tener en cuenta que la aplicabilidad de la caracterización de los rearreglos Ig/TCR no se limita sólo a la determinación de la EMR. Como ya ha sido comentado, existe un porcentaje de niños con LLA que presentarán recaída de la enfermedad. En la mayoría de los casos, la reaparición de células leucémicas corresponde a una verdadera recaída, sin embargo, es necesario excluir la posibilidad de que se trate de una segunda enfermedad maligna. Además, se han descripto en la literatura casos inusuales de conversión de linaje de las células leucémicas durante el curso de la enfermedad llamados switches de linaje. El análisis comparativo entre los rearreglos clonales encontrados al diagnóstico y en la sospecha de recaída de la enfermedad permite diferenciar entre recaída de la LLA, switch de linaje y segunda enfermedad maligna, con consecuencias en la elección terapéutica. El presente trabajo de tesis tiene entre sus objetivos describir la incidencia y estabilidad clonal de rearreglos de Ig/TCR, estudiar su utilización como marcadores de identidad clonal, analizar su aplicabilidad para la determinación de EMR, correlacionar los resultados de la EMR mediante Ig/TCR con otras metodologías (CFM y BCR-ABL1 en LLA-Phi+); y evaluar el impacto pronóstico de la EMR mediante Ig/TCR en nuestra población de pacientes pediátricos con LLA. La población de estudio estuvo constituida por los pacientes pediátricos con diagnóstico de LLA de los centros integrantes de la Sociedad Argentina de Hemato-Oncología Pediátrica. Fueron estudiados 769 pacientes para la descripción de incidencias de rearreglos Ig/TCR, 455 pacientes para EMR y 39 pacientes para estudios de identidad clonal. En cuanto a los resultados del presente trabajo de tesis, el estudio de incidencia de rearreglos Ig/TCR permitió definir el perfil de reordenamientos génicos más frecuentes en nuestra población de pacientes, a fin de establecer los rearreglos de elección como blancos de seguimiento para EMR. En el 96% de los pacientes fue posible caracterizar rearreglos de Ig/TCR detectando un total de 2506 reordenamientos. Además, la comparación de rearreglos Ig/TCR entre muestras de diagnóstico inicial de LLA y de la recaída permitieron identificar 24 recaídas reales, 6 switches de linaje y 9 posibles segundas enfermedades malignas. Determinación de EMR en LLA pediátrica mediante PCR cuantitativa. Utilidad clínica. La EMR pudo ser aplicada en forma exitosa en el 89% de los casos estudiados, permitiendo identificar grupos de pacientes con pronósticos diferentes. Para ello, fueron diseñados en total 675 primers-paciente-específicos con sensibilidad adecuada. De la comparación de métodos pudimos observar una excelente correlación de los valores de EMR entre rearreglos de Ig/TCR y los hallados por CFM, con un 92% de resultados concordantes al día 33 y 97% al día 78 de tratamiento. Los mismos resultados no fueron encontrados al comparar la EMR mediante reordenamientos Ig/TCR y la cuantificación del transcripto BCR-ABL1 en pacientes LLAPhi+, donde se observaron resultados concordantes en el 46% de los casos. Los resultados que forman parte del presente trabajo de tesis constituyen el primer estudio realizado en nuestro país sobre la detección y caracterización de rearreglos de inmunoglobulinas y receptores de linfocitos T, así como la determinación de la Enfermedad Mínima Residual en número muy significativo de pacientes, que ha permitido confirmar el valor de la misma como un importante factor pronóstico en LLA pediátrica.

Descripción: Nuestro conocimiento actual acerca de las enfermedades y sus tratamientos comienzan con estudios preclínicos en animales y/o células en cultivo. Sin embargo, la mayoría de estos estudios se llevó a cabo sin tener en cuenta el sexo como una variable biológica importante. Estudiamos ratas Sprague Dawley (SD) y ratones C57Bl/6J de ambos sexos en condiciones basales y demostramos la existencia de dimorfismo sexual en el perfil de los transportadores y canales de Na+ y K+ a lo largo del nefrón. Una menor reabsorción fraccional de Na+ y agua en el túbulo proximal de las hembras promueve una mayor reabsorción a nivel del nefrón distal, la cual facilita la secreción de K+ y mantiene su concentración plasmática más baja en relación a los machos. Además, en ratas SD, la respuesta hipertensiva a la Ang II fue similar en machos y hembras, pero los mecanismos involucrados presentaron dimorfismo sexual. La dieta rica en K+ atenuó la estimulación de NCC en los machos y de NKCC2 en las hembras, promoviendo así la excreción de Na+. En conclusión, la existencia de diferencias de sexo en el desarrollo de hipertensión arterial debería tenerse en cuenta a la hora de prevenir, diagnosticar y tratar la enfermedad.

Descripción: La sobreexpresión de GRK2 está asociada al desarrollo de numerosas patologías con una demanda terapéutica insatisfecha. Evidencias demuestran que su dominio homólogo a RGS media la desensibilización de GPCRs independientemente de su fosforilación. Como el potencial de GRK2 como blanco terapéutico podría residir en su actividad RGS, realizamos un screeningvirtualde la biblioteca de Enamine, centrando undocking en su dominio RH. De trece compuestos (C1-C13) con buenas energías de unión in silico, cuatro presentaron actividad in vitro. C2, C3, C4 y C5 potenciaron la respuesta de AMPc del rH2, inhibieron la translocación a membrana de GRK2 inducida por la sobreexpresión del receptor, e inhibieron la coinmunoprecipitación entre GRK2 y G?s. Como evaluación preliminar de propiedades ADMET, observamos que todos los compuestos presentaron una lipofilia adecuada, pero C3 y C5 se destacaron por no afectar la viabilidad celular. Tras descartar C5, por potenciar también la respuesta de calcio del rH1, C3 fue empleado como prototipo para diseñar análogos. De los seleccionados para su síntesis y evaluación biológica, uno inhibió la actividad RGS de GRK2 al potenciar la respuesta de AMPc del rH2. Estos inhibidores serán de utilidad para estudiar las funciones del RH de GRK2, y a futuro podrían sentar las bases para la terapia farmacológica de patologías debidas a una actividad exacerbada de GRK2.

Descripción: La sepsis es una enfermedad de gran impacto en la salud pública dada su alta tasa de morbi-mortalidad. En la actualidad S. aureus es el patógeno más frecuentemente aislado en pacientes sépticos con infección bacteriana documentada. Los eventos que conducen a la inmunosupresión asociada a la sepsis por S. aureus no han sido al presente completamente elucidados. Estudios recientes indican que la expansión temprana de MDSC de tipo granulocítico es predictiva del desarrollo de infecciones nosocomiales secundarias en pacientes sépticos, lo cual sugiere un rol preponderante para dichas células en la supresión inmune. En este contexto, el rol que el TNF-? y la señalización por TNFR1 pudieran tener en la acumulación y funcionalidad de las MDSC se desconoce. En el presente trabajo, utilizando un modelo experimental de sepsis por S. aureus de origen peritoneal, se demostró por primera vez que las MDSC participan de la inmunosupresión asociada a dicha patología y que la señalización inducida por TNF-? a través de TNFR1 es crítica para la activación de las MDSC y su función supresora. Nuestros hallazgos contribuirán a establecer la potencialidad de considerar a las MDSC como blanco de terapias inmunomoduladoras que complementen las terapias convencionales en pacientes sépticos.

Descripción: En los últimos años la cebada cervecera se ha presentado como una alternativa de creciente interés como cultivo de invierno en la Argentina, siendo su principal destino el de la industria maltera para la fabricación de cerveza. La removilización de asimilados desde las hojas desarrolladas es una fuente importante de nitrógeno, azufre y carbono para los granos en desarrollo. Este proceso juega un rol clave para lograr los objetivos de calidad impuesto por la industria maltera, entre los cuales se encuentra un rango acotado de proteínas en los granos. Una posible estrategia para mejorar la calidad de los mismos sin aumentar el uso de fertilizantes radicaría en aumentar la eficiencia de la removilización, para lo cual resulta fundamental estudiar la regulación de este proceso y los factores que lo afectan. Dado que en los últimos años se han registrado deficiencias de azufre en varias regiones del mundo, incluyendo la región Pampeana (principal zona de cultivo de cebada en la Argentina), en esta tesis nos planteamos estudiar el efecto de la deficiencia de azufre sobre el proceso de removilización de asimilados y los fundamentos bioquímicos y moleculares que subyacen, haciendo hincapié en el metabolismo y transporte a larga distancia del nitrógeno. Para ello trabajamos con plantas de cebada cultivadas en cámara de cultivo, invernáculo y a campo sometidas a diferentes disponibilidades de azufre, en las que se determinaron parámetros ecofisiológicos, bioquímicos y moleculares sobre los tejidos fuente y destino en distintos momentos del desarrollo de las plantas. En todas las condiciones ensayadas encontramos que la deficiencia de azufre inhibió el transporte de azúcares y aminoácidos a través del floema. Además, generó una disrupción significativa del metabolismo del nitrógeno, manifestado como un menor contenido de proteínas y una acumulación de aminoácidos y nitrato en los tejidos fuente y destino. Asimismo, produjo un retraso en el desarrollo y en la senescencia foliar, por lo que las plantas deficientes evidenciaron una menor biomasa aérea, menor emergencia de las espigas, una mayor sobrevida de las hojas y un mayor contenido de clorofila. Finalmente, produjo una inhibición de la expresión génica de todas las isoformas de la glutamina sintetasa, de cinco de los seis transportadores de aminoácidos y de siete de las ocho proteasas analizadas, todos ellos componentes clave en la asimilación y reciclado del nitrógeno dentro de la planta. En base a los resultados obtenidos podemos concluir que la inhibición en el transporte de aminoácidos vía floema causada por la deficiencia de S se correlaciona con una menor expresión de HvGS1_1, HvGS1_2, HvAAP6 y HvAAP7 en las plantas deficientes. A su vez, el retraso en la senescencia foliar es acompañado por un retraso en la inducción de las proteasas asociadas con este proceso. Sin embargo, el retraso en la inducción de tales proteasas no sería el factor desencadenante del retraso en la senescencia, ya que ambas condiciones pudieron ser inducidas por un estímulo hormonal aún en ausencia de azufre. Finalmente, sugerimos que el transporte de azúcares y aminoácidos vía floema regularía la expresión de los genes de hordeínas B y C, respectivamente, por lo que una adecuada disponibilidad azufre no solo sería esencial para promover la removilización de asimilados sino también para determinar la proporción en que las distintas fracciones de hordeínas son acumuladas en los granos.

Descripción: Estudiamos el efecto de bajas dosis de BNZ en diferentes modelos de ratones con infección crónica por Trypanosoma cruzi Nicaragua, con dos esquemas de administración de BNZ, continua e intermitente y combinado con ALO. El objetivo fue reducir la dosis total de droga administrada sin perder la eficacia. Observamos reducción de la parasitemia por qPCR, la serología por ELISA y del daño miocárdico por histopatología y electrocardiografía. Además, evaluamos el efecto de nuevas nanoformulaciones de BNZ que no fueron tóxicas para las células ni generaron hemolisis, lograron lisar tripomastigotes, inhibieron el crecimiento de amastigotes intracelulares y produjeron ROS en células Vero. En ratones con infección aguda y crónica las BNZ-nps lograron un 100% de sobrevida, redujeron la carga parasitaria a niveles indetectables y disminuyeron significativamente los niveles de anticuerpos específicos para T. cruzi. Los electrocardiogramas mostraron la normalización de las alteraciones de conducción, los niveles de inflamación del tejido cardíaco se redujeron y se inhibió la progresión de la fibrosis. Por lo tanto, el tratamiento intermitente podría considerarse un esquema con menor acumulación de droga e igualmente efectivo sobre la patología cardiaca, y las BNZ-nps podrían reducir la frecuencia de administración y los efectos no deseados evidenciados en pacientes.

Descripción: La disponibilidad de nitrógeno es un factor crítico para la productividad de los cultivos. La aplicación de fertilizantes nitrogenados sintéticos derivados del petróleo ha logrado disminuir parcialmente la deficiencia de nitrógeno en muchos cultivos. Sin embargo, la producción, la distribución y la aplicación de estos fertilizantes nitrogenados son procesos costosos que producen altas emisiones de gases de efecto invernadero, incluyendo el óxido nitroso (N2O). Una alternativa sustentable para mitigar el uso de fertilizantes nitrogenados es el cultivo de leguminosas capaces de fijar nitrógeno en asociación con bacterias simbiontes en órganos específicos denominados nódulos. Muchas leguminosas, entre las cuales se destacan la alfalfa, no solo son capaces de crecer sin fertilización nitrogenada, sino que además, aportan nitrógeno al suelo. Si bien las leguminosas juegan un papel clave en la sustentabilidad de la agricultura, los nódulos senescentes pueden constituir una fuente vasta de nitrógeno orgánico que derive en altas emisiones de N2O. En esta tesis doctoral, se presentan las bases moleculares que explican la alta emisión de N2O en el cultivo de alfalfa. Específicamente, se encontró que, durante el proceso de domesticación, las cepas utilizadas actualmente para inocular alfalfa a nivel comercial (Sinorhizobium meliloti B399 y Sinorhizobium meliloti B401) conservaron su capacidad de fijar nitrógeno en forma eficiente, pero perdieron su habilidad para degradar el N2O. Esta deficiencia se debe a la deleción del cluster NOS que codifica para el complejo enzimático N2O reductasa (NOS-). Durante la búsqueda de nuevos rizobios naturales amigables con el medio ambiente que contengan el cluster NOS (NOS+), se detectó la presencia de rizobios conteniendo genes de resistencia a antibióticos en plásmidos sintéticos. De esta forma, sería necesario una secuenciación genómica de los rizobios hipotéticamente naturales para garantizar una alta inocuidad ambiental y de salud pública de las bacterias promotoras del crecimiento vegetal. Por otra parte, el análisis bioinfomático y experimental de nuevos aislamientos de rizobios, mostró que en la naturaleza surgen mutantes espontáneas del gen napC que combinan alta eficiencia de fijación de nitrógeno con baja emisión de N2O. Además, un subgrupo de estas cepas naturales mostró tener similar eficiencia de fijación de nitrógeno y de nodulación en relación a la cepa comercial B399. De esta forma, los resultados de esta tesis doctoral sugieren que es posible avanzar hacia una producción sustentable de alfalfa, tanto en términos económicos como ecológicos.

Descripción: La célula de Sertoli (CS) constituye el componente somático del túbulo seminífero donde brinda soporte estructural y nutricional a las células germinales en desarrollo. La CS prolifera en los periodos fetal, neonatal y peripuberal y cesa su proliferación en la pubertad en la mayoría de las especies. Cada CS es capaz de sustentar un número limitado de células germinales de manera que el número alcanzado de CS durante los periodos proliferativos determinará la capacidad espermatogénica del individuo adulto. Simultáneamente con el cese de la proliferación comienza el proceso de maduración de la CS. Durante este proceso las células adquieren la capacidad de formar uniones estrechas entre células vecinas, siendo las mismas el componente fundamental de la barrera hemato-testicular (BHT). El establecimiento de la barrera trae como consecuencia que las células germinales presentes en el compartimiento adluminal queden aisladas de la circulación y dependan de los productos de secreción de la CS para su desarrollo. Una de las funciones más relevantes de la CS madura es la de nutrir a las células germinales. Para cumplir dicha función las CS poseen un metabolismo energético particular. Por un lado, la glucosa es metabolizada mayoritariamente a lactato, principal sustrato energético para las células germinales. Por otro lado, los ácidos grasos son utilizados como principal fuente energética propia y además sirven para la producción de cuerpos cetónicos que también serán aportados como nutrientes a las células germinales. La Metformina es un antihiperglucemiante ampliamente utilizado para el tratamiento de la diabetes. Recientemente ha sido aprobada para el tratamiento en niños y adolescentes que no logran un control adecuado de la patología mediante cambios en la dieta y en el estilo de vida. Sin embargo, no se ha estudiado en detalle si Metformina administrada en etapas tempranas de la vida puede alterar la función testicular. En particular, no se conoce si la exposición a Metformina podría modificar el normal funcionamiento de la CS. El objetivo general de la Tesis es dilucidar si el tratamiento con Metformina en etapas tempranas de la vida puede alterar la proliferación y las funciones diferenciadas de las CS y por lo tanto 146 condicionar la fertilidad futura. Para alcanzar este objetivo se analizó: 1) el efecto del tratamiento con Metformina in vitro sobre la regulación hormonal de la proliferación de las CS inmaduras y sobre los mecanismos moleculares involucrados, 2) el efecto del tratamiento con Metformina de ratas macho neonatas sobre la proliferación de las CS inmaduras y su posible efecto a largo plazo sobre la capacidad espermatogénica de los animales adultos, 3) el efecto del tratamiento con Metformina in vitro sobre el metabolismo energético y la función nutricional de las CS madura y 4) el efecto del tratamiento con Metformina in vitro e in vivo sobre el establecimiento de una barrera de permeabilidad entre CS vecinas. En cuanto a la proliferación celular, los resultados obtenidos in vitro en cultivos de CS inmaduras indican que el tratamiento con Metformina es capaz de activar la AMPK e inhibir la vía mTORC1/p70S6K. Asimismo, muestran que Metformina disminuye el estímulo ejercido por FSH en la proliferación de la CS y que dicha disminución se acompaña de una reducción en la expresión de ciclinas (ciclinas D1-D2 y E1-E2) y de un incremento en la expresión del inhibidor del ciclo celular p21Cip1. Adicionalmente, el tratamiento neonatal de ratas con Metformina desde el dpn3 al dpn7, periodo en el cual la CS prolifera activamente, es capaz de reducir la proliferación de la CS. Esta disminución se acompaña de una menor expresión de ciclinas D1 y E2 y de un incremento en la expresión del inhibidor p21Cip1 en las CS. En cuanto a los efectos a largo plazo, se demostró que el tratamiento neonatal con Metformina disminuye la producción diaria de esperma sin modificar la morfología y motilidad espermática, sugiriendo que la disminución en la proliferación de las CS impactaría sobre la capacidad espermatogénica de los animales adultos. En cuanto al perfil metabólico, Metformina incrementa la producción de cuerpos cetónicos y de lactato, esenciales para la función nutricional que ejerce la CS. Sin embargo, Metformina disminuye la oxidación completa de ácidos grasos que se acompaña con una disminución en la expresión de CPT1 y de MCAD, proteínas que participan en dicho proceso oxidativo. Dado que los ácidos grasos son la principal fuente energética para la CS, la disminución observada podría alterar la homeostasis energética del túbulo seminífero. 147 Con respecto al efecto sobre la barrera de permeabilidad entre CS en cultivo, Metformina causó una disminución en la TER acompañada de un descenso en los niveles de expresión de claudina 11, ocludina, ZO-1 y conexina 43, proteínas que forman parte de las uniones que componen la BHT. Asimismo, el tratamiento de ratas con Metformina desde el dpn15 al dpn30, periodo clave en la formación de la BHT, produce un incremento en el porcentaje de túbulos permeados, sugiriendo una alteración en la permeabilidad de la BHT. El presente trabajo pone en evidencia que Metformina puede interferir con el normal funcionamiento de la célula de Sertoli en diferentes etapas de maduración. En particular, es capaz de modificar la proliferación, el metabolismo energético y la formación de la barrera de permeabilidad que establecen las células de Sertoli. Este trabajo intenta ser un aporte más hacia la compresión de los factores y mecanismos moleculares que en etapas tempranas de la vida podrían alterar la función reproductiva masculina y condicionar la fertilidad futura.

Descripción: Los trastornos del espectro autista (TEA) son considerados una sinaptopatía para la que aún no existe tratamiento farmacológico. Utilizando el modelo experimental de autismo por administración prenatal de ácido valproico (VPA) nos propusimos identificar nuevos blancos moleculares para el diseño de estrategias terapéuticas basadas en la modulación de la conectividad sináptica. A día postnatal (DPN) 35, cuando ya se encuentra instaurado el déficit en la interacción social y exploratoria, evidenciamos un desbalance en la expresión de la molécula de adhesión neuronal (NCAM) y su forma polisialilada (PSA-NCAM) en el hipocampo y la corteza prefrontal medial de los animales VPA. Dado que tiene blanco sináptico, se propuso a la fluoxetina (F) como candidato a modular el balance NCAM/PSA-NCAM. El tratamiento con F (10 mg/kg) entre DPN 16-30 corrigió el déficit en la actividad exploratoria y algunos aspectos de la interacción social de los animales VPA y normalizó el balance NCAM/PSA-NCAM de la mPFC. Los tratamientos con F en una ventana temporal posterior (10 mg/kg; DPN 23-37) y con la mitad de la dosis (5mg/kg; DPN 16-30) no produjeron beneficios conductuales adicionales. Estos hallazgos proveen herramientas para elaborar un enfoque racional del uso de las terapias farmacológicas en los TEA.

Descripción: Los objetivos fueron demostrar que la sobrecarga aguda y/o crónica de cloruro de sodio provoca una inflamación renal y vascular, evidenciada por la sobreexpresión de marcadores inflamatorios y fibróticos. Se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley, infundidas en forma aguda con solución salina hipertónica o alimentadas con dieta hipersódica durante 3 semanas, con y sin tratamiento con losartán (bloqueante AT1R) o tempol (inhibidor del estrés oxidativo). La sobrecarga de sodio aguda aumentó el trabajo reabsortivo en los túbulos proximales, generando hipoxia relativa sobre-expresándose el HIF-? y el ANP renal como mecanismos de adaptación. Se activó el componente hipertensor del sistema renina angiotensina local con sobreexpresión de angiotensina II, receptor AT1 (AT1R) y NF-kB, y se inhibió el componente vasodepresor y anti-inflamatorio (eje ECA2-Ang(1-7)-MasR, AT2R y eNOS), aumentando la liberación de citoquinas, quemoquinas proinflamatorias (TGF-1?), pro-fibróticas (?-SMA) y el estrés oxidativo. La sobrecarga salina disminuyó la expresión de acuaporina-1 y acuaporina-2, inhibiendo el transporte de agua en túbulos renales y favoreciendo la inflamación. Si la sobrecarga aguda se transforma en crónica mediante la dieta hipersódica, a la inflamación renal se suma la fibrosis crónica. Estos procesos fueron prevenidos, atenuados o revertidos mediante el bloqueo de AT1R con losartán o la inhibición del estrés oxidativo con tempol.

Descripción: La ateroesclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica compleja producida por la interacción entre múltiples factores genéticos y distintos estímulos externos. El programa de activación y disfunción del endotelio vascular es una de las principales conexiones entre la exposición a los factores de riesgo y el desarrollo de la ateroesclerosis. Las modificaciones cualitativas y cuantitativas de los componentes de la matriz extracelular vascular (MECv) son una manifestación temprana de la activación endotelial. Particularmente, han sido descriptas modificaciones en el patrón de sulfatación y elongación de las cadenas de los glicosaminoglicanos condroitín sulfato y dermatán sulfato, en la aterogénesis. Los complejos de polielectrolitos (PECs) que incluyan glicosaminoglicanos en su formulación podrían utilizarse para diagnosticar y tratar la enfermedad vascular. Los resultados obtenidos en esta tesis muestran que el dermatán sulfato de bajo peso molecular (LMMDS) modula los eventos tempranos de la angiogénesis, estimulando la proliferación celular, el remodelado de la MECv y la migración celular, en un microambiente no inflamatorio. Además, esta tesis demuestra que la gelificación ionotrópica entre los polímeros LMMDS y quitosano permite obtener PECs nanométricos estables. Este sistema ofrece una combinación única de características biológicas, tales como la unión a las células endoteliales en cultivo y la consecuente modulación de las etapas tempranas de la angiogénesis. Los PECs con LMMDS constituyen una novedosa plataforma hacia la implementación de nuevas estrategias de prevención, diagnóstico y tratamiento de un gran número de enfermedades cardiovasculares.

Descripción: Galectina-8 (Gal-8) es una lectina que reconoce ?-galactósidos, que al ser secretada funciona como una proteína de matriz extracelular. Previamente, nuestro grupo de investigación demostró que ALCAM (CD166) es un ligando de Gal-8. En esta tesis, postulamos que las uniones heterofílicas Gal-8 - ALCAM en la superficie de las células tumorales mamarias humanas triple negativas MDA-MB-231 favorecen la adhesión y migración celular. Nuestro objetivo se focalizó en estudiar roles tumorigénicos de Gal-8 y ALCAM en modelos ?in vitro? e ?in vivo?. En tejido mamario humano, Gal-8 y ALCAM resultaron co-expresadas, y ALCAM aumentó en el citoplasma con la progresión tumoral. La interacción Gal-8 - ALCAM en la superficie celular favoreció la adhesión y migración. El silenciamiento de Gal-8 o de ALCAM disminuyó la adhesión intercelular. ALCAM exhibió efectos de inhibición de la apoptosis, facilitando la formación de colonias y esferoides. El silenciamiento dual de Gal-8 y ALCAM retrasó el crecimiento tumoral en un modelo murino tumoral triple negativo. Estudios del perfil de N-glicosilación de ALCAM mostraron abundantes estructuras permisivas para unir Gal-8. A su vez, la sialilación celular y de ALCAM inhibieron la adhesión a Gal-8. Concluyendo, hemos demostrado roles importantes del eje Gal-8/ALCAM en la progresión del carcinoma mamario triple negativo.

Descripción: Las células de la glía, específicamente astrocitos y microgliocitos, han demostrado tener un papel central en la respuesta inmune innata luego de la injuria aguda cerebral. En particular los astrocitos pueden sufrir una polarización proinflamatoria al fenotipo A1 que produce neurodegeneración y este proceso depende de la actividad de receptores tipo Toll. TREM-2 es un receptor de la inmunidad innata que es regulador negativo de la actividad proinflamatoria mediada por receptores tipo Toll. En este trabajo estudiamos la participación de TREM-2 en la modulación de la conversión astroglial hacia el fenotipo proinflamatorio que induce neurodegeneración. Pudimos establecer que TREM-2 aumenta su expresión en astrocitos y microglía luego de inducida la isquemia cerebral in vivo o bien luego de una exposición a OGD in vitro. Activadores de la señalización de TLR-4 también inducen la expresión de TREM-2 en células gliales; y DAP12 está presente en estas células para poder señalizar. Utilizando distintos paradigmas de ganancia y pérdida de función, demostramos un rol anti-inflamatorio para TREM-2 en células gliales, de acuerdo con la función propuesta para TREM-2 en otros tipos de células inmuno-competentes. Proponemos que TREM-2 participa en la modulación de la conversión glial al fenotipo proinflamatorio-neurodegenerativo mediante la reducción de la actividad de la vía de NF-?B, lo cual podría ser explorado para el desarrollo de estrategias de reducción endógena de la neuroinflamación luego de la isquemia cerebral. Nuestros resultados también evidenciaron que la cooperación entre los astrocitos y la microglía parece ser crucial para la respuesta inmune innata en el daño agudo cerebral.

Descripción: La Toxina Shiga 2 (Stx2) producida por Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) causa diarrea, colitis hemorrágica, síndrome urémico hemolítico (SUH) y encefalopatías agudas. El índice de mortalidad por SUH aumenta dramaticamente cuando se involucra el sistema nervioso central (SNC). EHEC secreta Stx2 y LPS. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue determinar los efectos subletales de Stx2 en el SNC y la contribución pro-inflamatoria del LPS en la encefalopatía. Se utilizaron ratones y ratas para realizar estudios por inmunofluorescencia, microscopia electrónica, fisiológicos y conductuales. Además, se utilizaron Dexametasona y Etanercept para evaluar el grado de compromiso inflamatorio. La Stx2 produjo daño en la BHE, y en el parénquima produjo reacción astrocitaria, neurodegeneración, desmielinización y activación microglial. LPS potenció los efectos deletéreos de Stx2. Estos eventos condujeron a déficits motores mientras que los antiinflamatorios Dexametasona y Etanercept revertieron significativamente la condición patológica. A la luz de los resultados se sugiere que el daño producido por Stx2 y LPS está acompañado de un proceso inflamatorio. En conclusión, agentes anti-inflamatorios pueden ser beneficiosos para tratar las alteraciones observadas por las toxinas en la unidad neurovascular al reducir el daño celular y por lo tanto ameliorar los desequilibrios motores frecuentemente diagnosticados en pacientes.

Descripción: La Enfermedad Respiratoria Bovina (ERB), es una enfermedad infectocontagiosa que afecta las vías respiratorias de los rumiantes, y si bien engloba a un conjunto de enfermedades, comúnmente se la denomina neumonía. Es una patología de desarrollo multicausal en la que intervienen agentes virales y bacterianos que, junto con factores ambientales, permiten el desarrollo de la enfermedad que cursa con una sintomatología característica. A pesar de los estudios realizados en las últimas décadas sobre numerosos aspectos de la ERB entre los que se encuentran los factores de riesgo, la etiopatogenia, las características de los agentes causales, el diagnóstico, la terapéutica o la profilaxis y sus efectos globales, la neumonía continúa siendo una de las enfermedades de mayor impacto económico en el ganado vacuno. Tales antecedentes sumados a la falta de regulación sanitaria en los establecimientos productores de carne y de leche, hacen que los brotes de neumonía sean un problema de relevancia productiva y económica para un país con una matriz agropecuaria como la Argentina. A pesar de utilizarse vacunas para ERB, sus principales características indican que se la debe considerar como una enfermedad de difícil control con la que el ambiente ganadero convive, con la esperanza de minimizar tanto su incidencia como la gravedad de sus consecuencias que incluyen la pérdida en la ganancia de peso, los gastos en los tratamientos y la muerte de los animales. En base a lo expuesto, existe la necesidad de estudiar la respuesta inmune generada por la vacunación con el fin de mejorar las respuestas de las vacunas para esta enfermedad. Así surgió el objetivo general de esta Tesis Doctoral que consistió en estudiar la respuesta inmune generada por la vacunación contra la ERB en el ganado bovino y establecer un modelo murino que permita evaluar la respuesta a cada componente vacunal por separado, y analizar la posibilidad de modificar la composición vacunal antes del traslado al campo. Complementariamente, se evaluaron estrategias inmunopotenciadoras sobre la respuesta inmune generada por la vacuna. En este trabajo, se desarrolló un modelo murino similar al plan de vacunación en los bovinos, empleando la vacuna comercial Biopoligen® HS. Además, se desarrolló un ELISA para detectar anticuerpos específicos contra Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica e Histophilus somni que permitiera evaluar las modificaciones en los planes de inmunización realizados en ratones variando los tiempos de inmunización, el número de dosis, los inmunógenos y los adyuvantes empleados. Se evidenció que la incorporación de una tercera dosis en el plan de inmunización en ratones mejoró la respuesta humoral, y que la administración conjunta de la cepa probiótica Enterococcus faecalis CECT7121 como estrategia inmunoestimulante potenció la respuesta frente a la vacunación. Adicionalmente, se evaluaron distintos adyuvantes junto a los inmunógenos aislados y se demostró que el empleo de MontanideTM Gel 01PR y Coagel fueron muy eficientes ya que estimularon un aumento en la producción de anticuerpos específicos. Este adyuvante novedoso de nanoestructura de cristal líquido, Coagel, deberá aun ser evaluado en el hospedador natural. Respecto al modelo bovino, se estudió la serología en terneros, animales de tambo y de engorde a corral de diferentes edades y status inmunitario. Los resultados obtenidos muestran que los terneros luego de recibir calostro presentaron elevados títulos para las 3 bacterias estudiadas que no eran detectables antes de la ingesta del mismo y que pueden interferir en la respuesta a la vacunación. En los screenings realizados se detectó una gran heterogeneidad en la respuesta inmune evaluada en bovinos inmunizados. Sin embargo, en planes de inmunización bien controlados se evidenció el aumento de anticuerpos específicos provocado por la vacunación. La neumonía está ampliamente distribuida en el ganado, y si bien los bovinos son inmunizados para protegerlos de la ERB, igualmente pueden desarrollar cuadros neumónicos. Esto sugiere que la incidencia de la enfermedad se ve afectada por factores externos a la vacunación como ser el manejo de los bovinos, el correcto calostrado, el cumplimiento de las dosis y los tiempos de vacunación, factores que por lo general son subestimados. Durante la ejecución de esta tesis, fue posible trasladar del modelo murino al bovino, algunas de las modificaciones con las que se obtuvieron mejoras en la respuesta inmune. Así, la introducción de tres dosis al plan de inmunización logró mejorar los niveles de anticuerpos específicos. Además, el empleo del adyuvante MontanideTM Gel 01PR y la estrategia de administrar probióticos condujo a una tendencia a mejoras en la producción de anticuerpos. Los aportes de este trabajo de Tesis consistieron en estudiar en el ganado bovino la respuesta inmune generada por la vacunación para la Enfermedad Respiratoria Bovina y establecer un modelo murino que, a pesar de algunas diferencias, fue útil como herramienta para evaluar modificaciones en la composición vacunal y/o los adyuvantes antes del traslado al hospedador natural. Complementariamente, se evaluó como estrategia inmunopotenciadora sobre la respuesta inmune generada por la vacuna la utilización de preparados probióticos tanto en ratones como en terneros. En base a los resultados obtenidos proponemos mejoras estratégicas en los cronogramas de vacunación actualmente utilizados contra ERB, teniendo en cuenta los puntos críticos de infección dentro de los establecimientos y los momentos específicos de manejo.

Descripción: Se estudiaron aislamientos de enterobacterias de pacientes atendidos en el hospital de Clínicas "José de San Martin" durante los años 2009- 2013. La presencia de BLEE de tipo CTX-M es el mecanismo principal de resistencia a cefalosporinas de espectro extendido; pero se observó un desplazamiento de BLEEs de tipo CTX-M-2 por enzimas del grupo CTX-M-1, asociado a una diseminación multiclonal. El mecanismo de resistencia a carbapenemes más prevalente fue la presencia de carbapenemasa de tipo KPC. Los aislamientos portadores del gen blaKPC, surgieron esporádicamente causando brotes aislados y luego se observó una diseminación monoclonal en K. pneumoniae asociada al ST258. Posteriormente se detectó la diseminación a otras especies de enterobacterias y a otros secuenciotipos de K. pneumoniae. La resistencia a colistina emergió en K. pneumoniae con KPC debido a la selección de las subpoblaciones resistentes en el clon epidémico, y en los aislamientos KPC negativos por dispersión de clones resistentes. El uso previo es el principal factor relacionado con la adquisición y facilitaría la selección de subpoblaciones resistentes. La asociación colistina/ rifampicina demostró ser la combinación más activa in vitro, en aislamientos portadores de KPC sensibles y resistentes a colistina y fue utilizada en el hospital con buenos resultados clínicos.

Descripción: El objetivo general del presente trabajo de tesis es generar el conocimiento que permita desarrollar un sistema de rizorremediación capaz de mitigar el impacto asociado al uso de glifosato en suelos de la Pampa Húmeda Argentina bajo explotación agrícola intensiva. Se desarrollaron e implementaron metodologías para evaluar la tolerancia radicular y foliar a glifosato en especies vegetales con valor productivo y a su vez, el aislamiento y caracterización fenotípica y genotípica de cepas bacterianas tolerantes y degradadoras de glifosato, incluyendo la secuenciación del genoma completo de dos de ellas. Por último, se realizaron ensayos de interacción planta-microorganismo. Entre las especies vegetales evaluadas, L. corniculatus fue seleccionada como candidata por ser capaz de tolerar la exposición a 5,0 mg Kg-1 de glifosato por vía radicular y 700 g ha-1 por vía foliar. Se obtuvo un banco de cepas bacterianas puras tolerantes a glifosato. Se secuenció el genoma completo de Ochrobactrum sp. P6BS-III y Rhizobium sp. P44RR-XXIV, dos cepas que presentaron excelente performance en los ensayos previos, y cuyo genoma no había sido secuenciado previamente o estudiado en profundidad. El ensayo de microcosmos develó que L. corniculatus inoculado con Ochrobactrum sp. P6BS-III podría resultar en un sistema de rizorremediación adecuado.

Descripción: Los glioblastomas (GB) son los tumores primarios cerebrales más frecuentes y agresivos en adultos. La prolactina (PRL) y su receptor (PRLR) han sido asociados al desarrollo de tumores hormono-dependientes y se han detectado en biopsias de GB, pero aún se desconoce su función en la patogenia del GB. Nuestro objetivo fue evaluar el papel esta vía en GB. Detectamos PRL y PRLR en todas las líneas y modelos de GB estudiados. La activación o sobreexpresión de PRLR aumentó la sobrevida y quimio-resistencia en células de GB, mientras que el antagonista de PRLR, ?1?9-G129R-hPRL (PRLR-A) favoreció la quimio-sensibilidad e inhibió la migración de estas células. El análisis de datos transcriptómicos de biopsias de glioma indicó que la expresión de PRL está asociada al grado tumoral. La estratificación por sexo biológico reveló que los hombres con GB PRL+/PRLRHIGH tuvieron peor evolución que aquellos con GB PRL+/PRLRLOW, mientras que en pacientes masculinos con GII-III los resultados fueron opuestos. Concluimos que la vía de PRL podría favorecer la progresión del GB, constituyendo un posible blanco terapéutico. La comparación de vectores adenovirales y baculovirales in vitro e in vivo indicó que estos últimos serían apropiados para la transferencia de PRLR-A en GB experimental.

Descripción: Los alimentos pueden contaminarse con microorganismos patógenos en cualquier etapa desde su producción hasta la disposición para el consumo. Entre éstos, los virus son un motivo de preocupación dada su incidencia creciente. La Organización Mundial de la Salud (OMS) reconoce al virus de hepatitis A (HAV) y al norovirus (NoV) como los más relevantes, a los que se suma el virus de hepatitis E (HEV) por su carácter zoonótico. Los últimos dos han sido encontrados como contaminantes en recursos hídricos y en aguas residuales en Argentina, así como en muestras clínicas, lo que revela su circulación en la población y su existencia como peligro ambiental. En este trabajo, la hipótesis planteada es que, dado que en nuestro país no se realiza la detección de virus en alimentos en forma rutinaria y los virus entéricos pueden encontrarse en el ambiente, algunos alimentos frescos de origen vegetal y cárnico comercializados localmente están contaminados con virus de transmisión entérica, aun cuando presentaran buena calidad bacteriológica, y constituyen un riesgo para la salud de los consumidores. El objetivo general fue realizar un relevamiento y estudio de la posible contaminación viral de diferentes tipos de alimentos, como también en una de sus potenciales fuentes contaminantes para poder establecer rutas probables de contaminación y evaluar el impacto que esto pudiera tener en la salud pública. De manera que este estudio abarcó 3 instancias. La primera fue un relevamiento local de la circulación de virus en aguas residuales colectadas en zonas de CABA y Provincia de Buenos Aires, como potenciales fuentes de contaminación de alimentos. Se realizó en períodos de tiempo previos y simultáneos al de muestreo de alimentos, que cubría la misma área geográfica. En esa primera aproximación, se identificó la presencia de 7 genotipos circulantes de norovirus: GII.P2, GII.P4, GII.P16, GII.P17, GII.P31, GII.P33 y GIX.1, cuyas frecuencias fueron diferentes según el período de tiempo analizado. Estos resultados, junto a los antecedentes de circulación de virus entéricos en aguas superficiales del país, motivaron la búsqueda de norovirus en los alimentos como primer paso en la identificación del peligro, lo que constituyó la segunda etapa de estudio. Para eso, se implementaron métodos de elución alcalina y concentración viral por precipitación con polietilenglicol acoplados a determinación molecular de los virus de interés en lechugas, frutillas, ostras e hígado de cerdo, en este último caso para estudiar en forma preliminar la presencia de HEV. Estos métodos se evaluaron mediante la recuperación de dos virus controles de proceso: uno con genoma de ARN (bacteriófago PP7) y otro de ADN (adenovirus recombinante, rAdV). Entre ambos controles, PP7 resultó de mayor utilidad en todos los alimentos evaluados, ya que permitió recuperaciones aceptables de acuerdo con lo establecido por la norma ISO 15216-1 (?1 %) para vegetales y moluscos bivalvos, en un rango de inóculos generalmente entre 6E6 y 2E10 copias genómicas/muestra. Además, se evaluó su aplicación como modelo de recuperación de norovirus en lechugas. Si bien no se encontró correlación entre las recuperaciones de ambos virus a las concentraciones ensayadas, norovirus se recuperó en un porcentaje significativamente mayor que el control, incluso cuando este último presentó recuperaciones por debajo del 1%. Este hecho permitió confiar en el resultado negativo para norovirus en muestras con recuperaciones del control bajas o inferiores al 1% obtenidas en este trabajo. En el caso de rAdV, su utilidad no pudo Resumen 73 definirse a las concentraciones ensayadas, a las que presentó eficiencias no aptas para validar los ensayos de concentración. Como resultado de la segunda etapa, no se encontró norovirus en los vegetales ni en las ostras, como tampoco HEV en el muestreo preliminar de hígado de cerdo. Sin embargo, se evidenció contaminación viral, de orígenes tanto humano como animal, y contaminación bacteriana, mediante las detecciones de poliomavirus humanos y bovinos, bacteriófagos F-ARN y Salmonella spp., según el caso. En el análisis de muestras de vegetales, los tipos de poliomavirus humanos detectados indicarían que las vías más probables de contaminación en estos alimentos serían principalmente la manipulación por parte de personas portadoras de una infección viral, mayoritariamente asintomática y el riego con aguas con contaminación de origen humano. Los resultados del análisis de las ostras señalan como fuentes de contaminación no sólo excretas humanas sino también bovinas, probablemente presentes en las aguas de cultivo. Es decir, frente a un brote de infección por norovirus asociado al consumo de estos alimentos, dichas vías darían una explicación posible de su ocurrencia. De modo que la tercera etapa de estudio comprendió una evaluación de riesgo semicuantitativa que, a pesar de haberse aplicado sobre un muestreo reducido, considerando datos generales y asumiendo como prevalencias de contaminación a la de los indicadores y la de Salmonella en ostras, permitió identificar a las lechugas y a las ostras como los alimentos con mayor riesgo potencial de portar agentes patógenos. Contrariamente a la hipótesis planteada, no se detectó contaminación con virus entéricos patógenos para el hombre en los alimentos analizados. No obstante, las otras detecciones realizadas servirían para orientar la vigilancia hacia estos alimentos con mayor probabilidad de encontrarse vinculados a brotes, así como al seguimiento de las prácticas de producción que pudieran favorecer su ocurrencia, con el objetivo de prevenirlos. Por otro lado, pueden servir como antecedentes que justifiquen la inclusión de los virus como agentes de enfermedades alimentarias en las reglamentaciones nacionales, no solo como tema de salud pública en el país sino para mejorar la competitividad en el mercado internacional.

Descripción: Los derivados hidroxilados (20-HETE) y epoxigenados (EETs) del ácido araquidónico por acción de enzimas del citocromo P450 (CYP) son mediadores lipídicos que actúan sobre varias vías de señalización intracelular. La expresión de estos CYPs se ha encontrado aumentada en varias neoplasias. Asimismo, se ha demostrado el efecto de estos eicosanoides sobre la viabilidad y malignidad de algunas células tumorales. La hipótesis general de este trabajo es que el 20-HETE y los EETs participan en procesos claves para el desarrollo tumoral del feocromocitoma y del cáncer de próstata (CaP). El feocromocitoma es un tumor derivado de las células cromafines ubicadas en la médula adrenal o en ganglios distribuidos en el organismo. Entre el 25-40% de estos tumores forman parte de un síndrome familiar hereditario, y se agrupan de acuerdo a las mutaciones en los genes susceptibles como esporádicos, pseudo-hipóxicos y proliferativos. El desarrollo del CaP depende de los andrógenos circulantes en las primeras etapas de la enfermedad. En estadios más avanzados y en ausencia de estas hormonas, el receptor de andrógenos (RA) sigue activo, aunque con una señalización aberrante. Para el feocromocitoma, se evaluó la expresión de los CYPs con actividad de 20-hidroxilasa y epoxigenasa en muestras humanas, se realizaron experimentos utilizando una línea celular de feocromocitoma murino (MPC) en presencia de 20-HETE y EETs in vitro. Además, se utilizaron las células MPC para la obtención de un modelo murino de feocromocitoma en el cual se utilizó un inhibidor de la actividad de 20-hidroxilasas y epoxigenasas (ABT) para evaluar el crecimiento tumoral. En feocromocitomas humanos, se demostró la expresión del ARNm y la proteína de las 20-hidroxilasas (CYP4A11 y CYP4F2), las epoxigenasas (CYP2C8 y CYP2J2), y la enzima encargada de degradar los EETs, epóxido hidrolasa soluble (sEH). Al agrupar los tumores de acuerdo a su estirpe genética se encontraron diferencias en la expresión proteica de CYP2J2 y en la del ARNm de la sEH. Estas diferencias impactaron en la actividad de los CYPs analizados, los tumores del clúster proliferativos fueron los mayores productores de 20-HETE y EETs. En células MPC, la incubación con EETs (11,12-EET o 14,15-EET: 10nM) en un medio pobre en suero, aumentó la viabilidad a las 48hs un 60%-89%* respecto al control. Esto se pudo explicar por un aumento en la proliferación celular entre un 16-18%* y una disminución del 40%* en la apoptosis respecto a los controles. Por otro lado, la incubación con 20-HETE no tuvo efecto sobre la viabilidad de estas células. En el modelo murino, la administración de ABT (50mg/kg/día) redujo el crecimiento tumoral en alrededor de un 50%* respecto a los controles, se observó una disminución en la vascularización de los tumores tratados con ABT mientras que la proliferación celular fue similar en ambos grupos. De estos resultados se deduce que, la expresión y actividad de las 20-hidroxilasas y epoxigenasas depende de la estirpe genética de los feocromocitomas, y que el 11,12-EET y el 14,15-EET forman parte de los mecanismos celulares que sostienen la proliferación y previenen la apoptosis celular. Para el estudio del CaP se utilizaron dos líneas celulares con diferente sensibilidad a los andrógenos: LNCaP: sensibles y PC-3: insensibles, sobre las cuales se evaluó el efecto del 20-HETE o del inhibidor de su síntesis (HET0016) sobre la viabilidad celular y las características in vitro que se relacionan con el proceso de metástasis. Se observó una respuesta heterogénea a la inhibición de la síntesis de 20-HETE, que no afectó la viabilidad de células PC-3 mientras que disminuyó la de las células LNCaP en un 64%* (HET0016 10?M), este efecto se observó consistentemente en presencia de andrógenos, ya sea provistos por el suero fetal bovino o en presencia de dihidrotestosterona. La modificación en la viabilidad en ambos casos pudo explicarse por una disminución del 40%* en la proliferación celular y un aumento de 15 veces* en el número de células que entran en apoptosis. La incubación con 20-HETE (50nM) aumentó la viabilidad solamente en células LNCaP a través de una disminución en la apoptosis sin afectar la proliferación celular. Finalmente, la incubación de células LNCaP con HET0016 10?M redujo la expresión del RA (ARNm y proteína) y la producción de PSA, lo que podría explicar las diferencias en la respuesta encontrada. Además, la incubación de células LNCaP con DHT (10nM) aumentó la expresión y actividad del CYP4F2. La incubación de células PC-3 con 20-HETE (100nM) aumentó la expresión de un marcador de estirpe mesenquimática (vimentina), la migración celular en un 42%*, y la actividad de metaloproteasa-2, mientras que la ausencia de 20-HETE (HET0016) aumentó la expresión del marcador de estirpe epitelial (e-cadherina), disminuyó la migración celular en un 34%*al desorganizar los filamentos de actina, y disminuyó la resistencia a la muerte inducida por pérdida de anclaje. Estos resultados sugieren que los efectos del 20-HETE sobre la viabilidad de células de cáncer de próstata dependen de la señalización mediada por los andrógenos, mientras que sus efectos sobre la invasión celular son independientes de ella. Asimismo, en las células LNCaP la disponibilidad de 20-HETE es necesaria para mantener la expresión del receptor de andrógenos. En resumen, tanto el 20-HETE como los EETs emergen como noveles mediadores celulares de importancia en la proliferación, la apoptosis, la angiogénesis y la malignidad en los modelos tumorales analizados, con un perfil diferente de actividad según la estirpe celular y el comportamiento biológico de la misma. *p<0,05 vs condición control

Descripción: El presente trabajo de tesis comprende el estudio exhaustivo de la relación estructuraactividad y del mecanismo de acción mediante la utilización de distintas metodologías computacionales de tiazolilhidrazonas (TZHs) derivadas de 1-indanonas. Estos compuestos fueron sintetizados previamente por el grupo de investigación y presentaron muy buenos valores de actividad frente a las distintas formas del Trypanosoma cruzi (T. cruzi), agente etiológico de la enfermedad de Chagas. Estudios de QSAR, superposición molecular, docking y dinámica molecular permitieron establecer los requerimientos estructurales necesarios para la actividad anti-T. cruzi y determinar que las TZHs interfieren en la biosíntesis del ergosterol inhibiendo la enzima escualeno epoxidasa (SE). Los distintos modelos teóricos generados en este trabajo de tesis posibilitarán el diseño racional de nuevos inhibidores de la SE de T. cruzi que presenten las características establecidas para poder convertirse en potenciales candidatos a fármacos para el tratamiento de esta parasitosis.

Descripción: La nutrición en los 2 primeros años de vida resulta crucial para la salud y el desarrollo humano a largo plazo. Desde el nacimiento resulta fundamental la lactancia exclusiva en los primeros 6 meses y la calidad de los alimentos incorporados para complementarla. El aporte de los nutrientes necesarios en esta etapa depende tanto de la cantidad presente en la leche materna y los alimentos de transición como de su biodisponibilidad. La leche humana aporta componentes nutritivos y también factores bioactivos. La mayor parte de estos componentes son las proteínas. Entre ellas se encuentran las caseínas y proteínas del suero, como la IgA secretoria y la lactoferrina. Otros componentes importantes con actividad biológica, forman parte del nitrógeno no proteico. También existen compuestos no nitrogenados bioactivos, como son algunos ácidos grasos y los oligosacáridos. En cuanto a los minerales, el aporte total es bajo, pero varios son de alta biodisponibilidad, en especial calcio, magnesio, hierro, cobre y zinc. En lo que respecta a las vitaminas, se considera que la leche de una madre bien nutrida presenta cantidades suficientes; sin embargo, algunas pueden variar su concentración si poseen déficits en la dieta. La alimentación complementaria debe ser incorporada, según la OMS, a partir del 6º mes, cuando la leche materna resulta insuficiente para satisfacer todos los requerimientos nutricionales. El inicio de la alimentación complementaria antes del 4° mes implica riesgos para la salud y el desarrollo del niño y, más allá del 6º mes puede aparejar trastornos del crecimiento por insuficiente aporte nutricional, así como alteraciones en la conducta alimentaria. Las recomendaciones relativas a la alimentación complementaria toman en consideración tanto la edad del niño como el nivel de lactancia materna. Otro aspecto importante de los alimentos complementarios se refiere a su digestibilidad y aporte de proteínas de alta calidad. También en los últimos años se le ha prestado mucha atención a la viscosidad como factor que puede afectar la ingesta energética. Asimismo, en distintos contextos socio-económicos y/o regionales se observan diferencias en el patrón alimentario que responden a la posibilidad de acceso a diversos tipos de alimentos en función de su precio y disponibilidad y a modelos culturales profundamente arraigados. Los objetivos generales del presente trabajo de tesis se dirigen a relevar las características de la alimentación infantil durante el primer año de vida en contextos socioculturales diversos: un grupo de madres lactantes asistidas en un sanatorio privado de la Ciudad de Buenos Aires y un grupo de madres lactantes de población nativa atendidas en un hospital público de Jujuy. Los aspectos principales se focalizan en determinar la composición de leche materna, registrar el momento de incorporación de la alimentación complementaria y sus características particulares y determinar la composición en macronutrientes de los alimentos complementarios usualmente incorporados. También se propone profundizar el conocimiento sobre la digestibilidad de las proteínas en diferentes matrices alimentarias. Los resultados obtenidos indican que las concentraciones lácteas de proteína total, NNP, lactoferrina, IgA secretoria, calcio, fósforo, zinc y las relaciones PS/CAS y Ca/P, no presentarían variaciones entre ambas poblaciones. Además, resultaron concordantes con valores reportados en la bibliografía, excepto para el calcio cuya concentración resultó similar a la de poblaciones de baja ingesta. Las fracciones PS/CAS y las proteínas LF e IgA, mostraron una tendencia a valores mayores en ambas poblaciones cuando la frecuencia de mamadas fue baja. En ambos grupos se observaron altos porcentajes de madres con bajo contenido de retinol lácteo, siendo mayor la prevalencia de inadecuación en las madres de Jujuy. Los alimentos complementarios más frecuentes en Buenos Aires suplirían este déficit aportando cantidades suficientes de esta vitamina; por el contrario, en Jujuy, en su mayoría no resultarían adecuados. En Buenos Aires, se observaron porcentajes de mujeres con ingesta inadecuada de zinc, calcio y vitamina A superiores al 35%; la ingesta de hierro fue adecuada para todo el grupo estudiado. Se observaron diferentes patrones alimentarios entre las madres de Buenos Aires y Jujuy, atribuibles a factores socio-económicos, culturales o hábitos familiares. Hubo una incorporación precoz de alimentos complementarios en ambos grupos, con diferencias en el tipo de alimentos. En Jujuy, las preparaciones tradicionales más consumidas demostraron la persistencia de hábitos alimentarios heredados de la cultura andina. Algunos alimentos poseían baja densidad energética; sólo tres tenían contenido lipídico adecuado. En general, se caracterizaron por elevada densidad nutricional proteica y cantidad de fibra. En los alimentos infantiles comerciales, la viscosidad aparente mostró gran diversidad de valores y se observó con mayor frecuencia una combinación de bajo aporte calórico con elevada viscosidad. Además, varios de estos productos se caracterizaron por un contenido proteico y de fibra muy por encima de los recomendados. Se observó, mediante un método in vitro puesto a punto en este trabajo, que la digestibilidad de las proteínas variaba en diferentes matrices alimentarias. A partir de lo expuesto, se puede concluir que el patrón alimentario de los lactantes de ambos grupos presentó similitudes tanto con resultados nacionales como regionales y a nivel mundial. Asimismo, si bien algunos de los alimentos usualmente incorporados como complementarios resultarían inadecuados solos o al ofrecerse en una única comida, es importante realizar una combinación adecuada para lograr aportes acordes con las recomendaciones. Por último, se debe prestar especial atención al consumo en la dieta de las madres, de alimentos que sean fuente de vitamina A, así como de calcio y zinc y recomendar, a las madres de Jujuy, alimentos complementarios para sus niños con cantidades adecuadas de vitamina A.

Descripción: Galectina-3 (Gal-3), una proteína de unión a ?-galactósidos perteneciente a la familia de las lectinas, favorece la diferenciación de los oligodendrocitos (OLG), células formadoras de mielina en el sistema nervioso central, y la mielinización, a través de mecanismos aún no elucidados. En la presente tesis doctoral optimizamos la obtención y purificación de una Gal-3 recombinante funcional, con la cual demostramos que OLG tratados con rGal-3 muestran una diferenciación acelerada, evidenciada por un aumento de las células maduras en detrimento de las inmaduras y una dinámica acelerada del citoesqueleto a través de los cambios característicos en la polimerización de actina. Dichos cambios fueron consecuencia de la influencia de rGal-3 sobre las vías de señalización de Akt/mTOR, Erk 1/2 y ?-catenina. Además, nuestros estudios lograron identificar la ventana temporal de acción de rGal-3, resultando los OPC y los pre-OLG su blanco principal de acción para promover la diferenciación oligodendroglial. Seguidamente, nuestros resultados nos permitieron reconocer una variedad de moléculas a las cuales rGal-3 se une para ejercer su acción pro-diferenciante. Por último, la evaluación de la calidad de la mielina nos permitió determinar que los OLG diferenciados en presencia de rGal-3 son capaces de envainar correctamente tanto fibras sintéticas como a axones.

Descripción: La terapia antirretroviral combinada (TARc) disminuye eficazmente los niveles circulantes de VIH-1, pero no erradica el virus, que persiste en un pequeño grupo de células infectadas de forma latente, que se asocia con inflamación persistente durante la TARc. La galectina-1 (Gal1) es una lectina endógena con importantes funciones inmunomoduladoras. En este trabajo, demostramos que Gal1 revierte la latencia del VIH-1 en células J-LAT de una manera dependiente de glicanos y mediante la activación de la vía NF-?B. Además, Gal1 promueve la producción viral en células T CD4 + primarias infectadas con VIH-1. Hallamos un aumento en los niveles plasmáticos de Gal1 en individuos VIH-1+, en comparación con los donantes no infectados, independientemente de la carga viral y del número de células T CD4+. Esto correlacionó positivamente con el tamaño del reservorio de VIH-1, lo que sugiere que Gal1 podría estar modulando la actividad transcripcional del reservorio viral in vivo. Finalmente, mostramos que las vesículas extracelulares aisladas del plasma de individuos infectados con VIH-1 inducen la secreción de Gal1 por parte de macrófagos. En conclusión, proponemos que al modular la dinámica del reservorio, Gal1 y VEc vinculan la inflamación con la persistencia del VIH-1 en individuos tratados con TARc.

Descripción: El zebrafish posee la capacidad de regenerar sus órganos y tejidos lesionados. Esto lo hace un excelente modelo de vertebrado para estudiar procesos que conducen a la reparación tisular. El sistema purinérgico de señalización extracelular interviene en la mayoría de los procesos biológicos, incluyendo el desarrollo embrionario. En este trabajo de tesis se investigó la participación de distintos componentes del sistema purinérgico en la reparación de la retina. Para esto, se realizaron dos paradigmas de injuria retiniana in vivo mediante inyecciones intraoculares. En uno, se utilizó una dosis de ouabaína que afecta a todas las células retinianas, pero principalmente a las ganglionares y las interneuronas. En el otro, se inyectó una dosis de CoCl2 tal que dañó mayoritariamente a los fotorreceptores. La manipulación farmacológica de los componentes del sistema purinérgico (enzimas, nucleótidos y nucleósidos y receptores purinérgicos), en el microambiente del daño, provocó cambios drásticos en la proliferación y muerte celular, la reactividad glial y microglial, la angiogénesis y la inducción transcripcional de diversos genes involucrados en la regeneración retiniana. Utilizando el conocimiento sobre los mecanismos regulados por el sistema purinérgico y su implicancia en la regeneración, podrán desarrollarse terapias específicas para tratar retinopatías angiogénicas, neurodegenerativas y proliferativas en humanos.

Descripción: Hydrocotyle bonariensis Lam (Araliaceae) conocida como "paragüita", "redondita de agua", "tembladerilla" es una planta autóctona de Argentina que crece en la Provincia de Buenos Aires, en la costa de Rioplatense. Las infusiones preparadas con partes aéreas se utilizan en medicina popular en el tratamiento de la psoriasis y como diurético, emenagogo y antiséptico. Por otro lado, las hojas maceradas en alcohol se utilizan externamente en heridas y procesos inflamatorios de la piel. En este trabajo se realizó el estudio fitoquímico y farmacológico de la planta . en actividades antioxidantes, antiinflamatorias y antiproliferativas que fueron reportadas por primera vez. Las partes aéreas de H. bonariesis se recolectaron en el Parque Pereyra Iraola, Provincia de Buenos Aires. El análisis fitoquímico del extracto de metanol presentó un amplio perfil fenólico, mientras que la infusión se fraccionó mediante diálisis para separar los polisacáridos de los polifenoles. Se demostró que la infusión mostró ausencia de toxicidad aguda y que los carbohidratos participaron en las actividades antiinflamatorias, en las actividades antioxidantes, en la modulación de la proliferación de una línea celular de linfoma y en la inmunomodulación de macrófagos y linfocitos. Este trabajo permitió obtener un conocimiento integral de la planta Hidrocotyle bonariensis Lam. y validar su uso como antiinflamatorio y antiproliferativo.

Descripción: Los espermatozoides de mamífero necesitan experimentar, dentro del tracto reproductor femenino, una serie de cambios celulares y moleculares denominados en conjunto capacitación para poder fecundar al ovocito. Estas modificaciones altamente reguladas prepara a los espermatozoides para realizar dos eventos fundamentales para la fecundación: la hiperactivación y la exocitosis acrosomal (EA). La EA es un proceso secretorio único, e irreversible que es iniciado luego de la interacción de los espermatozoides con ciertos inductores fisiológicos presentes en el tracto reproductor femenino. En las últimas décadas, el dogma prevalente en el campo sostuvo que el espermatozoide para poder llevar a cabo la EA debía interaccionar directamente con la zona pelúcida (ZP) del ovocito. Sin embargo, en los últimos años ha surgido nueva evidencia, fundamentalmente en el modelo murino, que contradice dicho paradigma. En virtud de que el conocimiento de este proceso fue obtenido de ensayos experimentales realizados in vitro, nos propusimos estudiar la EA con enfoques novedosos y originales que incluyen entre otras cosas, la posibilidad de observación dentro del tracto reproductor de la hembra. El objetivo central de nuestro trabajo fue estudiar la respuesta a los inductores fisiológicos de la EA in vitro y los sitios de ocurrencia de este proceso in vitro e in vivo en el modelo murino. Nosotros proponemos como hipótesis general que la estabilidad del acrosoma y los estímulos adecuados para inducir la EA están estrechamente regulados por la interacción del espermatozoide con el entorno fisiológico del oviducto. En el presente trabajo utilizamos como principal modelo experimental, espermatozoides transgénicos CAG/mt-DsRed2, Acr-EGFP para monitorear el estado acrosomal. La ventaja de estos espermatozoides transgénicos es que cuando ocurre la EA, el contenido acrosomal se libera al medio y la marca fluorescente verde se pierde (ausencia de marca EGFP), pudiendo observar en tiempo real cuando está ocurriendo el proceso exocítico. Nuestros experimentos reforzaron la hipótesis de otros grupos que sostienen que la ZP tiene la capacidad de inducir o acelerar la EA en condiciones in vitro, solo cuando es utilizada en su forma solubilizada. Asimismo, la progesterona, otro de los inductores fisiológicos ampliamente estudiado, es un débil estimulante de la EA en concentraciones cercanas a las observadas en el tracto reproductor femenino, siendo una molécula importante pero no estrictamente necesaria para que ocurra la fertilización in vitro. En experimentos utilizando un sistema de imágenes en tiempo real, se observó que el complejo de células de la granulosa que rodea al ovocito (cumulus oophorus, COC) no sería el sitio de ocurrencia de la exocitosis acrosomal in vitro. Teniendo en cuenta todo esto, nos propusimos evaluar los efectos al disminuir la concentración de progesterona utilizando trilostano, un inhibidor competitivo de la proteína 3-? deshidrogenasa (3?-HSD), la cual es esencial para la síntesis de este esteroide. En ensayos donde se realizó una disminución de la concentración de progesterona en el cumulus oophorus, no se observó un efecto sobre la tasa de fertilización in vitro, aunque otros factores propios presentes en dicho complejo de células del cumulus-ovocito estarían participando en generar una mayor eficiencia en la fertilización. En estudios in vivo, realizados mediante el apareo de ratones transgénicos con hembras wild-type, se concluyó que la EA es inducida dentro del tracto femenino en los segmentos altos del oviducto (istmo alto), previo a la interacción con la ZP y el cumulus oophorus por factores presentes en el mismo que aún no han sido identificados. Mientras que aquellos espermatozoides que logran migrar a el ámpula se encontraron en su amplia mayoría ya reaccionados. Con el objetivo de estudiar más profundamente la función de esta hormona en el tracto femenino, en particular, como principal molécula capaz de iniciar la EA, se realizaron estudios in vivo donde se logró disminuir su concentración presente en los COC utilizando herramientas farmacológicas. La disminución significativa en la concentración de este esteroide generada por la administración de trilostano a ratones hembras al momento de la ovulación, produjo una menor tasa de fertilización in vivo. Esta disminución sería originada principalmente por un menor número de espermatozoides con capacidad de migrar a través del oviducto y no por una imposibilidad de realizar la EA, ya que los espermatozoides observados en los segmentos altos del oviducto, no presentaban sus acrosomas. La coadministración de progesterona junto con el inhibidor trilostano pudo recuperar parcialmente los efectos observados con el inhibidor. Como conclusión, en este trabajo de tesis demostramos por primera vez que, en el modelo murino, la mayoría de los espermatozoides en su entorno fisiológico realizan la EA antes de entrar en el ámpula e interaccionar con los ovocitos. El o los inductores responsables de iniciar la EA en este sitio del tracto reproductor femenino deberán ser identificados en futuras experimentaciones.

Descripción: La respuesta a la creciente demanda de alimentos debería darse en un contexto de sustentabilidad. Así, el uso de biofertilizantes es una práctica superadora, ya que reduce el uso de fertilizantes químicos. Éstos generan efectos negativos sobre el agroecosistema. El objetivo fue desarrollar mediante cultivo conjunto, un biofertilizante conformado por tres géneros bacterianos, para ser aplicado en soja. Para esto, se desarrolló un proceso biotecnológico para cultivar los microorganismos en un mismo caldo fermentativo. Se evaluaron las interacciones establecidas entre las cepas mediante el fenómeno quorum sensing (QS). Todas las cepas estudiadas: Bradyrhizobium japonicum E109(B), Azospirillum brasilense Az39(A) y Pseudomonas fluorescensP3(P), produjeron moléculas del tipo acil homoserina lactonas (AHLs). En B, la presencia de AHL heterólogas produjo cambios en el tipo de AHLs sintetizadas. Además, se analizó la capacidad PGPR de las cepas, siendo A el mayor productor de AIA y su producción fue influenciada por QS de P. Por otro lado, P mostró capacidad de producir sideróforos y solubilizar fósforo, independientemente de QS. Finalmente, la mejor performance simbiótica de B fue alcanzada con el consorcio triple co-cultivado. Este sistema constituye una alternativa biotecnológica donde las PGPR se complementan sinérgicamente, logrando resultados que en forma individual no se observaron.

Descripción: El objetivo del presente trabajo fue diseñar un alimento funcional panificado que incluya un ingrediente, obtenido de materias primas no convencionales, que aporte componentes del tipo ?-galactósidos cuyas propiedades prebióticas fueron confirmadas mediante ensayos in vitro e in vivo con modelo animal. En este contexto, se obtuvieron materias primas a partir de semillas de lupino, zapallo y trigo sarraceno. En primera instancia se evaluó y optimizó el proceso de extracción de los azúcares presentes en las mismas. Posteriormente, se evaluó la capacidad prebiótica de los materiales obtenidos frente al microorganismo L. paracasei y microorganismos entéricos, para luego continuar su estudio utilizando un modelo de ratas Wistar en crecimiento. Finalmente, se seleccionó la harina de semillas de zapallo debido a su alto valor nutricional, al auge del consumo de semillas y disponibilidad de las mismas en nuestro país, para la formulación de un producto panificado apto para celíacos. Se realizaron análisis de composición centesimal y se evaluaron características tanto físicas como sensoriales, evaluadas por consumidores celíacos. El producto panificado resultó contener compuestos con propiedades prebióticas y un perfil nutricional de alto valor, enriquecido en proteínas, grasas de origen vegetal y fibra dietaria total, con respecto al producto elaborado con premezcla para celíacos.

Descripción: Escherichia coli enterohemorrágico (EHEC) es el patógeno que responsable del síndrome urémico hemolítico (SUH. Argentina tiene la mayor incidencia mundial de SUH en niños menores de 5 años. El serotipo O157:H7 es el más frecuente en pacientes con SUH. El ganado bovino es el reservorio primario de EHEC O157:H7, y la principal fuente de infección para humanos. La vacunación del ganado bovino constituye una estrategia de intervención prefaena para reducir la excreción de EHEC O157:H7. En este trabajo se evaluaron dos vacunas: la primera compuesta por 2 factores de colonización, las proteínas Intimina y EspB, producidas de modo recombinante; la segunda consistente en envolturas bacterianas de EHEC O157:H7. Se desarrolló un modelo de inoculación experimental de EHEC, luego se llevó a cabo un ensayo de vacunación con desafío posterior para cada vacuna. Nuestros resultados indican que la inmunización sistémica con dos dosis de la vacuna con Intimina y EspB recombinantes podría reducir la colonización y la excreción de EHEC O157:H7 en terneros. También se redujeron el tiempo de colonización y la magnitud de la excreción por la inmunización subcutánea con envolturas bacterianas de O157:H7. Se necesitarían ensayos adicionales para evaluar la eficacia de las vacunas en terneros en condiciones naturales.

Descripción: Poco se sabe del efecto neurológico del As. Se planteó estudiar el efecto del As en cerebro de rata sobre el balance redox celular, explorando diferentes modelos de administración de As. Se evaluaron la producción de especies reactivas, el balance redox mediante la evaluación de índices daño/protección en medios hidrofílico, lipofílico y el consumo de antioxidantes no enzimáticos. Los índices de estrés oxidativo permitieron comparar los efectos tempranos de los tratamientos según el modelo de administración de As empleado. La velocidad de oxidación de la diclorofluoresceína diacetato, como índice general de la generación de especies activas, no mostró diferencias en cerebro por la exposición a As en ninguno de los modelos estudiados. Utilizando un modelo de exposición a As en cerebro ex vivo, se observó una condición de estrés oxidativo en el ambiente lipofílico celular, acompañado por un consumo del antioxidante glutatión (GSH). La administración aguda de As en un modelo in vivo desencadenó el mismo efecto a nivel lipofílico, con un aumento en la generación de NO y en la nitración de proteínas, sin consumo significativo de GSH. Por otro lado, empleando un modelo in vivo de administración crónica de As en el agua de bebida, se observó el mismo efecto sobre el índice de estrés oxidativo en el ambiente lipofílico celular, acompañado de un consumo de los antioxidantes GSH y ?-tocoferol. El efecto tóxico del As en cerebro se asocia parcialmente al daño oxidativo y nitrosativo en lípidos, proteínas y al consumo de antioxidantes en forma independiente del modelo de administración, con algunas características diferenciales probablemente vinculadas a las concentraciones de As alcanzadas en cada modelo.

Descripción: El descubrimiento de la isoforma 8 del Transportador de Zinc (ZnT8) como el cuarto autoantígeno inmunodominante involucrado en la Diabetes Mellitus (DM) autoinmune, provee un recurso adicional para el estudio de la incidencia y progresión de la enfermedad. La determinación de autoanticuerpos anti-ZnT8 (ZnT8A) junto con otros marcadores inmunológicos, aumenta la sensibilidad de detección de autoinmunidad en pacientes con DM tipo 1 así como en la población de riesgo (familiares en primer grado de pacientes con DM tipo 1). Asimismo, dado que el ZnT8 es un antígeno estructural de la célula ? pancreática, la presencia de ZnT8A revela indirectamente un daño celular específico. El estudio de los marcadores humorales resulta interesante para investigar las bases etiopatogénicas, y permiten distinguir las formas de DM asociadas a autoinmunidad. El diagnóstico preciso y la terapia adecuada y oportuna son elementos críticos para lograr un buen control metabólico evitando la aparición de complicaciones de la enfermedad. Los métodos radiométricos de referencia utilizados para la detección de los marcadores humorales de DM son ensayos de alta sensibilidad y especificidad, pero presentan altos costos, requieren de material radiactivo que generan residuos altamente contaminantes del medioambiente y su ejecución se limita a centros de investigación básica y aplicada que cuenten con la infraestructura y habilitación necesaria. Por lo tanto, es imprescindible el desarrollo de nuevas generaciones de ensayos no radiométricos de menor costo y complejidad operativa, que permitan mayor aplicación en laboratorios de mediana/baja complejidad y faciliten el acceso diagnóstico a un mayor número de pacientes, permitiendo implementar el tratamiento adecuado. En este contexto, los objetivos generales del presente trabajo de Tesis fueron: -Básicos: detección y caracterización de los ZnT8A provenientes de muestras de pacientes con distintos fenotipos clínicos de DM. El propósito final fue definir el perfil diferencial de inmunorreactividades (mapeo de epitopes) de los ZnT8A frente a distintas variantes antigénicas recombinantes producidas in vitro y los parámetros termodinámicos de interacción primaria (concentración -q- y constante de afinidad -Ka-). -Aplicados: desarrollo e implementación de inmunoensayos de alta sensibilidad y baja complejidad operativa para el screening rutinario del marcador ZnT8A. En la primera etapa se estudió la prevalencia de ZnT8A, en comparación con los otros marcadores de DM autoinmune -IAA/PAA, GADA e IA-2A- en tres grupos de pacientes con distintos fenotipos clínicos de DM. A partir de los resultados obtenidos, se demostró que ZnT8A constituye un marcador humoral adicional a la tríada ya existente, incrementando la sensibilidad diagnóstica de autoinmunidad. El principal epitope de ZnT8 involucrado en el reconocimiento de los autoanticuerpos se localiza en el dominio C-terminal de la molécula (aminoácidos 268-369), región en la que existen dos variantes polimórficas en el residuo 325. Así, se lograron diferenciar subpoblaciones de autoanticuerpos según sus inmunorreactividades frente a diferentes variantes antigénicas de ZnT8, alcanzando una caracterización inmunoquímica más exhaustiva de los ZnT8A. La construcción heterodimércia del dominio C-terminal de ZnT8 fue la variante antigénica que presentó la mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario del marcador ZnT8A en los distintos grupos de pacientes estudiados. A partir de los resultados obtenidos en la primera etapa y teniendo en cuenta que el desarrollo de inmunoensayos no radiométricos para la detección de ZnT8A requería del autoantígeno recombinante en grandes cantidades a un costo razonable, se procedió a la expresión de la construcción heterodimérica de ZnT8 en E. coli cepas GI698 y GI724, empleando la estrategia de síntesis acoplada a Trx. La quimera TrxZnT8 se recuperó de la fracción intracelular soluble y de los cuerpos de inclusión con un excelente comportamiento inmunoquímico validado por diversos estudios de unión a ZnT8A. Dado que la proteína obtenida de cuerpos de inclusión presentó un mayor grado de pureza y un mejor rendimiento se decidió seguir trabajando con la misma. Contando con el autoantígeno recombinante TrxZnT8 y con el objetivo de caracterizar la respuesta inmune humoral especifica de ZnT8A en términos de q y Ka, se realizaron radioinmunoensayos con sueros de pacientes con DM tipo 1 y pacientes diabéticos diagnosticados en edad adulta. Al evaluar las muestras de ambos grupos, se observó que los pacientes infanto-juveniles con DM tipo 1 presentaron menores q y mayores Ka de ZnT8A que los adultos, sugiriendo la existencia de un camino etiopatogénico distinto entre ambos fenotipos clínicos de la enfermedad. Posteriormente se procedió a la optimización de ensayos no radiométricos en fase sólida para la determinación de ZnT8A. Así se desarrollaron dos métodos en fase sólida basados en el modelo doble paratope: dp-piELISA y FloCMIA, con diferencias en la fase sólida empleada (microplaca o microesferas) y en el sistema de detección (colorimétrico o fluorométrico). Ambos ensayos presentaron parámetros analíticos adecuados para ser considerados como métodos para el screening rutinario de ZnT8A. Dado que el inmunoensayo basado en Citometría de Flujo empleando microesferas de poliestireno presentó una muy buena especificidad y sensibilidad, así como también un mayor rango dinámico que los ensayos de tipo ELISA, puede considerarse como un método alternativo candidato para reemplazar al RBA. Asimismo, se destaca su potencial aplicación en la medición simultánea y discriminativa de varios marcadores relacionados con DM autoinmune empleando microesferas de distintos tamaños o fluorescencia interna (diferenciables en el Citómetro de Flujo) adsorbidas con distintos autoantígenos. De esta manera, las metodologías desarrolladas de autoinmunidad. El principal epitope de ZnT8 involucrado en el reconocimiento de los autoanticuerpos se localiza en el dominio C-terminal de la molécula (aminoácidos 268-369), región en la que existen dos variantes polimórficas en el residuo 325. Así, se lograron diferenciar subpoblaciones de autoanticuerpos según sus inmunorreactividades frente a diferentes variantes antigénicas de ZnT8, alcanzando una caracterización inmunoquímica más exhaustiva de los ZnT8A. La construcción heterodimércia del dominio C-terminal de ZnT8 fue la variante antigénica que presentó la mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario del marcador ZnT8A en los distintos grupos de pacientes estudiados. A partir de los resultados obtenidos en la primera etapa y teniendo en cuenta que el desarrollo de inmunoensayos no radiométricos para la detección de ZnT8A requería del autoantígeno recombinante en grandes cantidades a un costo razonable, se procedió a la expresión de la construcción heterodimérica de ZnT8 en E. coli cepas GI698 y GI724, empleando la estrategia de síntesis acoplada a Trx. La quimera TrxZnT8 se recuperó de la fracción intracelular soluble y de los cuerpos de inclusión con un excelente comportamiento inmunoquímico validado por diversos estudios de unión a ZnT8A. Dado que la proteína obtenida de cuerpos de inclusión presentó un mayor grado de pureza y un mejor rendimiento se decidió seguir trabajando con la misma. Contando con el autoantígeno recombinante TrxZnT8 y con el objetivo de caracterizar la respuesta inmune humoral especifica de ZnT8A en términos de q y Ka, se realizaron radioinmunoensayos con sueros de pacientes con DM tipo 1 y pacientes diabéticos diagnosticados en edad adulta. Al evaluar las muestras de ambos grupos, se observó que los pacientes infanto-juveniles con DM tipo 1 presentaron menores q y mayores Ka de ZnT8A que los adultos, sugiriendo la existencia de un camino etiopatogénico distinto entre ambos fenotipos clínicos de la enfermedad. Posteriormente se procedió a la optimización de ensayos no radiométricos en fase sólida para la determinación de ZnT8A. Así se desarrollaron dos métodos en fase sólida basados en el modelo doble paratope: dp-piELISA y FloCMIA, con diferencias en la fase sólida empleada (microplaca o microesferas) y en el sistema de detección (colorimétrico o fluorométrico). Ambos ensayos presentaron parámetros analíticos adecuados para ser considerados como métodos para el screening rutinario de ZnT8A. Dado que el inmunoensayo basado en Citometría de Flujo empleando microesferas de poliestireno presentó una muy buena especificidad y sensibilidad, así como también un mayor rango dinámico que los ensayos de tipo ELISA, puede considerarse como un método alternativo candidato para reemplazar al RBA. Asimismo, se destaca su potencial aplicación en la medición simultánea y discriminativa de varios marcadores relacionados con DM autoinmune empleando microesferas de distintos tamaños o fluorescencia interna (diferenciables en el Citómetro de Flujo) adsorbidas con distintos autoantígenos. De esta manera, las metodologías desarrolladas deautoinmunidad. El principal epitope de ZnT8 involucrado en el reconocimiento de los autoanticuerpos se localiza en el dominio C-terminal de la molécula (aminoácidos 268-369), región en la que existen dos variantes polimórficas en el residuo 325. Así, se lograron diferenciar subpoblaciones de autoanticuerpos según sus inmunorreactividades frente a diferentes variantes antigénicas de ZnT8, alcanzando una caracterización inmunoquímica más exhaustiva de los ZnT8A. La construcción heterodimércia del dominio C-terminal de ZnT8 fue la variante antigénica que presentó la mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario del marcador ZnT8A en los distintos grupos de pacientes estudiados. A partir de los resultados obtenidos en la primera etapa y teniendo en cuenta que el desarrollo de inmunoensayos no radiométricos para la detección de ZnT8A requería del autoantígeno recombinante en grandes cantidades a un costo razonable, se procedió a la expresión de la construcción heterodimérica de ZnT8 en E. coli cepas GI698 y GI724, empleando la estrategia de síntesis acoplada a Trx. La quimera TrxZnT8 se recuperó de la fracción intracelular soluble y de los cuerpos de inclusión con un excelente comportamiento inmunoquímico validado por diversos estudios de unión a ZnT8A. Dado que la proteína obtenida de cuerpos de inclusión presentó un mayor grado de pureza y un mejor rendimiento se decidió seguir trabajando con la misma. Contando con el autoantígeno recombinante TrxZnT8 y con el objetivo de caracterizar la respuesta inmune humoral especifica de ZnT8A en términos de q y Ka, se realizaron radioinmunoensayos con sueros de pacientes con DM tipo 1 y pacientes diabéticos diagnosticados en edad adulta. Al evaluar las muestras de ambos grupos, se observó que los pacientes infanto-juveniles con DM tipo 1 presentaron menores q y mayores Ka de ZnT8A que los adultos, sugiriendo la existencia de un camino etiopatogénico distinto entre ambos fenotipos clínicos de la enfermedad. Posteriormente se procedió a la optimización de ensayos no radiométricos en fase sólida para la determinación de ZnT8A. Así se desarrollaron dos métodos en fase sólida basados en el modelo doble paratope: dp-piELISA y FloCMIA, con diferencias en la fase sólida empleada (microplaca o microesferas) y en el sistema de detección (colorimétrico o fluorométrico). Ambos ensayos presentaron parámetros analíticos adecuados para ser considerados como métodos para el screening rutinario de ZnT8A. Dado que el inmunoensayo basado en Citometría de Flujo empleando microesferas de poliestireno presentó una muy buena especificidad y sensibilidad, así como también un mayor rango dinámico que los ensayos de tipo ELISA, puede considerarse como un método alternativo candidato para reemplazar al RBA. Asimismo, se destaca su potencial aplicación en la medición simultánea y discriminativa de varios marcadores relacionados con DM autoinmune empleando microesferas de distintos tamaños o fluorescencia interna (diferenciables en el Citómetro de Flujo) adsorbidas con distintos autoantígenos. De esta manera, las metodologías desarrolladas deautoinmunidad. El principal epitope de ZnT8 involucrado en el reconocimiento de los autoanticuerpos se localiza en el dominio C-terminal de la molécula (aminoácidos 268-369), región en la que existen dos variantes polimórficas en el residuo 325. Así, se lograron diferenciar subpoblaciones de autoanticuerpos según sus inmunorreactividades frente a diferentes variantes antigénicas de ZnT8, alcanzando una caracterización inmunoquímica más exhaustiva de los ZnT8A. La construcción heterodimércia del dominio C-terminal de ZnT8 fue la variante antigénica que presentó la mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario del marcador ZnT8A en los distintos grupos de pacientes estudiados. A partir de los resultados obtenidos en la primera etapa y teniendo en cuenta que el desarrollo de inmunoensayos no radiométricos para la detección de ZnT8A requería del autoantígeno recombinante en grandes cantidades a un costo razonable, se procedió a la expresión de la construcción heterodimérica de ZnT8 en E. coli cepas GI698 y GI724, empleando la estrategia de síntesis acoplada a Trx. La quimera TrxZnT8 se recuperó de la fracción intracelular soluble y de los cuerpos de inclusión con un excelente comportamiento inmunoquímico validado por diversos estudios de unión a ZnT8A. Dado que la proteína obtenida de cuerpos de inclusión presentó un mayor grado de pureza y un mejor rendimiento se decidió seguir trabajando con la misma. Contando con el autoantígeno recombinante TrxZnT8 y con el objetivo de caracterizar la respuesta inmune humoral especifica de ZnT8A en términos de q y Ka, se realizaron radioinmunoensayos con sueros de pacientes con DM tipo 1 y pacientes diabéticos diagnosticados en edad adulta. Al evaluar las muestras de ambos grupos, se observó que los pacientes infanto-juveniles con DM tipo 1 presentaron menores q y mayores Ka de ZnT8A que los adultos, sugiriendo la existencia de un camino etiopatogénico distinto entre ambos fenotipos clínicos de la enfermedad. Posteriormente se procedió a la optimización de ensayos no radiométricos en fase sólida para la determinación de ZnT8A. Así se desarrollaron dos métodos en fase sólida basados en el modelo doble paratope: dp-piELISA y FloCMIA, con diferencias en la fase sólida empleada (microplaca o microesferas) y en el sistema de detección (colorimétrico o fluorométrico). Ambos ensayos presentaron parámetros analíticos adecuados para ser considerados como métodos para el screening rutinario de ZnT8A. Dado que el inmunoensayo basado en Citometría de Flujo empleando microesferas de poliestireno presentó una muy buena especificidad y sensibilidad, así como también un mayor rango dinámico que los ensayos de tipo ELISA, puede considerarse como un método alternativo candidato para reemplazar al RBA. Asimismo, se destaca su potencial aplicación en la medición simultánea y discriminativa de varios marcadores relacionados con DM autoinmune empleando microesferas de distintos tamaños o fluorescencia interna (diferenciables en el Citómetro de Flujo) adsorbidas con distintos autoantígenos. De esta manera, las metodologías desarrolladas de autoinmunidad. El principal epitope de ZnT8 involucrado en el reconocimiento de los autoanticuerpos se localiza en el dominio C-terminal de la molécula (aminoácidos 268-369), región en la que existen dos variantes polimórficas en el residuo 325. Así, se lograron diferenciar subpoblaciones de autoanticuerpos según sus inmunorreactividades frente a diferentes variantes antigénicas de ZnT8, alcanzando una caracterización inmunoquímica más exhaustiva de los ZnT8A. La construcción heterodimércia del dominio C-terminal de ZnT8 fue la variante antigénica que presentó la mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario del marcador ZnT8A en los distintos grupos de pacientes estudiados. A partir de los resultados obtenidos en la primera etapa y teniendo en cuenta que el desarrollo de inmunoensayos no radiométricos para la detección de ZnT8A requería del autoantígeno recombinante en grandes cantidades a un costo razonable, se procedió a la expresión de la construcción heterodimérica de ZnT8 en E. coli cepas GI698 y GI724, empleando la estrategia de síntesis acoplada a Trx. La quimera TrxZnT8 se recuperó de la fracción intracelular soluble y de los cuerpos de inclusión con un excelente comportamiento inmunoquímico validado por diversos estudios de unión a ZnT8A. Dado que la proteína obtenida de cuerpos de inclusión presentó un mayor grado de pureza y un mejor rendimiento se decidió seguir trabajando con la misma. Contando con el autoantígeno recombinante TrxZnT8 y con el objetivo de caracterizar la respuesta inmune humoral especifica de ZnT8A en términos de q y Ka, se realizaron radioinmunoensayos con sueros de pacientes con DM tipo 1 y pacientes diabéticos diagnosticados en edad adulta. Al evaluar las muestras de ambos grupos, se observó que los pacientes infanto-juveniles con DM tipo 1 presentaron menores q y mayores Ka de ZnT8A que los adultos, sugiriendo la existencia de un camino etiopatogénico distinto entre ambos fenotipos clínicos de la enfermedad. Posteriormente se procedió a la optimización de ensayos no radiométricos en fase sólida para la determinación de ZnT8A. Así se desarrollaron dos métodos en fase sólida basados en el modelo doble paratope: dp-piELISA y FloCMIA, con diferencias en la fase sólida empleada (microplaca o microesferas) y en el sistema de detección (colorimétrico o fluorométrico). Ambos ensayos presentaron parámetros analíticos adecuados para ser considerados como métodos para el screening rutinario de ZnT8A. Dado que el inmunoensayo basado en Citometría de Flujo empleando microesferas de poliestireno presentó una muy buena especificidad y sensibilidad, así como también un mayor rango dinámico que los ensayos de tipo ELISA, puede considerarse como un método alternativo candidato para reemplazar al RBA. Asimismo, se destaca su potencial aplicación en la medición simultánea y discriminativa de varios marcadores relacionados con DM autoinmune empleando microesferas de distintos tamaños o fluorescencia interna (diferenciables en el Citómetro de Flujo) adsorbidas con distintos autoantígenos. De esta manera, las metodologías desarrolladas de menor complejidad operativa respecto del método radiométrico de referencia estimulan la descentralización de las determinaciones de ZnT8A, ampliando el acceso diagnóstico a un número mayor de pacientes.

Descripción: Tomamos como modelo biológico para estudiar los mecanismos de la Transferencia Horizontal Genética de Genes de Resistencia a Antibióticos a los integrones de clase 1, los cuales están asociados a la Multidroga Resistencia Antibiótica (MDRA). El gen intI1 se mantuvo en cepas clínicas pertenecientes a linajes con comportamiento epidémico por más de 900 generaciones. Mediante estudios de bioinformática evidenciamos un flujo dinámico de los alelos del gen intI1 en particular en nichos humanos que han permitido probablemente su expansión desde la aparición de los seres humanos por herencia vertical. Al analizar la adaptación de P. aeruginosa al pulmón de un paciente con Fibrosis Quística durante la colonización crónica, identificamos que simultáneamente a la reducción genómica, ocurrían eventos de adquisición de resistencia móvil, conferida por una nueva isla genómica PApGI, que posee embebido un integrón de clase 1 con el gen cassette blaVIM-2. Dicho gen se mantiene a través del tiempo en más de 1000 generaciones, lo cual la convierte en un importante reservorio que potencialmente puede ser trasferido a otras cepas. Estos resultados evidencian el rol adaptativo que confieren los integrones de clase 1 a diversas especies y hábitats, incluyendo las infecciones crónicas de P. aeruginosa.

Descripción: A pesar de los grandes avances que existen en el conocimiento del cáncer de mama, los principales tratamientos sistémicos que se utilizan para combatir la enfermedad avanzada son la hormonoterapia y la quimioterapia. Esta ultima estrategia, si bien es efectiva en la mayoría de los casos, suele ser nociva para el paciente. El Ácido Hialurónico (AH) esta compuesto por unidades repetidas de disacáridos de Dglucurónico y N-acetil-D-glucosamina, unidos mediante enlaces alternados B1-3 y B1-4. La mayoría de los procesos en los cuales el AH se encuentra involucrado están mediados por su principal receptor, CD44, una glicoproteína de membrana que se encuentra presente en muchos tipos celulares. Se ha demostrado que los oligosacáridos de Ácido Hialurónico (oAH) tienen la capacidad de inhibir la proliferación celular (e inclusive, en algunos casos, de inducir apoptosis) en diferentes modelos de patologías tumorales, como ser las lineas celulares de cáncer de colon, de distintos linfomas y de cáncer de mama. Ademas, cuando se administran en combinación con fármacos antitumorales de uso convencional como la Doxorrubicina en lineas celulares cultivadas in vitro, son capaces de actuar de forma sinérgica, permitiendo una reducción de la dosis del quimioterápico. Estas propiedades de los oAH, los posicionan como buenos candidatos para su administración conjunta con quimioterápicos en una terapia adyuvante. Pero los oAH presentan dos grandes desventajas. La primera, es que al ser un componente del organismo, su metabolismo se encuentra estrechamente regulado, a tal punto que su vida media en la circulación sanguínea es de apenas un par de minutos. El otro es su costo de producción elevado. Es por ello, que la búsqueda de compuestos con propiedades equivalentes a las de los oAH surge como una prometedora linea de investigación. Uno de los desafíos más grandes de la química medicinal es el empleo de oligosacáridos como medicamentos. Los avances en la comprensión funcional de las interacciones proteína-carbohidrato han permitido el desarrollo de una nueva clase de fármacos, conocidos como fármacos glicomiméticos. Estos compuestos bioactivos son capaces de imitar la función de los hidratos de carbono pero carecen de las propiedades no deseadas de los mismos (propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas insuficientes, baja actividad y permeabilidad a los tejidos, escasa estabilidad y vida media en suero). La visión detallada de las interacciones carbohidrato-proteína que se requiere para el diseño de esta clase de moléculas es provista en general por la cristalografía y la RMN. Pero no siempre se puede contar con este tipo de información experimental y es por ello que el empleo de simulaciones computacionales para obtener información estructural de biomoléculas en proyecto de desarrollo de fármacos es cada vez mas difundido en la actualidad. Las herramientas bioinformaticas que se emplean en la búsqueda y optimización de nuevos fármacos, fueron concebidas con una perspectiva utilitaria multipropósito, por lo que en algunos casos, los resultados obtenidos no son tan confiables. Es por ello que la adecuación de dichas herramientas a un sistema particular, es habitual dentro del proceso de descubrimiento de nuevos compuestos. Teniendo en cuenta estos antecedentes, nos propusimos como objetivo de identificar compuestos naturales capaces de actuar como glicomiméticos de oAH. Para ello, realizamos un análisis detallado de las propiedades moleculares de los oAH como así también de los principales características que determinan su interacción con CD44 mediante el empleo de simulaciones de Dinámica Molecular. Luego de una caracterización rigurosa, identificamos que el tipo de enlaces alternados (B1-3 y B1-4) y que la presencia del azúcar N-Acetilglucosamina eran de suma importancia. A partir de estos datos y luego de una búsqueda en bases de datos de compuestos naturales, identificamos dos polímeros que cumplían con la características de presentar enlaces alternados (Liquenina y Xilano) y uno compuesto exclusivamente por NAcetilglucosamina (Quitina). Una vez identificados los compuestos, procedimos a la construcción de los complejos correspondientes con CD44, con el fin de evaluar la afinidad relativa del receptor por cada uno de ellos. Debido a que las herramientas disponibles para la predicción de estructuras proteína-carbohidrato presentan un grado muy bajo de precisión y exactitud, se desarrollo un método alternativo al que se emplea habitualmente con el programa de docking Autodock (CADM), basado en la estructura del solvente en el sitio de reconocimiento para carbohidratos (CBS), al cual denominamos WSBDM. Utilizando el WSBDM, obtuvimos complejos entre CD44 y tetrasacáridos de cada uno de los compuestos seleccionados. Luego realizamos simulaciones de Dinámica Molecular con el fin de caracterizar la estabilidad de los oligosacáridos el CBS de CD44 y estimar la afinidad relativa por receptor a partir del calculo de energía libre de unión con un método de punto final (MMPB-SA). Los resultados indican que solo los oligosacáridos de Liquenina (oLi), tendrían una afinidad significativa por CD44. Por ultimo, decidimos evaluar in vitro la actividad de estos compuestos. Los resultados de los ensayos del efecto de los oligosacáridos, indican que solo los oLi serian capaces disminuir de forma significativa la proliferación celular, en concordancia con los resultados obtenidos in silico. Por otro lado, y mas interesante aun, cuando los oligosacáridos son administrados en combinación con Doxorrubicina, tanto los oligosacárido de Liquenina como los de Xilano, son capaces de potenciar la actividad del quimioterápico. Estos resultados indicarían que quizás estén ejerciendo su efecto por una vía independiente de CD44. Estos resultados in vitro constituyen solo una prueba de concepto de los hallazgos realizados in silico, pero constituyen un estimulo a futuras investigaciones en el tema.

Descripción: Cadherina epitelial (CadE) es una molécula clave en la adhesión celular y alteraciones en su expresión/funciones se asocian a la progresión tumoral. Tanto el aumento como la disminución de CadE han sido relacionados a un mal pronóstico en cáncer de mama (CM) y ovario (CO). Considerando la elevada incidencia y mortalidad de dichas enfermedades, resulta fundamental identificar nuevos moduladores de CadE y la determinación de su rol en el desarrollo, progresión y/o agresividad tumoral. En este trabajo, estudios con líneas celulares/muestras humanas de CO permitieron asociar altos niveles de Cadherina neural y niveles variables de CadE con un fenotipo celular agresivo, así como mayores niveles de CadE con un peor pronóstico. En el CM, estudios con líneas celulares murinas/humanas revelaron una asociación entre la expresión del inhibidor de proteasas SLPI (Serine-Leukocyte-Protease-Inhibitor) y alteraciones en la expresión y/o localización de CadE/?-catenina y relacionaron a ?-catenina nuclear con la expresión de genes de detención del ciclo celular y apoptosis. Por otra parte, la sobre-expresión de una variante novel de ?splicing? de CadE (CadEvar) en células de CM humano se asoció a cambios en moléculas de adhesión, diferenciación, supervivencia, respuesta hormonal, angiogénesis, metabolismo, estado redox, ?splicing? e invasión. En conjunto, los estudios describen nuevos moduladores de CadE en CM y CO y su impacto en la progresión tumoral.

Descripción: En esta Tesis Doctoral demostramos que el bloqueo de la señalización del receptor GABAB en periodos críticos del desarrollo postnatal causa alteraciones permanentes en factores esenciales para un correcto desarrollo y funcionamiento del eje gonadotrófico. Describimos claramente que un input GABAérgico, a través de los RGABAB, durante la ventana postnatal temprana es necesario para la correcta expresión de genes que son críticos para la función reproductiva, como Kiss1, Tac2 y Gnrh1; y genes que codifican para las enzimas de síntesis de neurotransmisores comoGad1 y Th. Cambios en los patrones normales de expresión de estos genes debido a alteraciones en la señalización de GABA provocan efectos río abajo en el eje reproductivo, impactando no solo el desarrollo neonatal, sino estadios más tardíos como la adultez. Este tratamiento impacta principalmente en el núcleo arcuato. Así mismo, demostramos que GABA a través de sus receptores GABAB puede modularla expresión de genes clave para la reproducción más allá de la ventana perinatal. Al prolongar el tratamiento hasta el DPN21 se observan alteraciones que comprometen de diversas maneras eje reproductivo en desarrollo y adulto. De manera llamativa, en este caso también se impacta la expresión de Kiss1 en el núcleo antero ventro-periventricular en las hembras.

Descripción: El cáncer ovárico es uno de los tumores ginecológicos más comunes, y constituye la quinta causa de muerte por cáncer en mujeres. Es altamente metastásico y presenta resistencia a los agentes quimioterapéuticos, rasgos que causa falla a los tratamientos. La falta de mejora en las tasas de supervivencia en las últimas décadas denota la necesidad de encontrar nuevas estrategias terapéuticas para esta patología. El sistema Notch es crucial en el desarrollo y homeostasis celular, además participa en la biología tumoral, donde posee una acción fundamental en la angiogénesis. En los últimos años se han desarrollado inhibidores del sistema entre los cuales se destacan los inhibidores del complejo ?-secretasa. Por otro lado, la vasculatura tumoral posee una estructura anormal que afecta el crecimiento, diseminación y la respuesta a las terapias en los tumores. En los últimos años se ha investigado el fenómeno de ?normalización vascular? , con el fin de mejorar la estructura vascular del tumor y optimizar la llegada de drogas antitumorales al mismo. En base a estos antecedentes, se planteó la siguiente hipótesis: En cáncer de ovario, el Sistema Notch participa en procesos asociados al crecimiento y progresión tumoral, siendo un potencial blanco terapéutico para este tipo de tumor. Además, el factor PDGF-BB ejerce un efecto normalizador de la vasculatura tumoral, y su acción conjunta a la inhibición del Sistema Notch impide el desarrollo tumoral ovárico de manera más eficaz.

Descripción: El estrés por Cd2+genera toxicidad en las plantas y altera el metabolismo del nitrógeno (N). La inoculación con bacterias promotoras del crecimiento (PGPR) como Azospirillum brasilense, se plantea como una estrategia para mitigar el estres abiótico en cultivos. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la respuesta al estrés por Cd2+ en Arabidopsis thaliana cultivada bajo tres fuentes de N y en trigo (Triticum aestivum) inoculado con A. brasilense, ademas de analizar la respuesta de parámetros de la defensa antioxidante frente al estrés por Cd2+ en ambas especies. Las plantas de A. thaliana regadas con la solución conteniendo Amonio mostraron menores niveles del metal en hojas y las plantas de trigo inoculadas con A. brasilense contuvieron menos Cd2+ en raices. Sin embargo, el menor contenido del metal en A. thaliana no logró compensar la toxicidad generada por la forma nitrogenada. En trigo se incrementó el hierro total y en la raíz, la inoculación aumentó la longitud, el contenido de óxido nítirico, la actividad de la enzima nitrato reductasa y de las enzimas antioxidantes Catalasa y Guayacol peroxidasa y disminuyó el contenido de prolina. Los niveles de amonio total y de radical superóxido y peróxido de hidrógeno en las raices fueron menores en las plantas inoculadas. En conclusión, no se observó en este modelo una modificación de los parámetros antioxidantes o de daño oxidativo evaluados en la respuesta al Cd2+ bajo diferentes fuentes de N pero la inoculación resultó efectiva en modificar la toxicidad del metal.

Descripción: La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad desmielinizante, inflamatoria y degenerativa del sistema nervioso central de etiología desconocida. Muestra diferentes patrones clínicos: la forma en recaídas y remisiones (EMRR), y las formas progresivas (secundaria y primaria; EMSP y EMPP respectivamente) que se caracterizan por la presencia de afección cortical, que correlaciona con el deterioro cognitivo y la discapacidad neurológica irreversible de los pacientes. Existen diversos tratamientos para la EMRR, sólo uno para la EMPP y ninguno para la EMSP. Esto se debe principalmente al desconocimiento de los mecanismos patogénicos de las formas progresivas. En el presente trabajo, desarrollamos un modelo animal de afección cortical de EM, que refleja las principales características de la EMSP y EMPP, generado a través de la expresión crónica de interleuquina 1B (IL-1B) en la corteza cerebral. Los animales presentaron neuroinflamación, desmielinización, activación glial y neurodegeneración cortical, asociado a deterioro de la memoria a corto plazo y ansiedad. También demostramos la presencia de inflamación meníngea adyacente a las lesiones corticales, con características similares a las descritas en pacientes con formas progresivas de EM. Un estímulo pro-inflamatorio periférico con IL-1B exacerbó estos hallazgos, afectando la progresión del proceso anatomopatológico, comportamental y molecular.

Descripción: Brucella spp. produce aborto en diferentes huéspedes, y aunque los mecanismos fisiopatológicos involucrados se desconocen, es sabido que los trofoblastos son blanco de la infección con esta bacteria y que se rodean de infiltrado inflamatorio. Con el objetivo de caracterizar la respuesta inmune placentaria y evaluar el rol que cumplen trofoblastos, macrófagos, neutrófilos y células endometriales durante la infección, se infectaron células humanas y caninas con B. abortus y B. canis, respectivamente. Así, demostramos que Brucella spp. es capaz de replicar en células trofoblásticas generando una respuesta proinflamatoria mediada por IL-8/CXCL8, IL-6, MCP-1/CCL2 y/o RANTES/CCL5, la cual es potenciada por IL-1? y TNF-? secretados por fagocitos infectados. El aumento de quimioquinas favorecería el infiltrado inflamatorio, y la interacción entre las células placentarias y los fagocitos, todos ellos susceptibles a la infección con Brucella spp., potencia el aumento de citoquinas proinflamatorias y metaloproteinasas (MMP-2 y MMP-9) con la capacidad de generar daño placentario mediante apoptosis del trofoblasto y debilitamiento de las membranas fetales. Globalmente, estos mecanismos podrían provocar la pérdida de la tolerancia en la interfase materno-fetal y el desencadenamiento del aborto en huéspedes preñados infectados con Brucella spp.

Descripción: La aparición de metástasis pulmonares representa un mal pronóstico durante la progresión del Osteosarcoma (OS). Para obtener información relevante sobre la adquisición de habilidades metastásicas en células de OS, evaluamos eventos funcionales y moleculares asociados a la progresión tumoral. Abordamos un estudio funcional y análisis de perfil proteómico en la línea celular de OS no metastásica SAOS2 y su línea celular derivada LM7 con capacidad metastásica a pulmón. Demostramos que los pasos implicados en la remodelación de la matriz extracelular, migración celular y eventos de cascada angiogénica, pero no la respuesta angiogénica in vivo, fueron funcionalmente relevantes en las células metastásicas. El análisis de términos de ontología génica (GO) y abundancia proteica demostraron similitud entre ambos tipos celulares, con un perfil proteómico diferencial a nivel del secretoma, asociado a respuestas migratorias y eventos de señalización relevantes a supervivencia en las células metastásicas, entre otros. Además, las células madre mesenquimales (MSCs) presentaron una interacción diferencial con las células de OS, con las MSCs exhibiendo una respuesta quimiotáctica elevada ante el secretoma de las células no metastásicas, mientras que las células metastásicas mostraron una mayor migración hacia el secretoma de las MSCs. También identificamos proteínas con potencial de biomarcador. En resumen, abordamos por primera vez una comparación funcional y molecular entre células de OS con distinta capacidad metastásica, destacando el rol del secretoma de las células metastásicas. La identificación de mecanismos y genes expresados de modo diferencial asociados a metástasis, contribuiría al descubrimiento de potenciales marcadores, colaborando en la generación de nuevos enfoques terapéuticos útiles en el control de la diseminación metastásica.

Descripción: La superficie ocular se encuentra expuesta al medio ambiente, convirtiéndose en un blanco para el estudio de los efectos de los contaminantes ambientales. El objetivo general del trabajo fue evaluar los marcadores de estrés oxidativo y mediadores inflamatorios producidos por la exposición al material articulado en distintas estructuras oculares (conjuntiva, córnea y cristalino), utilizando diferentes modelos experimentales. En cultivos de conjuntiva humana, se observó que el estrés oxidativo seguido por la secreción de citoquinas proinflamatorias podría jugar un papel importante en el desarrollo de los efectos tóxicos debidos a la exposición a partículas diésel (50 y 100 µg/mL). En la córnea de ratones expuestos al aire urbano, se observó una respuesta adaptativa temprana del sistema antioxidante, que a tiempos más largos resulta insuficiente para contrarrestar el daño oxidativo. La respuesta inflamatoria está modulada por el aumento temprano en los niveles de IL-10. En el cristalino de ratones expuestos al aire urbano, se evidenció una alteración del balance redox y esto podría afectar al perfil de defensas antioxidantes de estructuras oculares circundantes. Los efectos tóxicos encontrados tienen en común que están mediados por alteraciones en la homeostasis redox celular y por la puesta en juego de mediadores inflamatorios.

Descripción: Previamente demostramos que la deficiencia de zinc durante etapas tempranas programa alteraciones cardíacas y renales. En este trabajo evaluamos si la deficiencia moderada de zinc durante el crecimiento prenatal y postnatal induce alteraciones vasculares y metabólicas que incrementan el riesgo cardiovascular en ratas adultas de ambos sexos. La deficiencia de zinc durante el desarrollo intrauterino y la lactancia programó una disfunción endotelial en ratas de ambos sexos, caracterizada por una menor actividad del sistema del óxido nítrico y una menor respuesta vasodilatadora dependiente de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) en la aorta. Las ratas macho adultas fueron más sensibles a los efectos de la deficiencia dado que presentaron un aumento en la presión arterial, signos de remodelado vascular, y menor expresión y actividad de la eNOS en comparación con las hembras. Además, sólo en ratas macho adultas, la restricción de zinc produjo aumentos en la glucemia, la trigliceridemia y el estrés oxidativo hepático y del tejido adiposo retroperitoneal, que no pudieron ser revertidos en su totalidad con la administración de una dieta control durante el crecimiento postdestete. Este trabajo destaca la importancia para la salud cardiovascular de una ingesta equilibrada de micronutrientes durante diferentes etapas de la vida.

Descripción: El estrés oxidativo es causa y consecuencia de numerosas patologías que presentan elevada morbi-mortalidad en la población mundial, como por ejemplo la Diabetes Mellitus y sus complicaciones. En esta situación, los sistemas de defensa antioxidante resultan insuficientes para mantener la homeosta-sis generando la necesidad de recurrir a terapias farmacológicas. En este sentido, los extractos de plantas poseen numerosos compuestos antioxidantes que pueden servir, al menos, como coadyuvantes en los tratamientos. En la Argentina se encuentra ampliamente distribuida Larrea divaricata Cav. que es un arbusto que posee actividad antioxidante reportada y se sabe que una especie norteamericana relacionada (La-rrea tridentata) es usada popularmente para tratar la Diabetes. Por lo tanto, se propuso estudiar la composición fitoquímica de un extracto acuoso de L. divaricata (ExA), el mecanismo de su acción antioxidante, en diferentes modelos de estrés oxidativo provocado por altos niveles de glucosa, su toxicidad sub-crónica y sus parámetros farmacocinéticos. La caracterización fitoquímica de ExA se realizó a través de la cuantificación de compuestos poli-fenólicos, de flavonoides y de sus compuestos mayoritarios por HPLC, de la determinación de los grupos fitoquímicos de mayor presencia en extractos acuosos y de su composición nutricional y mine-ral. Además, se propuso identificar otros compuestos, polifenólicos, presentes en el extracto. En este sentido, se logró caracterizar a ExA identificando y cuantificando sus compuestos mayoritarios, esta-bleciendo un marcador fitoquímico: NDGA, reportando por primera vez la presencia de compuestos flavonoides: Rutina, Floretina y Epicatequina y determinando su composición nutricional y mineral. Para analizar la farmacodinamia de ExA, se desarrollaron modelos no biológicos ?in vitro? (activi-dad antioxidante general), modelos biológicos ?in vitro? en células del sistema inmune (macrófagos) incubadas con altas concentraciones de glucosa y en órganos como las glándulas submandibulares de ratas con Diabetes inducida por la administración de STZ, y un modelo ?in vivo? en ratones con Dia-betes inducida. Cabe mencionar que se evaluó la actividad de ExA y de NDGA en paralelo para de-terminar si dichos efectos se debían a la acción del NDGA (conocido antioxidante), a una sinergia entre este y otros compuestos o a otros compuestos presentes en ExA. Al analizar la actividad antioxidante general de ExA y NDGA se observó que en, su gran mayoría, dicha actividad se debe a la sinergia entre el NDGA y otros compuestos presentes en el extracto. El NDGA resulto ser el responsable de la modulación de dos enzimas: SOD y CAT y no tuvo participa-ción en la acción reductora de metales de ExA. Cuando se determinó la actividad antioxidante en ma-crófagos sometidos a altas concentraciones de glucosa se observó que la mayoría de los efectos de ExA se deben a otros compuestos. El NDGA estuvo implicado en la prevención del estrés nitrosativo, pero no sería el único responsable. En el modelo de glándulas submandibulares de ratas, se observó que ExA logro revertir los efectos oxidativos de la Diabetes inducida por la administración de STZ. Nuevamente, la sinergia entre los compuestos mostró ser la responsable de la mayoría de los efectos observados. Por otra parte, ExA no presentó toxicidad sub-crónica y su administración por vía oral y/o i.p. no modificó la glucemia ni el peso de los animales. Sin embargo, la administración oral de ExA revirtió el aumento de la glucemia producido por la STZ en ratones. Por último, se llevaron a cabo estudios farmacocinéticos con el fin de determinar la estabilidad de ExA en el medio gastrointestinal y sus parámetros farmacocinéticos. En primer lugar, los cambios que sufre el extracto durante el proceso de digestión simulada no afectaron de manera significativa sus actividades antioxidantes. En conclusión, ExA fue capaz de modular las EROyN?s y los sistemas antioxidantes en distintos modelos siendo más efectivo que su compuesto mayoritario aislado. Además, su actividad antihiperglucemiante refuerza la potencialidad de ExA como coadyuvante de patologías como la DM.

Descripción: La investigación Las representaciones gráficas en la enseñanza y el aprendizaje de la física en la universidad, en la que se inscribe esta tesis, se centró en el estudio de la construcción de conocimiento compartido entre profesores y estudiantes cuando utilizan representaciones gráficas, particularmente gráficos, para la enseñanza y el aprendizaje de la física en la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires. La necesidad de encarar esta tarea obedeció al reconocimiento de los sistemas de representación como condicionante, no solo de la comunicación en la disciplina, sino también, de sus modos de conocer. Los objetivos incluyeron la caracterización de las representaciones gráficas presentes en materiales didácticos, la descripción y el análisis del rol que les asignan los profesores y el reconocimiento de las estrategias y los obstáculos para el aprendizaje vinculado al procesamiento de la información de los gráficos por los estudiantes. En general, se planteó una metodología que recurre a un enfoque mixto para llevar adelante una investigación empírica con un fuerte componente descriptivo, que presentó momentos explicativos, análisis correlacionales y asumió propósitos exploratorios. Los datos provinieron de diversas fuentes, algunas de carácter documental, otras propias del trabajo de campo y cuasi-experimentos. La complejidad del objeto de estudio impuso la necesidad de sostener diferentes acercamientos, por lo que, la estrategia metodológica articuló tres estudios complementarios y convergentes, cada uno de los cuales hace foco en alguno de los elementos propios de todo fenómeno educativo, o en los vértices o polos de las aproximaciones que intentan modelizarlo. El Estudio 1: Los gráficos como saberes de la física en la universidad, se centró en el análisis de materiales didácticos. El Estudio 2: Los gráficos en la enseñanza de la física en la universidad, hizo foco en el conocimiento de los profesores. El Estudio 3: Los gráficos en el aprendizaje de la física en la universidad, indagó las ideas de los estudiantes y el procesamiento de los gráficos cartesianos que ellos realizan. En todos los casos, los participantes fueron profesores y estudiantes en sus escenarios reales de actuación, correspondientes a la asignatura Física. Los principales resultados evidenciaron la consideración de los gráficos como elementos propios de la física. También, permitieron reconocer sesgos en los materiales didácticos analizados. Asimismo, se expuso la consideración pragmática de estas representaciones por parte de estudiantes y profesores y el interés de estos últimos sobre los aspectos vinculados a la construcción de representaciones manifiesto en sus clases. Por otro lado, se evidenció la dificultad de muchos estudiantes para acceder a la información profunda de los gráficos cartesianos y la influencia del contenido representado en esta posibilidad. La alfabetización gráfica de los estudiantes participantes se mostró incompleta. Así, es necesario que los profesores abandonen la idea de autoevidencia de las representaciones y el supuesto de transparencia de los códigos semióticos, pasando a una enseñanza explícita de las reglas del registro gráfico, en la que abunden oportunidades para hacer uso epistémico de las representaciones. Más aún, una enseñanza que aborde el carácter representacional de los modelos de la disciplina. Los resultados de la investigación constituyen, en la dimensión básica, un aporte significativo para la comprensión del rol de las representaciones gráficas en los procesos de enseñanza y de aprendizaje de la física en la universidad. En una dimensión aplicada, este trabajó generó recomendaciones, instrumentos e instancias de formación, que tienen la potencialidad de impactar rápidamente en las aulas. Además, la tarea emprendida generó nuevos interrogantes, abriendo nuevas líneas de investigación y expandiendo el horizonte, dando paso a una didáctica de las ciencias que considera lo representacional como eje de la construcción de conocimiento científico.

Descripción: Las leucemias agudas de infantes (niños menores de 1 año) (LAI) constituyen una entidad única, con características biológicas y clínicas particulares que requieren de un tratamiento individualizado. Presentan frecuentemente alteraciones genéticas que involucran al gen MLL, cuya presencia las define como un grupo de pobre pronóstico. Las alteraciones en MLL pueden ser estudiadas mediante bandeo G, hibridación in situ con fluorescencia (FISH), transcripción reversa seguida de reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) o PCR inversa de larga distancia (LDI-PCR), entre otras. Cada técnica posee ventajas y desventajas, siendo complementarias para la correcta caracterización de dichas alteraciones. Además, la evaluación de la respuesta al tratamiento incluye la determinación de la enfermedad mínima residual (EMR) mediante técnicas altamente sensibles como la citometría de flujo y PCR en tiempo real (RQ-PCR), que utiliza secuencias ?blanco? específicas del clon leucémico. En la leucemia linfoblástica aguda (LLA) se utiliza como blanco las secuencias V-(D)-J de los rearreglos de los genes de Ig/TCR. Sin embargo, su utilidad es limitada en los infantes, ya que muchas de ellas no presentan rearreglos. La alta incidencia de rearreglos de MLL que presentan las LAI, permite utilizar como blanco para cuantificar la EMR la secuencia de fusión del rearreglo a nivel genómico, caracterizada por LDI-PCR. El principal objetivo de este trabajo de tesis fue desarrollar una minuciosa caracterización molecular de las LAI, incluyendo el estudio por LDI-PCR, para incorporar una nueva herramienta diagnóstica. La puesta a punto e implementación de la LDI-PCR permitió identificar blancos moleculares para la determinación de la EMR. Permitió además detectar un nuevo compañero de fusión de MLL nunca antes descripto, y poner a punto la detección Resumen 176 mediante RT-PCR de nuevos rearreglos, ampliando el screening empleado en el laboratorio para el diagnóstico de LA. En cuanto a la determinación de EMR utilizando los rearreglos de MLL se observó la necesidad de emplear sondas marcadas como sistema de detección, debido a dificultades para lograr especificidad y adecuado rango cuantitativo mediante el empleo de SYBR Green relacionadas con las características de las secuencias involucradas. Uno resultados más importantes y prometedor de este trabajo de tesis es que se estableció que las secuencias de fusión de ADN específicas de cada paciente pueden ser utilizadas como blanco molecular para seguimiento de la EMR por técnicas de PCR cuantitativas. Los alelos de fusión génica son marcadores más confiables para los estudios de EMR que los rearreglos de Ig/TCR, debido a su estabilildad clonal. Se obtuvieron datos positivos para el diagnóstico de alteraciones del gen MLL en 34 pacientes con LA, a través del estudio de LDI-PCR. En todos ellos se identificó y caracterizó por secuenciación al menos un alelo de fusión de MLL. Este es el primer estudio realizado en Argentina, en una institución pública estableciendo que el uso de estos marcadores para la determinación de EMR contribuirá a la mejor estratificación, mejor adecuación del tratamiento y resultados de los pacientes infantes con leucemia aguda. También se describen 3 nuevos casos infrecuentes de leucemia linfoblástica B madura con morfología FAB L1 o L2 y que corresponden a infantes con rearreglos del gen MLL. Teniendo en cuenta los malos resultados obtenidos en conjunto, se podría especular que este grupo de pacientes necesita un esquema de quimioterapia diferente al actual. Los datos aportados en esta tesis pueden contribuir a plantear nuevos esquemas quimioterápicos más eficaces. Resumen 177 Adicionalmente, se analizaron las mutaciones del gen FLT3 en LAI y se demostró que el 15% del total de pacientes estudiados presentó mutaciones del tipo TKD. Este resultado sugiere que es conveniente estudiar estas mutaciones en todos los pacientes infantes con LA a fin de identificar a aquellos pacientes que responderían a la terapia con nuevas drogas inhibidoras de FLT3. Con respecto al estudio de las mutaciones en GATA-1 en infantes con Síndrome de Down (SD) y mielopoyesis anormal transitoria (MAT) y/o leucemia megacarioblástica aguda (LMCA), se detectaron mutaciones en GATA-1 en todos los pacientes analizados. Uno de los pacientes con diagnóstico de MAT remitió espontáneamente y 9 meses más tarde desarrolló LMCA. Se detectó la existencia de la misma mutación en GATA-1 en ambas muestras (MAT y LMCA), el análisis citogenético mostró la adquisición de nuevas anomalías por parte del clon leucémico. Estos hallazgos fortalecen la teoría de que ambos cuadros involucran a la misma población de células hematopoyéticas y sugiere que la evolución de MAT a LMCA sería consecuencia de la adquisición de mutaciones adicionales. Este estudio de las mutaciones del gen GATA-1, es el primer estudio realizado en la Argentina, en el que se caracterizaron estas mutaciones en pacientes con SD y MAT y/o LMCA. La alta frecuencia de mutaciones detectada sugeriría la conveniencia de investigar su presencia en todos los neonatos con SD a fin de individualizar a aquellos con mayor riesgo de presentar MAT y/o LMCA, quienes deberían recibir un control clínico más riguroso, con la finalidad de realizar un diagnóstico precoz que evite las complicaciones del cuadro agudo. Además, la evaluación seriada de las mutaciones detectadas permitiría monitorear a los pacientes con MAT para comprobar la cinética de desaparición del clon preleucémico y/o predecir tempranamente una eventual progresión a LMCA. Resumen 178 Finalmente, este trabajo de tesis tiene su foco en las alteraciones moleculares de los infantes, tanto las anormalidades del gen MLL, FLT3 y mutaciones de GATA-1, con la finalidad de lograr un mejor conocimiento de esta población de pacientes y desarrollar las técnicas necesarias para su estudio.

Descripción: La leucemia linfática crónica (LLC) es una enfermedad incurable y se caracteriza por la acumulación clonal de linfocitos B maduros en sangre periférica y órganos linfoides. Las células leucémicas sobreviven, se activan y proliferan en los tejidos linfoides por percibir señales a través de su receptor antigénico (BCR) y por contactar con linfocitos T activados, células estromales y mieloides. Es por eso que la terapia con inhibidores de las tirosinas quinasas asociadas al BCR (BCR-KI) resulta tan exitosa ya que moviliza a las células leucémicas de los órganos linfoides hacia la circulación. Si bien estos inhibidores no curan la LLC, el clon leucémico en circulación, lejos de los nichos de supervivencia, es más susceptible al tratamiento con otros agentes terapéuticos, entre ellos, los anticuerpos monoclonales anti-CD20, como el rituximab y el inhibidor de BCL-2, llamado venetoclax o ABT-199. Venetoclax mostró resultados muy alentadores en ensayos clínicos y fue aprobado en el 2016 en EE. UU. y en Argentina como monoterapia, y en 2018 en combinación con rituximab luego de los resultados alentadores observados en el estudio MURANO. Si bien en los últimos años las nuevas terapias han mejorado el panorama en el tratamiento de la LLC, esta enfermedad hoy continúa siendo incurable. Por todo esto, el objetivo general del trabajo fue la búsqueda racional de una combinación de agentes terapéuticos que logren mejorar el tratamiento actual de los pacientes con LLC, centrándonos en el venetoclax, los BCR-KIs y el anticuerpo anti-CD20 rituximab. Para ello primero estudiamos el impacto del tratamiento in vitro con venetoclax en la sobrevida del clon leucémico, los linfocitos T, las células NK y los monocitos de los pacientes con LLC. Encontramos que las células leucémicas son altamente sensibles a la droga en comparación al resto de las poblaciones. Asimismo, venetoclax no modificó sustancialmente la capacidad de activación de los linfocitos T. Luego determinamos que las señales brindadas por los linfocitos T autólogos activados activaban al clon leucémico, incrementando la expresión de moléculas antiapoptóticas como MCL-1 y BCL-XL, las cuales no son blanco del venetoclax, por lo que se favorecía la resistencia del clon leucémico a la droga. Asimismo, encontramos que las células que resisten a venetoclax presentan un fenotipo más agresivo caracterizado por un tamaño aumentado, mayor expresión de CD86, PD-1 y mayor potencial proliferativo dado por el aumento en Ki67. Nuestros hallazgos alientan a la combinación de la droga con el inhibidor de SYK entospletinib ya que fue capaz de revertir la resistencia a venetoclax inducida por los linfocitos T activados. Por último, estudiamos el efecto in vitro del venetoclax y entospletinib en la CCDA mediada por células NK y en la fagocitosis de células leucémicas recubiertas con rituximab. Encontramos que venetoclax no afecta la CCDA en las células NK, mientras que entospletinib la inhibe. En relación a la fagocitosis, nuestro grupo ya había trabajado con BCR-KI y fagocitosis demostrando que tanto ibrutinib como entospletinib reducían la fagocitosis de las células LLC recubiertas con rituximab. En este trabajo de tesis demostramos que venetoclax, actuando sobre el clon leucémico, incrementa su fagocitosis y que este proceso se asocia a un incremento en la exposición de fosfatidilserina, sin embargo, no puede explicarse por una mayor unión de rituximab a las células LLC. Más interesante aún, venetoclax continuó siendo capaz de incrementar la fagocitosis de las células LLC opsonizadas, aún en presencia de entospletinib. En conclusión, la generación de resistencia in vitro a venetoclax inducida por los linfocitos T autólogos activados sugiere que las células leucémicas presentes en los nichos de supervivencia no serían eficientemente eliminadas por el venetoclax como monodroga, seleccionándose aquellas células con un fenotipo más agresivo y con mayor capacidad proliferativa. Nuestros resultados alientan al empleo de venetoclax en combinación con entospletinib, el cual fue capaz de revertir la resistencia de las LLC inducida por el microambiente tumoral. Además, la combinación de estos dos agentes con anticuerpos anti-CD20 podría ser potencialmente beneficiosa para los pacientes ya que venetoclax fue capaz de incrementar la fagocitosis de las LLC opsonizadas con rituximab aún en presencia de entospletinib.

Descripción: Cadherina Epitelial (CadE) es una glicoproteína transmembrana que cumple un rol fundamental en la adhesión intercelular. La pérdida de CadE es clave en la Transición Epitelio Mensenquimal (TEM); las células pierden capacidad adhesiva y ganan comportamientomótil e invasivo, posibilitando la progresión tumoral a través de la invasión local de los tejidos y la metástasis a distancia. En el Cáncer de Próstata (CP) y el Cáncer de Vejiga (CV) se han reportado alteraciones en la expresión/función(es) de CadE y de otras moléculas relacionadas a la TEM, pero los estudios no son concluyentes. Asimismo, existen moléculas relacionadas a CadE y a la progresión y agresividad tumoral que aún no han sido estudiadas en estos tumores. Específicamente, Disadherina (Dys) se ha encontrado sobreexpresada en numerosos tumores sólidos y asociada a la metástasis, no habiendo antecedentes en CP. Asimismo, Efrina-B1 ha sido relacionada a la desregulación de ?-catenina y la agresividad tumoral, pero no hay antecedentes de su expresión en CV. El presente estudio ha caracterizado la expresión de CadE y otros marcadores de la TEM en CP y CV. Asimismo, por primera vez describe la expresión de Dys en CP y Efrina-B1 en CV y las asocia a la progresión y agresividad tumoral de estos tumores.

Descripción: La histamina ejerce múltiples acciones mediante sus receptores específicos: rH1-rH4, pertenecientes a la superfamilia de receptores acoplados a proteínas G. Los rH1 y rH2 se coexpresan en muchos tipos celulares y cumplen funciones en la respuesta alérgica inmediata, inflamación, secreción ácida gástrica, neuromodulación y en procesos de proliferación y diferenciación celular. Sus ligandos son ampliamente utilizados para el tratamiento de alergias y acidez gástrica, existiendo un amplio interés en su reposicionamiento para otras patologías. El objetivo de esta tesis consiste en profundizar los mecanismos de regulación cruzada entre rH1 y rH2 inducida por sus ligandos, con el fin de ampliar los conceptos establecidos y aportar nuevas bases para la utilización racional de los ligandos histaminérgicos. Inicialmente, determinamos la participación de GRK2 a través del dominio quinasa en la desensibilización cruzada inducida por agonistas. Asimismo, determinamos que dicha regulación cruzada afecta también la respuesta a los antihistamínicos H1 y H2. Por otro lado, pusimos en evidencia la capacidad de los antihistamínicos de inducir la internalización cruzada de los receptores, responsable de la desensibilización cruzada de los mismos. Nuestros resultados aportan nuevos conceptos con respecto a los mecanismos de señalización de rH1 y rH2, importantes a la hora del tratamiento farmacológico con sus ligandos.

Descripción: La degeneración walleriana es un proceso caracterizado por la degeneración axonal y la desmielinización, que puede ser utilizado como un modelo de lesión extremadamente útil y sencillo para comprender la fisiopatología de enfermedades neurodegenerativas, inflamatorias y traumáticas del sistema nervioso periférico. La lesión induce la fragmentación del axón distal y, como consecuencia de la pérdida de contacto entre las neuronas y las células de Schwann (CS), se inicia la degradación de la mielina. Adicionalmente, las CS proliferan y adquieren un fenotipo activado, desencadenando la respuesta inflamatoria local. En conjunto con los fibroblastos, promueven el arribo de macrófagos hematógenos. Transcurridas 72 horas, los macrófagos se convierten en la población leucocitaria dominante y son quienes completan la remoción de los restos celulares y de mielina, permitiendo entonces la regeneración axonal y la consecuente remielinización. Las células mononucleares de médula ósea (CMMO) incluyen diferentes poblaciones celulares entre las que se encuentran representantes de los linajes monocítico y linfocitario y los precursores endoteliales. Pese a ser una fracción heterogénea contienen una población minoritaria de células multipotentes (células madre mesenquimales), son de fácil obtención y tienen un alto potencial de diferenciación a varios linajes celulares bajo ciertas condiciones del entorno. Es por ello que se han propuesto como estrategia terapéutica en diversas patologías como soporte de la regeneración. Con el objeto de evaluar los efectos benéficos de las CMMO sobre la recuperación estructural y funcional del sistema nervioso periférico, en nuestro laboratorio se utilizaron dos modelos de degeneración walleriana, uno irreversible como la ligación y otro reversible como la compresión del nervio ciático. En ambos modelos experimentales se demostró la migración espontánea de las CMMO endógenas o post trasplante a la zona desmielinizada del nervio ciático, y sus efectos positivos sobre la regeneración axonal y la remielinización. Asimismo, las CMMO demostraron tener efecto analgésico al evitar el desarrollo del dolor neuropático característico de la lesión y promover la recuperación del nervio en términos funcionales. En el presente trabajo se propuso analizar el comportamiento de las CMMO en etapas tempranas y tardías de la lesión, y de este modo ahondar en los mecanismos involucrados en el citado efecto benéfico. Para ello se recurrió al aislamiento de CMMO de ratas genéticamente modificadas para la expresión de la proteína fluorescente verde bajo un promotor constitutivo. Inicialmente se realizó una caracterización de las poblaciones celulares contenidas en las CMMO, y posteriormente se validó la utilización de CMMO aisladas de los animales transgénicos, en términos de su capacidad de migrar, incorporarse al tejido dañado y promover la regeneración axonal, remielinización y recuperación funcional. La expresión de GFP permitió hallar las células trasplantadas por vía sistémica, hasta 60 días luego de la lesión. Algunas de ellas demostraron ser capaces de expresar marcadores ausentes antes del trasplante, es decir, cambios fenotípicos compatibles con un proceso de transdiferenciación a CS. Habiendo observado que una proporción significativamente grande de células abandona el tejido luego de dos a tres semanas de producida la lesión, se propuso dilucidar si la terapia celular tenía un efecto modulador sobre la primera fase, es decir, la respuesta inflamatoria. Para ello, se debió validar el modelo experimental en ratones. Una vez comprobada la reproducibilidad del mismo, se recurrió a la técnica de qPCR para evaluar cambios en la expresión de los ARNm de las principales citoquinas y enzimas involucradas. Posteriormente, a través de citometría de flujo multiparamétrica, se Resumen Resumen 13 analizó el fenotipo de los macrófagos en la zona distal a la lesión. En conjunto, los resultados mostraron que las células de médula ósea disminuyen la expresión de ciertos marcadores proinflamatorios y anticipan la expresión de marcadores antiinflamatorios. La búsqueda de nuevas estrategias farmacológicas que aceleren la recuperación del nervio lesionado, y su aplicación en terapias combinadas, también es parte de los intereses de nuestro grupo. Por ello, se inició un estudio focalizado en los efectos del litio en CS aisladas, y en sistemas de co-cultivos con neuronas embrionarias. Se evaluaron los cambios morfológicos, la supervivencia, proliferación y diferenciación de las CS. Los resultados mostraron que el litio per se no fue capaz de promover la proliferación y diferenciación de las CS en cultivo y, cuando se administró junto con señales inductivas de dichos procesos, también evitó el reingreso en el ciclo celular y la expresión de marcadores específicos de CS diferenciadas. La acción antagónica del litio demostró ser reversible y específica. En ensayos de co-cultivo, impidió la formación de mielina sin afectar la capacidad de las CS para interactuar con los axones o sintetizar los componentes de la lámina basal. Llamativamente, el tratamiento con litio no indujo la degradación de la mielina preformada o la desdiferenciación de las CS. La capacidad del litio para impedir la transición hacia un fenotipo mielinizante, proporcionó una forma única de interferir farmacológicamente con el inicio de la mielinización. Considerando la reversibilidad de la acción y su reconocida capacidad inductora de los procesos autofágicos, se iniciaron estudios para evaluar su efectividad in vivo, y así maximizar la eficiencia de la reparación del tejido nervioso y la remielinización de las CMMO. Hasta el momento, la administración oral de litio, combinada o no con el trasplante por vía sistémica de CMMO, no demostró tener efectos benéficos notorios sobre la recuperación estructural y funcional del nervio dañado.

Descripción: El receptor nicotínico es un receptor ionotrópico de la superfamilia de canales iónicos gatillados por ligando, ampliamente distribuido en la naturaleza. En los mamíferos el subtipo neuronal está presente en las sinapsis colinérgicas del sistema nervioso central y del periférico mientras que el subtipo muscular se encuentra en la placa neuromuscular. Las alteraciones del receptor nicotínico ocasionan una amplia variedad de patologías: miastenia gravis, enfermedad de Alzheimer, epilepsia, etc. Actualmente no se dispone de drogas con propiedades de modulación alostérica sobre este receptor útiles en tratamientos farmacológicos. El presente trabajo estudia su interacción con un ligando que tiene propiedades de modulador alostérico para el receptor nicotínico, denominado AC4-ASA; para ello, se utilizó la estrategia de marcación por fotoafinidad seguida de espectrometría de masas; complementariamente, se modeló su interacción mediante docking molecular. Se encontró que el AC4-ASA se une a un sitio en la interfase ?/?, a dos en la ?/? y a otros dos sitios sobre ?, de modo que el ligando posee más de un sitio de interacción y se confirma su capacidad de unión al sitio ortostérico. Del análisis de los sitios de unión se propone un mecanismo de modulación de la afinidad por la nicotina.

Descripción: La cardiopatía isquémica es una patología altamente prevalente a nivel mundial, responsable del deceso de millones de personas cada año. A pesar de los notables avances realizados en las estrategias de prevención de riesgo y de tratamiento, no existe al día de hoy una terapia coadyuvante efectiva para prevenir la injuria por isquemiareperfusión. Por otra parte, la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) es una serinatreonina quinasa que desempeña una importante función en numerosos tejidos, actuando como un sensor de los niveles energéticos de la célula, siendo capaz de coordinar los procesos anabólicos y catabólicos, con el propósito de restablecer la homeostasis celular. A causa del alto requerimiento de ATP que presenta el corazón, la función desempeñada por esta enzima ha adquirido especial relevancia en este órgano. El presente trabajo de Tesis fue realizado con el propósito de ahondar en el conocimiento acerca del papel desempeñado por la activación intrínseca de la AMPK, en la isquemia y en la reperfusión del miocardio. Dado que, desde el inicio de los síntomas asociados con el infarto agudo de miocardio, los niveles de ácidos grasos ascienden en plasma, y sabiendo que la disponibilidad de los diferentes sustratos exógenos condiciona el estado metabólico del cardiomiocito, se investigó el papel desempeñado por esta enzima en presencia de glucosa como único sustrato exógeno y en presencia de glucosa y elevadas concentraciones de palmitato como sustratos metabólicos exógenos. Para llevar a cabo los objetivos propuestos, se empleó un modelo de 75 minutos isquemia - 75 minutos reperfusión simuladas, utilizando aurículas izquierdas aisladas de ratas. En estas condiciones se determinó el perfil de activación endógeno la AMPK y los efectos producidos por la inhibición farmacológica de esta enzima sobre la función contráctil, el contenido tisular de ATP, la capacidad mitocondrial de síntesis de ATP, la viabilidad celular, la ultraestructura miocardio auricular y el proceso de autofagia en el miocardio sometido a isquemia-reperfusión. Cuando las aurículas fueron incubadas con glucosa como único sustrato exógeno, la isquemia simulada generó un marcado descenso de los parámetros contráctiles evaluados, desarrollo de contractura y una disminución pronunciada del contenido de tisular de ATP. La reperfusión simulada promovió la recuperación parcial de la función contráctil y la disminución de la reserva contráctil. En estas condiciones, se observó la recuperación parcial del contenido de ATP tisular pre-isquémico, efecto que fue acompañado por una disminución en la velocidad de producción mitocondrial de ATP y por la observación de alteraciones en la estructura mitocondrial. Asimismo, la reperfusión simulada produjo una disminución de la viabilidad celular. Por otra parte, el palmitato en elevadas concentraciones, ejerció un papel deletéreo durante la isquemia, acelerando el desarrollo de contractura. Asimismo, durante la reperfusión disminuyó la recuperación de la función contráctil, la reserva contráctil y la recuperación del contenido tisular de ATP, sin afectar significativamente la ultraestructura miocárdica, la capacidad mitocondrial de producción de ATP, ni la viabilidad celular. Acompañando estos resultados, se observó la activación del proceso de autofagia. Dicho proceso ejercería efectos protectores, ya que la inhibición farmacológica, mediante el empleo de 3-metiladenina, generó efectos deletéreos sobre la recuperación del miocardio, contribuyendo a la disminución de la reserva contráctil y el desarrollo de taquiarritmias de origen mitocondrial. La observación de un mayor deterioro de la estructura y de la función mitocondrial, sin afectar la viabilidad celular cuando la autofagia fue inhibida, sugiere una asociación entre el proceso de autofagia y la preservación estructural y funcional de las mitocondrias, en las células que han sufrido estrés subletal y que fueron capaces de recuperarse. La activación de este proceso no fue afectada por los sustratos metabólicos exógenos. Por otra parte, se demostró que durante la isquemia la AMPK sería activada, persistiendo su activación durante la primera etapa de la reperfusión. Si bien, los sustratos metabólicos exógenos a los cuales el miocardio es expuesto, no ejercerían efectos sobre el perfil de activación de la AMPK, condicionarían el papel desempeñado por dicha enzima durante la isquemia y la reperfusión. Específicamente, la activación intrínseca de la AMPK ejercería efectos protectores en el miocardio sometido a isquemia-reperfusión cuando la glucosa se encuentra disponible como único sustrato exógeno. En estas condiciones, dicha enzima se encontraría implicada en la recuperación parcial del contenido tisular de ATP y de la reserva contráctil. Dichos efectos serían mediados, al menos en parte, por el incremento en la actividad de la PDH, sin afectar ni la viabilidad celular ni la capacidad mitocondrial de producción de ATP. A su vez, la activación parcial del proceso de autofagia por esta enzima, desempeñaría acciones beneficiosas sobre el miocardio reperfundido. Contrariamente, la activación intrínseca de la AMPK cuando las aurículas fueron incubadas en presencia de altas concentraciones de palmitato, como ocurre en los pacientes que sufren infarto agudo de miocardio, ejerció efectos deletéreos. En estas condiciones, la AMPK al promover la oxidación de los ácidos grasos durante la reperfusión, generaría la disminución de la actividad de la PDH y, por lo tanto, el desacople entre la glucólisis y la fosforilación oxidativa. Esta situación, se acompañaría de una disminución en la recuperación del contenido tisular de ATP, hecho que sería responsable, al menos en parte, de la menor reserva contráctil. En conclusión, los hallazgos realizados en este trabajo de Tesis, brindan información novedosa, acerca del papel desempeñado por la activación intrínseca de la AMPK en el miocardio sometido a isquemia-reperfusión, resultando un factor determinante de sus efectos, los sustratos metabólicos exógenos a los cuales los cardiomiocitos son expuestos.

Descripción: La esfingosina cinasa (SphK) biosintetiza esfingosina-1-fosfato (S1P), un esfingolípido bioactivo con importantes acciones biológicas. La S1P puede actuar intracelularmente o a través de receptores. La diferenciación celular de las células epiteliales renales es un proceso que involucra la transición mesénquima epitelio (MET). Durante la MET, células mesenquima?ticas se tornan polarizadas y establecen uniones célula-célula maduras. El objetivo de la presente tesis fue estudiar la participación de la S1P en el proceso de MET de células epiteliales renales, así como también en el mecanismos de homeostasis epitelial, una vez que el estado diferenciado ya se ha establecido. Se encontró que existe una disminución de la actividad de la vía SphK/S1P conforme el avance de la diferenciación celular. En estadios menos diferenciados, la S1P actúa por un mecanismo intrácrino controlando la síntesis de novo de los esfingolípidos, para garantizar el correcto tráfico de las proteínas de la unión adherente. Mientras que, en células diferenciadas el bajo tono de síntesis global moviliza al receptor de S1P(2) a la membrana plasmática. Esto permite que las células apoptóticas aumenten localmente la S1P por medio de la SphK2 produciendo la extrusión de la célula señalizadora y garantizando así la integridad del tejido epitelial.

Descripción: La placenta humana es un tejido normal; sin embargo, las células del citotrofoblasto extravelloso (CEV) comparten varias características con las células tumorales. Adicionalmente, las acuaporinas (AQPs) y Cav-1 modulan la migración e invasión durante el desarrollo tumoral y se encuentran alteradas en patologías del embarazo. HIPÓTESIS: Las AQPs y Cav-1 participan en la migración e invasión del trofoblasto duranteel desarrollode la placentay alteraciones en su funcionalidad conducen a desórdenes gestacionales caracterizados por una placentación defectuosa. MATERIALES Y MÉTODOS: Líneas celulares: Swan 71 (CEV) y EA.hy926 (endotelial). Ensayos de migración e invasión celular: cicatrización de herida, invasión sobre insertos pretratados con matriz extracelular y zimografía. Angiogénesis: ensayo de tubulogénesis. RESULTADOS: El silenciamiento de AQP3 mediado por siRNA y la disrupción de caveolas mediada por metil-?-ciclodextrina redujeron la migración del CEV. La invasión celular solo disminuyó significativamente luego del bloqueo simultaneo de todas las isoformas de AQPs, acompañada de una actividad reducida de MMP-2. La disrupción de caveolasaumentó significativamente la angiogénesis del CEV y de células endoteliales. DISCUSIÓN: Una expresión anómala de AQPs, en particular de AQP3, y una reducción del número de caveolas/Cav-1 originarían alteraciones durante la formación temprana de la placenta y podrían estar asociadas a distintas patologías, como la preeclampsia o la restricción del crecimiento intrauterino.

Descripción: La señalización mediada por el factor de crecimiento fibroblástico 2 (FGF2) y sus receptores (FGFRs) ha sido ampliamente estudiada en células somáticas, aunque existen escasas evidencias sobre su función en las gametas. El objetivo general de este trabajo fue caracterizar la expresión de FGF2 y FGFRs en tejidos reproductivos y gametas de mamíferos, y establecer su rol en la regulación de la fisiología espermática. Para ello se utilizaron los modelos humano y murino. Los resultados en el modelo humano mostraron: 1) la presencia y localización de FGF2 y FGFRs en espermatozoides y testículo, 2) el efecto beneficioso del FGF2 recombinante (FGF2r) sobre la motilidad y la recuperación espermática, 3) la relación entre los niveles de FGF2 en espermatozoides y otros parámetros seminales. En el modelo murino, se demostró: 1) la presencia y localización de FGF2 y FGFRs en gametas y tejidos reproductivos, 2) el efecto del agregado de FGF2r sobre diversos parámetros espermáticos, 3) que animales depletados de FGF2 presentan defectos espermáticos y en la espermatogénesis. En conjunto, los resultados aportan evidencias acerca de la presencia y función del sistema FGF2/FGFRs en espermatozoides y tejidos reproductivos, y eventualmente, podrán contribuir a proponer nuevas herramientas para el diagnóstico y tratamiento de la infertilidad masculina.

Descripción: Para fecundar al oocito, el espermatozoide de mamíferos debe atravesar una serie de cambios bioquímicos conocidos como capacitación. La activación de PKA es esencial para que la capacitación se lleve a cabo, y por lo tanto los niveles de AMPc son finamente regulados durante este proceso. Tradicionalmente, los niveles de AMPc están determinados por la tasa entre su síntesis y degradación. Sin embargo, hemos descripto que el eflujo de AMPc a través de la Proteína Asociada a Resistencia a Multidrogas 4 (MRP4) modula la disponibilidad de este nucleótido mientras provee AMPc al espacio extracelular para disparar eventos de señalización en el espermatozoide bovino criopreservado. En la presente tesis nuestro objetivo fue profundizar el rol del sistema de eflujo de AMPc en la capacitación espermática en mamíferos. En resumen, nuestros resultados sugieren que el MRP4 juega un papel crítico en la capacitación del espermatozoide bovino, murino y humano. Sin embargo, los mecanismos asociados con el eflujo de AMPc son diferentes entre bovinos y murinos. En el primero, el MRP4 provee un tono de AMPc extracelular para la señalización purinérgica por A1, mientras que en el último MRP4 regula el eje de actividad de PKA-Ca2+. En este contexto, el eflujo de cAMP cíclico emerge como un importante proceso en la fisiología espermática y se vuelve un blanco atractivo para el diseño de anticonceptivos no hormonales.

Descripción: Los trastornos del espectro autista (TEA) son un grupo de desórdenes del neurodesarrollo de inicio temprano, cuyo núcleo sintomático son los déficits en la comunicación e interacción social e intereses y actividades restringidos y estereotipados. Los TEA se caracterizan por alteraciones sinápticas, neuroinflamación y conectividad cerebral atípica. Actualmente, se postula una hiper-conectividad de circuitos locales e hipo-conectividad de largo alcance en los TEA. Lamentablemente, no existe terapia farmacológica para sus síntomas nucleares. El modelo VPA es ampliamente aceptado en el estudio de los TEA, dada su validez de constructo, apariencia y predicción. El enriquecimiento ambiental es una estrategia utilizada en diversos modelos y en animales naive mediante la cual se modula la neuroplasticidad y se obtienen beneficios conductuales. El objetivo de este trabajo de Tesis fue evaluar la conectividad en el cerebro de los animales VPA y los efectos conductuales y neurobiológicos del enriquecimiento ambiental sobre estos animales en una etapa crítica del desarrollo postnatal, junto a la disección de la relevancia de sus componentes. Para ello, se administró una única dosis de ácido valproico (VPA, 450 mg/kg) a hembras gestantes (E10,5). Los animales VPA presentaron un retraso en parámetros de crecimiento, maduración y desarrollo conductual en un estadio postnatal temprano, seguidos de déficits conductuales en el estadio prepuberal que reproducen los síntomas nucleares de los TEA. En el aspecto funcional, se evaluó la captación de -fluordesoxiglucosa (FDG) cerebral mediante PET. Los animales VPA mostraron una menor captación cerebral global de FDG y un incremento en la captación de FDG local y asimétrica, en la corteza prefrontal y somatosensorial, el cíngulo, los ganglios basales, la amígdala, el tálamo y el hipocampo. Para estudiar las bases neurobiológicas de la hipo-conectividad de largo alcance, se estudiaron aspectos moleculares, ultraestructurales y celulares en el cuerpo calloso (CC), la principal estructura de conexión interhemisférica. Los animales VPA presentaron una menor proporción de axones mielínicos en el CC y aberraciones en la vaina de mielina, compatibles con una pérdida de su compactación característica. Asimismo, se evidenció un menor número de oligodendrocitos maduros y un aumento en la densidad de precursores oligodendrogliales (OPCs) en el CC de los animales VPA, en ausencia de gliosis reactiva. Estos cambios se acompañaron de alteraciones en la expresión de la molécula de adhesión celular neural y su forma polisialilada (PSA-NCAM). En cambio, los animales VPA evidenciaron preservada la vaina de mielina y ausencia de alteraciones en el linaje oligodendroglial en la corteza prefrontal medial (CPFm). Dados los beneficios del enriquecimiento ambiental (EE) sobre aspectos conductuales, neuroquímicos y en la dinámica oligodendroglial en animales naive, se decidió utilizar esta estrategia para evidenciar sus efectos sobre los animales VPA. El EE completo (físico y social) previno las deficiencias en la actividad exploratoria y en la exploración social de los animales VPA. El EE no tuvo efecto sobre la actividad estereotipada y la conducta símil-ansiedad, exacerbadas en los animales VPA. En lo que respecta a la neurobiología de estos animales, el EE previno la reducción de axones mielínicos y las aberraciones de la vaina de mielina en el CC de los animales VPA. El EE previno el aumento de la densidad de los OPCs, sin afectar el número de oligodendrocitos maduros en el CC de los animales VPA. Los animales VPA evidenciaron un aumento en el número de sinapsis en la CPFm, que fue prevenido por el EE. Para identificar la importancia de los componentes físico y social del EE en sus efectos conductuales, se implementó una estrategia de enriquecimiento ambiental exclusivamente físico (EF). Esta estrategia no sólo previno los déficits en la actividad exploratoria y en la exploración social evidenciados en los animales VPA sino que, a diferencia del EE completo, también previno el incremento de la conducta estereotipada. En este trabajo de Tesis se describen alteraciones conductuales en los animales VPA presentes en estadios postnatales tempranos y estadios prepuberales, que representan el núcleo sintomático de los TEA. Notablemente, este trabajo apoya la hipótesis de la hiper-nconectividad local e hipo-conectividad de largo alcance para los TEA. Los animales VPA evidencian alteraciones en el perfil metabólico cerebral, con un hipo-metabolismo global y una hiperactividad metabólica local y en algunos casos asimétrica, en diversas regiones cerebrales asociadas a los síntomas nucleares de los TEA. Asimismo, se evidencian las bases neurobiológicas subyacentes a la hipo-conectividad de largo alcance postulada para los TEA. Los animales VPA presentan alteraciones en la mielinización y la dinámica oligodendroglial, acompañados por cambios en moléculas de adhesión relevantes en la señalización entre los axones y la oligodendroglia, y para el correcto desarrollo de tractos de sustancia blanca. La ausencia de cambios en la CPFm, descarta una afección generalizada en la mielinización y la dinámica oligodendroglial en el cerebro de los animales VPA. El EE promueve beneficios conductuales a los animales VPA, concomitantemente con la modulación de la mielinización y la dinámica del linaje oligodendroglial en el CC y la sinapsis en la CPFm. Así, el EE modula la conectividad cerebral atípica en los animales VPA. Sorprendentemente, el EF genera mayores beneficios en la conducta de los animales VPA, señalando el papel fundamental del componente físico e indicando que el componente social no es requerido para promover los beneficios conductuales del EE. De este modo, el EE y el EF se establecen como herramientas para el estudio de las bases neurobiológicas y los blancos terapéuticos de los TEA.

Descripción: En la presente tesis, se desarrolló una plataforma integrada para la producción y purificación eficiente y de bajo costo de antígenos recombinantes de aplicación en kits de diagnóstico. Se evaluó la expresión de los dominios III de los cuatro serotipos y consenso de la proteína E del virus del dengue fusionados a la Hidrofobina I de Trichoderma reesei, utilizando diferentes sistemas de expresión. Entre los sistemas de expresión evaluados, las proteínas recombinantes fueron expresadas mediante el sistema de baculovirus en células de insecto y en larvas de la especie Rachiplusia nu. En la levadura Pichia pastoris se expresaron las proteínas recombinantes, salvo la proteína del dominio III serotipo 2. Las proteínas recombinantes fueron purificadas mediante sistemas de dos fases acuosas (ATPS) utilizando Tritón X-114 al 2%. El sistema de ATPS fue aplicado satisfactoriamente para la remoción de producto in situ del cultivo de Pichia pastoris. Los antígenos fueron utilizados para el desarrollo de un kit diagnóstico para la detección de inmunoglobulinas IgG anti-dengue en el suero de pacientes. La inmunogenicidad de los antígenos recombinantes se estudió en ratones, como modelo animal. La tesis, presenta avances y sienta bases para continuar la investigación de estrategias integradas para la obtención de antígenos con aplicación en kits diagnósticos y potenciales antígenos vacunales para dengue y otras enfermedades infecciosas.

Descripción: El dengue es la enfermedad viral transmitida por vectores de mayor importancia en el mundo en términos de morbilidad y mortalidad. Su incidencia ha aumentado enormemente en las últimas décadas y se estima que se producen 390 millones de infecciones cada año. En Argentina, si bien el comportamiento del dengue es epidémico, se verifica la presencia del vector en la mayoría de las provincias. Para su diagnóstico, los enzimoinmunoensayos que permiten la detección de IgM e IgG anti-dengue son métodos muy utilizados en la práctica clínica, debido a su simplicidad y rapidez. Sin embargo, la mayoría de los reactivos disponibles en la actualidad utilizan antígenos obtenidos a partir del virus completo, lo que disminuye su especificidad debido a la reactividad cruzada con otros flavivirus. Por otro lado, los reactivos comerciales que utilizan antígenos recombinantes tienen un alto costo y, por lo tanto, no son accesibles para todos los laboratorios. El objetivo general de este trabajo fue el desarrollo de un proceso integrado para la producción y purificación antígenos del virus del dengue de manera recombinante utilizando plataformas de bajo costo para el desarrollo de un enzimoinmunoensayo diagnóstico. Los antígenos con los que se trabajó fueron la proteína de la envoltura del virus del dengue serotipo 2 (en su versión truncada que carece de la región transmembrana, Et) y su dominio III (DomIII). Estos antígenos se expresaron fusionados con la Hidrofobina I (HFB) de Trichoderma reesei con el fin de purificarlos fácilmente y de manera económica por sistemas de dos fases acuosas (ATPS). Se ensayaron dos sistemas de expresión, uno basado en plantas de Nicotiana benthamiana y el otro basado en células y larvas de insectos utilizando baculovirus recombinantes. Mediante el sistema de expresión transiente en plantas de N. benthamiana se logró expresar la proteína Et fusionada a HFB (EtHFB), sin embargo, no se logró expresar el DomIII fusionado a HFB (DomIIIHFB). La extracción de EtHFB del tejido vegetal requirió el uso de SDS y DTT como aditivos en el buffer de extracción, lo que imposibilitó su purificación por ATPS con Tritón X-114. Para la expresión en células y larvas de insectos se desarrollaron baculovirus recombinantes conteniendo el cassette de expresión para EtHFB y para DomIIIHFB. Se estudió la expresión de las proteínas recombinantes en células de la línea Sf9 infectadas con los baculovirus. Si bien se esperaba encontrar las proteínas en el sobrenadante de cultivo, EtHFB fue completamente retenida en el interior celular, mientras que DomIIIHFB fue en parte liberada al medio extracelular. La extracción de EtHFB del interior celular requirió, al igual que lo sucedido en plantas, de la adición de SDS y DTT al buffer de extracción, hecho que imposibilitó su posterior purificación por ATPS. Se ensayó la purificación DomIIIHFB desde el sobrenadante de cultivo por ATPS utilizando tres concentraciones de Tritón X-114: 2, 5 y 8% y, si bien la proteína se concentró, el grado de pureza alcanzado fue del 20% en la mejor condición (2% de Tritón X-114). Por otro lado, se estudió la expresión de EtHFB y DomIIIHFB en larvas de Rachiplusia nu infectadas con los baculovirus recombinantes. En este sistema, se obtuvieron altos niveles de expresión para DomIIIHFB (4,5 mg/g de larva), pero no fue posible evidenciar la expresión de EtHFB. DomIIIHFB pudo ser extraída de las larvas con buffer PBS sin aditivos, lo que permitió estudiar su purificación por ATPS con Tritón X-114. Se ensayó la purificación a partir de extractos crudos de larvas, utilizando Tritón X-114 al 2, 5 y 8%. Se alcanzó una pureza superior al 80% al utilizar un 2% de Tritón X-114 (mejor condición) en un solo paso y con un rendimiento del 73%. La identidad de la proteína purificada fue confirmada por espectrometría de masa, por el análisis de los péptidos obtenidos luego de su digestión con tripsina. De esta manera, se logró obtener una plataforma de bajo costo para la producción de DomIIIHFB, basada en su producción en larvas de R. nu y su purificación por ATPS con Tritón X-114 al 2%. Con el antígeno así obtenido se desarrolló un enzimoinmunoensayo de tipo indirecto para la detección de inmunoglobulinas anti-dengue en suero de pacientes. Para ello, se estudió la inmovilización de DomIIIHFB en placas multipocillo, tanto hidrofílicas como hidrofóbicas, y se compararon los resultados con aquellos obtenidos inmovilizando DomIII (sin el tag de HFB). DomIIIHFB se inmovilizó eficientemente en ambos tipos de placas, mientras que DomIII sólo lo hizo en aquellas de tipo hidrofílico. Se seleccionaron las placas hidrofóbicas de poliestireno para el inmunoensayo, dado que son las más económicas. Se optimizó la inmovilización del antígeno en esta superficie y se determinó que con la cantidad de DomIIIHFB obtenida a partir de una larva, se pueden producir 22 placas de 96 pocillos sensibilizadas. En cuanto a la detección de inmunoglobulinas anti-dengue en el suero de pacientes infectados por el virus, se vio que el inmunoensayo desarrollado fue capaz de detectar sólo IgG anti-dengue serotipo 2 y no así de los otros serotipos. Además, no presentó inmunorreactividad cruzada cuando se ensayaron sueros de pacientes positivos para otros flavivirus (virus de la Fiebre amarilla y virus de la encefalitis de San Luis). Estos resultados si bien son preliminares, ya que se estudió un bajo número de sueros, son muy alentadores dado que permitirían disponer de un inmunoensayo para la serotipificación de una infección por el virus del dengue en la etapa de convalecencia, lo que en la actualidad se realiza por ensayos de neutralización, que son sumamente engorrosos y complejos y que sólo se encuentran disponibles en laboratorios de referencia.

Descripción: En trabajos previos hemos demostrado que la deficiencia moderada de zinc durante el desarrollo intrauterino y la vida posnatal temprana constituye un modelo de programación fetal de HTA y enfermedad cardiovascular y renal en ratas macho. El zinc es un micronutriente esencial de gran importancia biológica dadas sus propiedades antioxidantes, anti-apoptóticas, antiinflamatorias y estabilizantes de membranas. Se postula al SRA como uno de los candidatos involucrados en el desarrollo de la HTA y las enfermedades asociadas a la programación fetal. El objetivo de esta tesis doctoral fue evaluar la participación del SRA renal y cardiovascular en la fisiopatología de la programación fetal por deficiencia moderada de zinc, tanto en etapas tempranas del desarrollo como en la vida adulta de ratas machos y hembras. Nos propusimos también evaluar, en ratas macho adultas previamente expuestas a una deficiencia de zinc en diferentes momentos de la vida, el impacto de una infusión crónica de AngII sobre la PA y órganos relacionados como el corazón, el riñón y la aorta. Este estudio fue llevado a cabo en ratas Wistar preñadas. Recibieron dieta control (30 ppm de zinc) o baja en zinc (8 ppm de zinc) durante la preñez hasta el destete de las crías. Las crías fueron sacrificadas al día 6 de vida o continuaron con sus madres hasta el destete. Luego del destete, las crías de madres controles recibieron dieta control. Mientras que las crías de madres que recibieron dieta baja en zinc fueron alimentadas con dieta control o baja en zinc. A los días 36, 51, 66 y 81 de vida, se midió la PAS. Por otro lado, un grupo de crías macho de cada grupo experimental recibieron desde el día 68 de vida una infusión crónica de AngII o de SF y cada 3 días se registró la PAS. Todas las crías fueron sacrificadas a los 81 días de vida. Las ratas deficientes en zinc de ambos sexos presentaron menor peso corporal y renal a los 6 días. Sólo en las crías macho se acompañó de menor área de filtrado glomerular, mayor número de células apoptóticas y un desequilibrio en los componentes del SRA renal dado por un incremento de AngII, ECA, AT1 y AT2. En las ratas sometidas a restricción de zinc durante la gestación y la lactancia se observó, a los 81 días de vida, que los machos presentaron un incremento de la PAS mientras que en las ratas hembra los valores fueron normales. Las ratas de ambos sexos presentaron un menor peso corporal, así como también menor peso cardíaco y renal. La dieta con contenido adecuado de zinc posdestete no logró normalizar estos parámetros. Se encontraron alteraciones en el SRA tisular a los 81 días de vida. Evidenciamos un incremento en la rama presora del SRA, siendo más afectados los animales del grupo con restricción de zinc durante toda la vida. Estos presentaron aumento de la relación AngII/Ang-(1-7) y del contenido de AT1 en tejido renal y cardíaco. En el tejido cardíaco presentaron además incremento en la producción de anión superóxido inducido por NADPH-oxidasa. La dieta con contenido adecuado de zinc posdestete no logró prevenir estas alteraciones, ya que las crías con restricción de zinc solo durante la gestación y lactancia presentaron los mismos hallazgos en el tejido renal mientras que solo se observó un incremento de AT1 en el tejido cardíaco. En la aorta, las crías macho expuestas a deficiencia de zinc presentaron aumento de los receptores AT1. Sin embargo, se evidenció una menor respuesta vasoconstrictora a la AngII en anillos de aorta en las crías con restricción de zinc de ambos sexos. Las hembras fueron menos sensibles a esta injuria nutricional que a su vez presentaron un incremento en la rama vasodilatadora del tejido renal, dado por una menor relación AngII/Ang-(1-7) y el aumento de ECA2. Sólo las crías hembra con restricción de zinc durante toda la vida mostraron un aumento de la relación AngII/Ang-(1-7) en tejido cardíaco. Las crías macho expuestas a una infusión crónica de AngII durante la vida adulta presentaron un aumento de la PAS en todos los grupos, alcanzando las ratas expuestas a la restricción de zinc valores más elevados. A su vez se observó un incremento de los niveles de IL-6 y TNF-a en todos los tejidos evaluados, cambio que fue menos marcado en las ratas deficientes en zinc. La infusión con AngII incrementó el espesor media lumen de la aorta en todos los grupos, pero solo indujo cambios en el remodelado de las arterias renales y cardíacas en las crías que recibieron dieta control. Esto podría deberse a que la dieta deficiente en zinc per sé indujo un remodelado en estas arterias de resistencia y un aumento de las citoquinas inflamatorias, probablemente mediante la activación del SRA que hemos observado en estos animales. En este trabajo de tesis doctoral demostramos que una injuria nutricional por deficiencia moderada de zinc durante el desarrollo intrauterino y posnatal altera el equilibrio del SRA cardíaco y renal, principalmente en ratas macho. Las alteraciones del SRA se producen durante el desarrollo temprano y que no pueden ser prevenidas con el adecuado contenido de zinc en la dieta luego del destete. Este trabajo fortalece la importancia de optimizar la dieta durante el desarrollo intrauterino y posnatal temprano para evitar programar factores de riesgo cardiovasculares en la vida adulta.

Descripción: La terapia fotodinámica (TFD) es un tratamiento utilizado en oncología basado en el uso de una molécula, denominada fotosensibilizador (FS), que en presencia de luz y oxígeno genera especies citotóxicas que llevan a la destrucción del tumor. Con el propósito de evaluar la potencia antitumoral de una nueva ftalocianina lipofílica (Pc9), seleccionamos inicialmente un vehículo apropiado. La mayor potencia citotóxica se obtuvo cuando Pc9 fue incorporada en una micela de poloxamina (T1107). Investigamos luego la eficacia de la TFD con Pc9-T1107 en cultivos bi y tridimensionales de líneas de carcinoma colorrectal (CCR), y en un modelo in vivo. In vitro, demostramos que Pc9 media su efecto citotóxico a través de la generación de especies reactivas de oxígeno, la permeabilización de membranas lisosomales, inducción de estrés de retículo endoplásmico, despolarización de membranas mitocondriales y muerte celular apoptótica. También produjo arresto del ciclo celular e inducción de macroautofagia. In vivo, la TFD con Pc9-T1107 produjo un enlentecimiento en la progresión tumoral y un aumento en la sobrevida sin signos de toxicidad. En su conjunto, nuestros estudios permiten postular a Pc9-T1107 como un agente de interés terapéutico que podría, en un futuro cercano, ser utilizado para el tratamiento del CCR.

Descripción: Los hongos son organismos ubicuos, capaces de provocar enfermedades que afectan a la salud humana, animal y a los cultivos. Argentina por su extensión y características geográficas, posee gran diversidad de climas, considerándola como una gran fuente de recursos biológicos vinculados a la búsqueda de nuevos compuestos. El objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad antifúngica de los extractos metanólicos de: Parastrephia quadrangularis, Senna spectabilis var. spectabilis, Peltophorum dubium y Calycophyllum multiflorum, frente a cuatro hongos fitopatógenos: Fusarium verticillioides y F. gramineraum y Aspergillus parasiticus y A. flavus, asimismo, conocer su modo de acción y realizar una caracterización fitoquímica preliminar. Primero, se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de los extractos metanólicos. Luego, con los extractos activos (CMI < 500 ?g/ml) se realizaron diversas técnicas para constatar dicha actividad y el modo de acción. Finalmente, se sometieron a los extractos activos a métodos de purificación analizando las muestras activas por HPLC-UV y MS/MS. Por los resultados obtenidos, estaríamos frente a extractos activos cuya actividad es fungistática y además, que el compuesto principal presente en las muestras activas de P. quadrangularis es p-coumaroil-oxi-tremetona, en el caso de S. spectabilis la antraquinona Emodina, en cambio en referencia a P. dubium se detectó la presencia mayoritaria de flavonoides, del tipo flavonas y flavonoles.

Descripción: El incremento en la variabilidad de la presión arterial resulta un nuevo factor de riesgo para el desarrollo de daño de órgano blanco, por lo que su reducción debe considerarse una posible meta terapéutica del tratamiento antihipertensivo. Se determinaron los efectos de la administración oral crónica de atenolol, nebivolol, carvedilol o amlodipina sobre la variabilidad de la presión arterial de corto plazo y el daño de órgano blanco. Se incluyeron ratas espontáneamente hipertensas e hipertensas por la administración de L-NAME tratadas durante 8 semanas con una única administración diaria de atenolol, nebivolol, carvedilol, amlodipina o vehículo. Se determinó la presión arterial y su variabilidad de corto plazo. Se extrajo el ventrículo izquierdo y la aorta torácica para estudios histológicos y la determinación citoquinas proinflamatorias y profibróticas Aunque el tratamiento con ?-bloqueantes y amlodipina redujo la presión arterial sistólica, únicamente carvedilol, nebivolol y amlodipina disminuyeron su variabilidad de corto plazo. Además, nebivolol y carvedilol redujeron la fibrosis ventricular y aórtica, el espesor de la túnica media y el área de cardiomiocitos e indujeron una mayor reducción de la sobreexpresión de mediadores profibróticos y proinflamatorios en comparación con los animales tratados con vehículo o atenolol y de manera similar a la amlodipina. Estos hallazgos sugieren que la mayor reducción de la variabilidad de la presión arterial contribuiría en la superior protección del daño de órgano por nebivolol y carvedilol respecto de atenolol.

Descripción: La deficiencia en la producción y secreción de insulina determina el desarrollo de Diabetes Mellitus tipo 1 (DM1), de carácter autoinmune, y generalmente a edades tempranas. A diferencia de pacientes con DM2, pacientes con DM1 carecen de la alternativa de cambiar sus hábitos o disminuir sus niveles de glucemia a partir de fármacos, sino que la terapia habitual y segura hasta el momento es la administración diaria, y repetida durante el día, de insulinaexógena. Aún con los grandes avances en sus formas de administración y sus formulaciones, ésta es una terapia paliativa, que, como tal, no previene satisfactoriamente las complicaciones degenerativas a largo plazo. Por ello, es fundamental encontrar respuestas novedosas para el tratamiento de esta patología. Aquí proponemos al IMT504, un oligodeoxinucleótido sintético de secuencia definida, como una posible terapia alternativa, a partir del contundente efecto observado en la recuperación de animales diabéticos con compromiso del sistema inmune. Hemos demostrado que el oligodeoxinucleótido IMT504 mejoró el metabolismo glucídicoy restableció los islotes de Langerhans en la morfología, el número y el contenido de células beta dentro de los mismos. En lo que concierne al freno del ataque autoinmune, observamos que el IMT504 ejerce su conocido efecto inmunomodulador en estos modelos, disminuyendo la infiltración leucocitaria en los islotes.

Descripción: El síndrome metabólico (SM) aumenta el riesgo y la agresividad del cáncer de próstata (CaP). Cterminal binding protein 1 (CTBP1) es una proteína que conecta ambas enfermedades. Previamente, reportamos que CTBP1 regula la transcripción de aromatasa en xenotransplantes de CaP desarrollados en ratones con SM. En este trabajo, investigamos de que manera CTBP1 vincula el SM y el CaP. Encontramos que CTBP1 se une al promotor de aromatasa y reprime su expresión en células de CaP. Asimismo, el estradiol libera a CTBP1 del promotor de aromatasa, aumentando su transcripción e impactando sobre la proliferación de células de CaP. El silenciamiento de CTBP1 en xenotransplantes de CaP de ratones NSG con SM aumentó la expresión de aromatasa y el estradiol intratumoral. El SM indujo hipertrofia e inflamación del tejido adiposo (AT) y un aumento del estradiol sérico en ratones C57BL/6J. Además, el SM indujo un perfil de expresión de genes y miRNAs aberrante en los tumores prostáticos y en el AT. Más aún, el AT de ratones con SM indujo la proliferación de células de CaP en co-cultivos. Estos resultados describen un nuevo eje Estradiol/Aromatasa/CTBP1/miRNAs que explica, en parte, el mecanismo por el cual el SM aumenta el crecimiento tumoral prostático.

Descripción: El antiguo concepto que consideraba a las membranas biológicas como "centinelas estáticos" atribuyéndoles casi como única función la de actuar como simples barreras separando a las células de su entorno o la de limitar compartimientos celulares, ha cambiado radicalmente. Hoy se considera que las membranas biológicas desempeñan un papel dinámico estrechamente vinculado con el metabolismo celular. Este cambio de concepto se debe fundamentalmente al papel desempeñado por los "fosfolípidos". La estructura de las membranas biológicas consiste básicamente en una bicapa lipídica en cuya fluida matriz se encuentran inmersas distintos tipos de proteínas que le confieren a cada membrana su identidad característica. Los fosfolípidos -componentes lipídicos mayoritarios-, son los ladrillos estructurales de todas las membranas biológicas. Por su naturaleza química, determinan la estructura de la matriz de la bicapa lipídica y contribuyen a las propiedades fisicoquímicas de la misma. Pero además, son partícipes activos de numerosos eventos metabólicos claves para la vida celular, ya que, son cofactores necesarios para la activación y modulación de la actividad de numerosas proteínas asociadas a membrana -receptores, quinasas, proteínas del citoesqueleto, etc.- y son precursores de los segundos mensajeros celulares los cuales activan numerosos procesos metabólicos. Por lo tanto, la célula debe mantener intactas sus membranas para conservar su funcionalidad y para ello, en las membranas debe existir un adecuado "recambio fosfolipídico". El recambio fosfolipídico es un conjunto de procesos metabólicos, que, cuando un fosfolípido que forma parte de una biomembrana es degradado por acción de lipasas específicas, permite reemplazado rápidamente por una nueva molécula fosfolipídica. Uno de los pasos fundamentales del recambio fosfolipídico es la síntesis "de novo", cuya ruta bioquímica se ha descripto en detalle. Sin embargo, poco es lo que se conoce en la actualidad sobre los mecanismos involucrados en la regulación de dicha vía metabólica. Una de las señales propuestas como activadoras de la síntesis "de novo" de fosfolípidos, es la degradación de los mismos mediadas por fosfolipasas. La papila renal de rata es un tejido que tiene un activo metabolismo fosfolipídico en condiciones basales en contraposición con la escasa cantidad de membranas presentes en las células papilares. Además, posee una elevada capacidad de síntesis de prostaglandinas, aún en condiciones basales. Bradiquinina (BK) un nonapéptido que desencadena numerosos procesos relacionados con la fisiología renal, activa, en la papila renal, fosfolipasa C (PLC) y como consecuencia de ello se produce un aumento del Ca2+ intracelular y probable activación de PKC. Esta secuencia de eventos metabólicos llevan a la activación de fosfolipasa A2 (PLA2) y liberación de ácido araquidónico (AA), con la consecuente síntesis de prostaglandinas (PGs), que son los efectores finales de las funciones llevadas a cabo por las células de la papila renal. Este trabajo de Tesis Doctoral tuvo como objetivos -profundizar los conocimientos sobre la síntesis "de novo" de fosfolípidos en papila renal de rata y de los mecanismos implicados en su regulación -establecer la relación entre el activo metabolismo fosfolipídico y la fisiología de la papila renal. Para evaluar estos objetivos propusieron se estudió: 1-la síntesis "de novo" de fosfolípidos en papila renal en condiciones basales, utilizando como parámetro biosintético la incorporación de 32P. 2-el rol de PLC en la regulación de la síntesis "de novo" de fosfolípidos en condiciones basales, y en la posible participación de PKC. 3-el rol de las PGs renales, las cuales son un indicador indiscutible de la actividad de la fosfolipasa A2 en la papila renal, como reguladores de la síntesis "de novo"de fosfolípidos. 4-la participación de proteínas de recambio rápido como factores involucrados en la regulación de la biosíntesis de fosfolípidos. 5-la síntesis "de novo" de fosfolípidos en papila renal de rata en presencia de BK y determinando si en esta situación de estímulo fisiológico los mecanismos que regulan la síntesis de fosfolípidos son comparables a los estudiados en la condición basal. 6-a que nivel de la ruta biosintética se ejercen los mecanismos reguladores de la síntesis de fosfolípidos, determinando para ello la actividad de enzimas claves de la vía de Kennedy. Los resultados obtenidos y presentados en esta Tesis Doctoral permiten concluir que -El tono de síntesis "de novo" de fosfolípidos en papila tanto en condiciones basales como bajo el efecto de un estímulo fisiológico, es mantenido de manera importante por la vía que involucra la resíntesis de fosfolípidos, que asegura el recambio en las membranas de fosfolípidos pertenecientes a un "pool metabólicamente activo". -En condiciones basales, el tono del recambio fosfolipídico en las membranas de las células papilares es regulado por las prostaglandinas renales, productos finales de la acción degradativa iniciada por PLC. Las prostaglandinas renales implicadas en la regulación de la biosíntesis fosfolipídica son D2 y F2a, por lo cual se les asigna un nuevo rol cual es el de mantener la homeostasis de las membranas asegurando un efectivo recambio fosfolipídico. -En condiciones de estímulo fisiológico, el recambio fosfolipídico en las membranas de las células papilares, que asegura la homeostasis de la bicapa lipídica después de que la misma ha sido sometida a activos procesos de degradación por efecto de la acción hormonal, es iniciado por la acción de una PLC de características diferentes a la que actúa en ausencia del estímulo. -La regulación que opera sobre el proceso biosintético en presencia de BK implica necesariamente la acción de nuevas moléculas de proteínas.

Descripción: Las alteraciones en la excreción renal de sodio poseen vital importancia en la patogénesis de la hipertensión arterial (HTA), patología crónica de mayor prevalencia e incidencia mundial y causa principal de las patologías cardiovasculares. En este sentido, radica el interés de aportar conocimientos relacionados sobre las formas en que los factores natriuréticos y los antinatriuréticos pueden utilizar vías comunes que involucren de modo reversible la inhibición o activación de la Na+,K+?ATPasa tubular renal, enzima cuya alteración está íntimamente relacionada con la retención salina. Asimismo, la dopamina (DA) renal, el péptido natriurético atrial (ANP) y la angiotensina II (ANG II) son capaces de modificar el manejo renal del sodio (filtración, reabsorción y excreción) regulando diversos transportadores de sodio.nNuestro principal objetivo fue demostrar la hipótesis que parte de los efectos natriuréticos y diuréticos del ANP, y antinatriuréticos y antidiuréticos de la ANG II, se producirían de manera indirecta estimulando o inhibiendo, respectivamente, la captación de DA, regulando la expresión y/o funcionalidad de los transportadores de cationes orgánicos (OCTNs y OCTs), como también la captación renal del aminoácido L-dopa al regular la expresión y/o funcionalidad de los transportadores apicales de L-aminoácidos (LATs).nRatas macho Sprague Dawley anestesiadas, fueron infundidas durante 120 minutos con las drogas a testear, empleando solución salina isotónica como vehículo. Se llevaron a cabo cuatro protocolos experimentales in vivo en los que se evaluaron basalmente y pos-infusión a los 90 y 120 minutos, los efectos sobre los parámetros de excreción renal y hemodinámicos de los siguientes agentes: protocolo 1) ANP y la isocianina decynium-22 (D-22), inhibidor específico de los OCTs, en presencia de DA endógena; protocolo 2) ANP, DA exógena y D-22; protocolo 3) ANG II y D-22 en presencia de DA endógena; protocolo 4) ANG II, DA exógena y D-22. Cabe aclarar que en los protocolos 2 y 4, a las ratas se les administró benserazida, pargilina y tolcapone para inhibir el metabolismo de la DA. A las ratas que recibieron DA exógena se les determinó la concentración urinaria de DA. Luego del sacrificio de los animales se destinó un riñón para estudios de inmunoperoxidasa de los transportadores OCTNs y del receptor dopaminérgico subtipo D1 (D1R), y el otro para determinar en membrana aislada de las células tubulares, la actividad específica (AE) y la expresión de la bomba Na+,K+?ATPasa, y la expresión de su forma fosforilada en el residuo serina 23 (Pi), y la expresión del D1R, los OCTNs, OCTs y LATs. Por otro lado, se realizaron dos ensayos in vitro para evaluar los efectos del ANP y la ANG II sobre la captación de L-dopa, en ausencia y presencia del ácido aminobicicloheptano-2-carboxílico (BCH), inhibidor específico de los LATs.nEn el protocolo 1, el ANP incrementó significativamente los parámetros de excreción renal tanto a los 90 como 120 minutos con respecto a su valor basal y al grupo control. Por otro lado, la AE de la bomba Na+,K+?ATPasa y la Presión Arterial Media (PAM) se redujeron, sin afectar la Frecuencia Cardíaca (FC). El D-22 per se no mostró cambios en los parámetros de excreción renal ni hemodinámicos tanto en ausencia como en presencia del ANP. Si bien el ANP no modificó in vivo la expresión de los LATs respecto al control, sí aumentó in vitro la captación de L-dopa, y el BCH previno ese incremento.nAnte la infusión de DA exógena (protocolo 2), la adición del ANP mostró un incremento de la diuresis y natriuresis con respecto a la infusión de cada droga por separado. El ANP y la DA por separado redujeron la AE de la Na+,K+?ATPasa con respecto al control. La adición del ANP incrementó la concentración urinaria de DA respecto de la infusión de DA solamente. Todos estos efectos fueron prevenidos por el D-22. El ANP aumentó la expresión de la Na+,K+?ATPasa, disminuyendo el cociente Na+,K+?ATPasa-Pi, incrementó la inmunoexpresión del D1R y no mostró cambios en la expresión de los transportadores OCTNs y OCTs.nLos efectos in vivo de la infusión de ANG II en presencia de DA endógena (protocolo 3) fueron antagónicos a los del ANP. Al igual que el ANP, la ANG II no modificó in vivo la expresión de los LATs respecto al control, pero disminuyó in vitro la captación de L-dopa, efectos que no fueron evidenciados en presencia del BCH.nAnte la infusión de DA exógena (protocolo 4), la adición de la ANG II mostró una disminución del incremento de la diuresis y natriuresis DA-dependiente, efectos similares a los observados con la administración de D-22, y de ANG II acompañada de D-22. La ANG II y la DA por separado presentaron efectos opuestos sobre la AE de la bomba Na+,K+?ATPasa y al co-infundirlas, la AE de la bomba fue similar a los de las ratas controles. El D-22 previno los efectos de la DA exógena, al inhibir su captación mediante los OCTs. La adición de la ANG II disminuyó la concentración urinaria de DA respecto de la infusión de DA solamente, efectos favorecidos por el D-22. La ANG II no modificó la expresión de la Na+,K+?ATPasa, ni de su forma fosforilada, ni del D1R, OCTNs y OCTs.nLos resultados del presente trabajo de tesis muestran la clara interacción que presentan el ANP y la ANG II con el sistema dopaminérgico renal. Además, se confirma la importancia de la participación de los OCTs en los mecanismos de excreción de sodio, aportando nuevas evidencias al conocimiento de la fisiopatología de la HTA.

Descripción: Los tumores de cáncer de mama triple negativos (TNBC) expresan, respecto a los tejidos normales, mayores niveles de la enzima ACSL4, la cual promueve la agresividad tumoral incrementando la migración, proliferación e invasión celular. En este trabajo se clonó y caracterizó funcionalmente el promotor humano de ACSL4. Se demostró que el factor de transcripción Estrogen Related Receptor Alpha (ERR?) participa en la expresión diferencial de ACSL4 en líneas de cáncer de mama y que la inhibición conjunta de ACSL4 y ERR? reduce de manera sinérgica la proliferación celular. Se comprobó además que el receptor de estrógenos alfa (ER) regula negativamente la expresión de ACSL4. Estos hallazgos sugieren que ambos factores de trascripción regulan la expresión diferencial de ACSL4 en los distintos modelos de cáncer de mama y explican, al menos en parte, la sobreexpresión de esta enzima en tumores TNBC. Se analizó además la regulación y función de ACSL4 en un sistema neuroesteroidogénico, demostrando que en astrocitos de rata el AMPc promueve la inducción de ACSL4 y que ésta participa en la inducción de la proteína regulatoria StAR y en la producción de hormonas esteroides. Se comprobó también que ACSL4 modula la migración y proliferación de ese tipo celular.

Descripción: La enfermedad cardiovascular (ECV) continúa siendo la principal causa de muerte en elnmundo occidental siendo el infarto agudo de miocardio (IAM) su expresión más frecuente, generalmente precipitado por la ruptura de la placa aterosclerótica. En este evento juegan unnrol preponderante enzimas denominadas metaloproteasas (MMPs) que degradan la matriznextracelular. Si bien, los factores de riesgo tradicionales para el desarrollo de la ECV han sido ampliamente estudiados, en las últimas décadas la comunidad científica ha comenzado aninvestigar nuevos factores, tanto asociados (leptina y vitamina D) como emergentes (estrésncrónico).nNumerosos estudios epidemiológicos han encontrado que el estrés, asociado a factoresnpsicosociales, puede predecir el desarrollo y el pronóstico del IAM independientemente denfactores de riesgo típicos. No obstante, hasta el momento, el efecto de los factores psicosocialesnsobre la vulnerabilidad de la placa ha sido poco estudiado. Otro factor implicado en la relaciónndel estrés con la ECV es la carga alostática, sin embargo, pocos trabajos han abordado el estudionde la asociación entre ésta, los factores psicosociales y los marcadores de placa vulnerable.nEn este trabajo de Tesis se incluyeron 79 pacientes de ambos sexos que concurrieron alnHospital Argerich con diagnóstico de IAM de tipo 1 con elevación del segmento ST (IAMCEST)npara la realización de una angioplastia primaria. Para el estudio del cortisol en cabello, comonbiomarcador de estrés crónico, se incluyeron 27 pacientes de ambos sexos con las mismasncaracterísticas que los anteriormente citados. Como controles, se incluyeron 54 pacientes denambos sexos que concurrieron a los consultorios externos del Hospital.nEn los pacientes con IAM, pasadas 24 horas de la angioplastia y con el paciente en estadonlúcido se procedió a realizar 3 encuestas autoadministradas y validadas cuyo objetivo fuenevaluar estrés percibido, la hostilidad y soporte social. La evaluación de los factores psicosocialesnen los grupos controles se realizó en el consultorio del médico al momento de la anamnesis.nEn el grupo de pacientes sin IAM, luego de 12 horas de ayuno, se obtuvieron muestras densangre para las determinaciones en suero y en plasma. En el grupo IAM las muestras senobtuvieron al ingreso, luego de la angioplastia, a las 24 horas, a los 7 días y a los 3 meses. En suero se determinó la concentración de cortisol, perfil lipídico, PCR-us, IL-1?, leptina y vitamina D, entre otros. En plasma se determinó la actividad de MMP-2, MMP-9 por zimografía, y de susninhibidores (TIMP total) por zimografía reversa y la concentración de MMP-9. En una muestrande 3 cm de cabello obtenida del vertex posterior, se midió el cortisol en cabello por método automatizado. Diez indicadores fueron utilizados para el cálculo de la carga alostática.nA su vez, con el objetivo de evaluar el impacto del estrés crónico sobre la regulación de MMPs y TIMPs en el músculo cardíaco, se utilizaron ratones C57BL/6J de 6 semanas de edad,nbajo tratamiento con corticosterona durante 4 semanas.nEn el grupo de pacientes con IAM el porcentaje de individuos con alto score de hostilidad fue mayor que en el grupo sin IAM (52% vs 30% p=0,04). Se observó una correlación entre lanfracción de eyección y el soporte social (r=0,466 p=0,006). Los pacientes con 1 vaso afectado tuvieron un mayor score de soporte social (17 (2-20) vs 14 (4-18) score, p=0,05) y una mayor fracción de eyección (49 (27-69) vs 34 (30-37) %, p=0,03) que aquellos con 3 vasos afectados.nLos pacientes que 3 meses luego del evento presentaron niveles de Apo B por encima den90 mg/dl, tuvieron menor score de soporte social (14,5 (5-18) vs 17 (9-20) p=0,019). Además,nlos pacientes con score de soporte social por debajo de la mediana presentaron mayores nivelesnde PCR-us a los 7 días (27,8 (3,00-196) vs 11,3 (1,86-135) mg/l, p=0,03). Aquellos que luego denla angioplastia, no presentaron cambios o exhibieron un aumento del cortisol sérico presentaronnmayor soporte social los demás (16 (7-20) vs 14 (5-20) score) (p=0,03). La actividad de MMP-2nmostró una asociación directa con leptina (r=0,281 p=0,044) e inversa con vitamina D (r=-0,333np=0,036).nEl soporte social resulto ser un moderador en la relación entre la hostilidad y la actividad de MMP-2 en aquellos pacientes con score de soporte social igual o por debajo de la medianan(B=0,0104, DS= 0,042, p=0,0158, 95% IC ). Esto se verificó hasta las 24 horas luegondel IAM. Además, mediante un análisis de mediación moderada se verificó que el efecto de la hostilidad sobre el IAM estaría mediado por la actividad de MMP-2, pero únicamente cuando elnscore de soporte social de los pacientes fuera igual o menor a la mediana de la población.nEncontramos una asociación entre las concentraciones de IL-1? y MMP-9 (r=0,598 p=0,009) solo en los pacientes con score de hostilidad por encima de la mediana aun después de ajustar porndiversos factores. En el modelo animal, la actividad de MMP-9 en tejido cardíaco de los animales tratados fue significativamente mayor que en los controles, observándose lo inverso en la actividad de TIMP-3.nLa carga alostática resultó estar relacionada con el IAM independientemente de factores confusores (OR: 1,858 (95% CI: 1,420-2,431), p<0,001). Este score se relacionó de manerandirecta con la actividad de MMP-9 en los pacientes con IAM solo en aquellos pacientes que tuvieron una disminución del nivel sérico de cortisol luego de la angioplastia (r2=0,325, F=5,779, p=0,033). Finalmente, el 46% de los pacientes con IAM presentaron valores de cortisol en cabello por encima del valor de corte (128 pg/mg de cabello), versus 8% en el grupo sin IAM (Test Chi cuadrado: 8,99 p=0,003). Más aun, el cortisol en cabello resultó ser un predictor delnIAM (OR: 1,023 (95% CI: 1,007-1,040), p=0,005).nPor lo tanto, uno de los caminos esbozado en la presente tesis, es que el estrés cróniconasociado a factores psicosociales, desregula el eje HHA virando al sistema inmune hacia unnestado pro inflamatorio, lo cual conduce a un aumento en la actividad de MMPs lo que generaría una mayor degradación de la MEC, tornando a las placas ateroscleróticas más vulnerables.

Descripción: En el presente trabajo mostramos que la radiación con bajas dosis de luz ultravioleta (UV) provoca la acumulación de cortes en la doble cadena del ADN (DSBs, del inglés, double strand breaks), generados como consecuencia del colapso de horquillas de replicación activas. Si bien FANCD2, miembro central de la vía de Fanconi, no es esencial para la sobrevida celular frente a luz UV, es una proteína fundamental para prevenir el procesamiento aberrante de los DSBs generados por dicho agente genotóxico, promoviendo la reparación por recombinación homóloga y evitando la formación de micronúcleos y la fusión entre cromosomas. Por consiguiente, podemos decir que la función de FANCD2 no se restringe a la resolución de enlaces covalentes generados entre las cadenas opuestas del ADN sino que presenta un rol en la reparación de DSBs acoplados a una horquilla de replicación y generados como consecuencia de un amplio rango de estímulos genotóxicos.

Descripción: Las cepas diarreogénicas de Escherichia coli se consideran patógenos emergentes y los diferentes patotipos participaron de brotes de origen hídrico en distintas partes del mundo. Estos patotipos son los siguientes: E. coli enterotoxigénico (ETEC), E. coli enteropatogénico (EPEC), E. coli enteroinvasivo (EIEC), E. coli enteroagregativo (EAEC) y E. coli productor de toxina Shiga (STEC). El objetivo del trabajo fue detectar la presencia de E. coli diarreogénico en ambientes acuáticos de la Provincia del Chaco, mediante el reconocimiento de sus factores de virulencia, a través de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se analizaron 362 muestras de agua obtenidas de fuentes superficiales, subterráneas, aljibes, de red y bajadas de tanque. E. coli se recuperó en 184 muestras (50,8%). La caracterización de los aislamientos se realizó mediante la detección de genes de virulencia característicos de cada patotipo: ETEC (elt y est), EPEC (eae/bfp), EIEC (ipaH), EAEC (aggR) y STEC (stx). Sobre 150 muestras de fuentes superficiales estudiadas, en 111 (74%) se recuperaron cepas de E. coli. De ellas, 32 (29%) resultaron positivas para alguno de los genes estudiados. La prevalencia de cepas diarreogénicas sobre el total de muestras estudiadas fue del 21,3%. Los aislamientos clasificados como EAEC resultaron los más prevalentes (15,3%). La prevalencia de los caracterizados como ETEC fue del 4%, y de EPEC atípico del 2%. Se analizaron 187 muestras de agua de fuentes subterráneas y de 61 (32,6%) se recuperaron cepas de E. coli. En 19 (31%) de ellas se identificaron aislamientos portadores de genes de virulencia. La prevalencia de cepas diarreogénicas sobre el total de muestras estudiadas fue del 10,1%. Los aislamientos caracterizados como EAEC resultaron los más prevalentes (8,6%). También se recuperaron cepas caracterizadas como ETEC, EIEC y EPEC típico. La prevalencia de cada uno fue del 0,5%. No se encontró diferencia estadísticamente significativa en la presencia de cepas diarreogénicas de E. coli entre las fuentes superficiales y subterráneas. En 5/8 (62,5%) muestras de agua de aljibes, se detectó la presencia de E. coli. En 3 (60%) de estas muestras se detectó al patotipo EAEC. En el análisis de muestras de agua de red, 3/9 (33,3%) resultaron positivas para E. coli sin detectarse genes de virulencia. De las 8 muestras de bajadas de tanque, 4 resultaron positivas para E. coli y 2 se clasificaron como EAEC. La detección de los patotipos EPEC, ETEC y EAEC en fuentes de agua superficiales evidencia su vulnerabilidad a la contaminación, principalmente de origen antrópico, lo cual estaría relacionado con la falta de tratamiento de los efluentes cloacales, una debilidad en toda la Cuenca del Plata. Igual consideración puede hacerse con respecto a la detección de E. coli en fuentes subterráneas que pueden actuar como reservorio y vehículo de estas cepas, con el agravante de su no aptitud para el consumo humano. Cuando las cepas recuperadas poseen genes de virulencia, como en este caso, se enfatiza aún más el riesgo para salud de las personas que las consumen. El presenta trabajo constituye el primer aporte, en la provincia del Chaco, sobre la participación de las fuentes de agua en la cadena epidemiológica de estos patógenos. La detección de cuatro de los cinco patotipos estudiados, con EAEC como el prevalente y de carácter emergente en todo el mundo, evidencian el riesgo para la salud de las personas expuestas a las mismas ante los diferentes usos que se les puede dar: consumo, recreación, riego o fuente para potabilización.

Descripción: El objetivo de este trabajo fue determinar si las ¨Heat Shock Proteins¨ (HSP), controlan el daño renal funcional y morfológico en un reconocido modelo animal de diabetes tipo 2 (DMT2). Se utilizaron ratas ¨Zucker Diabetic Fatty¨ (ZDF) macho de 12-semanas y ratas control ?Zucker Lean? (LZR). Los animales recibieron agua y alimento estándar para rata, (ad libitum). Se evaluó en el tejido renal la inmunoexpresión de HSP70 y HSP27. Se analizaron marcadores de daño glomerular y túbulointersticial (estrés oxidativo, inflamación, estrés nitrosativo, depósito de grasa, apoptosis, fibrosis intersticial), daño podocítico, y las alteraciones ultraestructurales glomerulares mediante microscopia electrónica. Se correlacionó variables bioquímicas y marcadores histológicos de daño podocítico y expresión de HSPs en tejido renal. De los resultados obtenidos surge la conclusión que la expresión incrementada de HSP70 y HSP27 en riñón de ratas ZDF, si bien representa un mecanismo de reparación activado localmente en respuesta a un escenario metabólico adverso, su participación no logro modular la injuria ocasionada en el tejido renal de estos animales, mostrando un comportamiento insuficiente o al menos incompleto ante la magnitud del daño celular renal generado en este modelo experimental de DMT2.

Descripción: Las Porfirias son desórdenes metabólicos producidos por deficiencia en una de las enzimas de la biosíntesis del hemo. La Porfiria Cutánea Tardía (PCT), la más frecuente de todas las Porfirias, es consecuencia de una disminución en la actividad de la uroporfirinógeno decarboxilasa (URO-D) a nivel hepático (PCT-A) o en todos los órganos (PCT-H). La PCT-A es la más común (75 a 80%) de este tipo de Porfiria, la PCT-H es de herencia autosómica dominante y la URO-D tiene un valor de alrededor del 50% de actividad con respecto al valor normal. Cuando su carácter es homocigota o heterocigota compuesto se la conoce como Porfiria Hepato Eritropoyética (PHE). La PCT es una enfermedad de baja penetrancia, aparece en la adultez aproximadamente a los 40 años y la relación Hombre:Mujer es de 4:1. Hay diversos agentes que son capaces de desencadenarla como ser el alcohol, estrógenos, acumulación de hierro, hidrocarburos polihalogenados, nitrosaminas del humo del tabaco y virus hepatotrópicos. Nuestra hipótesis se basa en que la presencia de SNPs en los citocromos P450 (CYPs) jugaría un rol en el desencadenamiento de la Porfiria, aumentando la capacidad metabolizadora de los CYPs y generando metabolitos que inhibirían a la URO-D. El objetivo general fue aportar evidencias adicionales sobre las posibilidades de manifestación de la PCT y ampliar nuestro conocimiento sobre la participación del sistema CYP en la expresión clínica de esta enfermedad. Para cumplir nuestro objetivo se genotipificaron las variantes: CYP1A1 (*4 ó m4, *2C ó m2, *2A ó m1), CYP1A2 (*1F) y CYP2E1 (*5B y *7B), las cuales se seleccionaron en base a trabajos previos donde se reporta su relación con el desarrollo del cáncer, pero con respecto a la Porfiria los resultados son discordantes. En este contexto decidimos estudiar las frecuencias genotípicas y alélicas y su relación con esta enfermedad en la población Argentina. Se estudió la siguiente población: 36 pacientes PCT-H, 76 PCT-A y 89 controles. En todos los casos los individuos firmaron el consentimiento informado y se contó con la aprobación del Comité de Ética. Se utilizó la técnica de PCR-RFLP seguida por secuenciación cuando el patrón de bandas obtenidas no fue claro. Se estimaron las frecuencias genotípicas y alélicas por conteo directo para cada SNP. Los genotipos y alelos de riesgo se calcularon por métodos bioinformáticos a través del VCCStats usando los parámetros: Odd Ratio, intervalos de confianza y p de Fisher; sólo se informaron los resultados cuando las diferencias fueron estadísticamente significativas (pf<0,05). Para el estudio de haplotipos de riesgo se utilizaron 64 muestras de las 112 estudiadas: 24 Controles, 23 PCT-H y 17 PCT-A, utilizando el programa SNPStats. Con el programa SNP predict fue estimado el efecto del cambio de aminoácido en la estructura de la enzima y su rol en el desencadenamiento de la PCT. El CYP1A2*1F (C/A) es un caso atípico en el cual el alelo de referencia es el menos frecuente, la misma tendencia se observó en nuestra población. El genotipo que contiene el alelo A o el alelo A per se fue de riesgo para desencadenarla PCT. Los resultados para la variante CYP1A1*4 (C/A) en nuestra población arrojaron que la frecuencia del genotipo homocigota alternativo fue significativamente mayor en PCT-H que en controles; este genotipo fue inexistente en PCT-A. En la alélica la frecuencia de A fue mayor en hereditarios que en adquiridos. Para los grupos: PCT-H vs Control y PCT-A el genotipo A/A y el alelo A resultó ser de riesgo. Si bien no está claramente reportado el efecto de esta variante alternativa la misma sería un factor de riesgo para PCT-H. En el caso del CYP1A1*2C(A/G) en cuanto a las frecuencias genotípicas los perfiles fueron diferentes a los esperados En ambos casos el homocigota alternativo suele presentarse en baja proporción o ser inexistente. El genotipo que contiene el alelo G en heterocigosis resultó ser de riesgo para PCT-H vs PCT-A. Para el CYP1A1*2A(T/C), en PCT-H vs PCT-A el genotipo T/T se halló en mayor proporción en este primer grupo y para T/C la frecuencia fue mayor en este último. Nuestros resultados no arrojan asociación de riesgo significativa al contrastar porfíricos con controles y hereditarios con adquiridos. El estudio de haplotipos de riesgo arrojó diferencias significativas para PCT-H vs Control siendo en este orden m4-m2-m1-1A2:C-G-C-C. En el CYP2E1*5B (C/T) el alelo C fue el más frecuente, las frecuencias del homocigota de referencia fueron similares a las del heterocigota, no se encontró el homocigota alternativo. No hubo diferencias significativas en ninguno de los grupos contrastados para cada genotipo y alelo. En nuestra población no se halló ninguna asociación entre la variable alternativa y la PCT. Para el CYP2E1*7B (G/T) el alelo ancestral fue el de mayor frecuencia y cada variante tiene una frecuencia similar para los diferentes grupos. El alelo T en homocigosis está en una baja frecuencia. En nuestros resultados para PCT-H vs PCT-AG/T vs G/G dio asociación significativa de riesgo. En el estudio de haplotipos de riesgo para el CYP2E1 se observó que T-T era el haplotipo de riesgo para todos los grupos de PCTs contrastados con controles.

Descripción: ARNs no codificantes largos transcriptos a partir de los telómeros, conocidos como TERRA (telomeric repeat-containing RNA), se asocian a la estabilidad telomérica y genómica. Están aumentados en tejidos tumorales humanos y murinos, aunque poco se sabe sobre los mecanismos que subyacen dicho aumento y las funciones que cumplen. El estrés oxidativo daña biomoléculas y activa vías de señalización asociadas a la proliferación celular, angiogénesis, apoptosis y metástasis. Los telómeros son regiones del genoma especialmente susceptibles a sufrir daño oxidativo y se ha reportado que la inflamación crónica in vivo induce disfunción telomérica por sobreproducción de ROS vía COX-2, lo cual es revertido por tratamiento antiinflamatorio ó antioxidante. Consecuentemente, los objetivos de este trabajo de Tesis fueron caracterizar la expresión de los TERRA frente al estrés oxidativo, determinar los mecanismos involucrados y evaluar su relevancia en la progresión tumoral. Se observa que los TERRA se inducen a las 4 h de tratamiento con los agentes oxidantes H2O2, NaAsO2 ó butionina sulfoximina en células renales embrionarias humanas HEK-293T. El uso del antioxidante N-acetil-L-cisteína previene dicho aumento. Se ha demostrado que hay aumento de ROS en el tejido adiposo pardo de ratones expuestos al frío, pero no en el blanco. En el presente trabajo se reporta que los TERRA se inducen sólo en el tejido adiposo pardo de ratones C57BL/6J luego de 4h de ser expuestos al frío, siendo esta la primer evidencia experimental que los TERRA se inducen in vivo en una condición fisiológica que cursa con aumento de ROS. Por ChIP se evidenció que el H2O2 induce aumento de las marcas de histonas y proteínas asociadas a activa transcripción en la región subtelomérica de las HEK-293T, donde se hallan los promotores de los TERRA. Ensayos de RIP muestran que los TERRA interactúan con las proteínas HP1?/?, ambas reclutadas al subtelómero. Ensayos de inmunoprecipitación para estas proteínas sugieren que sólo HP1? interactúa con la maquinaria transcripcional. Se encuentra descripto que las proteínas del poro nuclear (Nups) se asocian a genes transcripcionalmente activos, desconociéndose los factores que median su interacción con la cromatina. En este trabajo se evidenciaron a las Nups presentes en complejo con HP1? y reclutadas al subtelómero tanto antes como después de la exposición al H2O2, sugiriendo que intervienen en la expresión de los TERRA por medio de HP1?. La inducción de los TERRA se revierte 1-2 h luego de haber quitado el H2O2 del medio de cultivo. Esta expresión dinámica de los TERRA sugiere que ejercen un rol protector. En línea con esta idea, se observa una rápida inducción de TERRAs frente a un segundo desafío con H2O2. Ensayos de ChIP sugieren que esto es posible gracias a que se conservan en la región subtelomérica las marcas epigenéticas que favorecen la transcripción luego de la primera exposición transitoria al H2O2, dejándolos ?preparados? para que sean transcriptos. H89, un inhibidor de la PKA, bloquea la inducción de los TERRA por exposición al H2O2, sugiriendo que PKA controla su expresión. El uso de drogas que alteran la estabilidad de los microtúbulos modula los niveles de los TERRA, al igual que ocurre cuando se cultivan células sobre superficies de diferente rigidez para modificar la disposición del citoesqueleto. También se observa modulación de TERRAs durante la miogénesis, proceso en el que hay una reorganización dramática del citoesqueleto. De hecho, los rearreglos del citoesqueleto en células NMuMG que atraviesan la transición epitelio-mesenquimal (TEM) por tratamiento con TGF?1, se asocian a inducción de TERRAs y a ausencia de respuesta al H2O2, tal como ocurre en las células de adenocarcinoma mamario T47D que presentan disfunción telomérica, evidenciado por microscopía confocal. En su conjunto, los resultados aportan evidencias que los TERRA se inducen por estrés oxidativo y durante la TEM, señalando su potencial utilidad como marcadores tempranos de progresión tumoral.

Descripción: Los hantavirus son virus zoonóticos emergentes pertenecientes al orden Bunyavirales. Se clasifican de modo genérico en hantavirus del Nuevo y del Viejo Mundo y provocan dos enfermedades agudas en humanos. Los primeros son responsables del Síndrome Pulmonar por Hantavirus (SPH) en América, mientras que los segundos causan Fiebre Hemorrágica con Síndrome Renal (FHSR), principalmente en Asia y Europa. Los representantes principales del SPH son el virus Andes (ANDV) y el Sin Nombre Virus (SNV), mientras que los hantavirus clásicos asociados a FHSR son los virus Hantaan (HTNV) y Puumala (PUUV). PUUV provoca una variante leve de FHSR que suele llamarse nefropatía epidémica (NE). La tasa de letalidad de la FHSR varía entre 0,4-15% según la especie infectante, rondando el 30% pero pudiendo alcanzar el 40% para SPH. Los hantavirus se transmiten al hombre por inhalación de partículas aerosolizadas provenientes de las excretas de los roedores, mientras que la transmisión interhumana está demostrada únicamente para ANDV. No existen tratamientos específicos ni vacunas aprobadas para estas enfermedades, pudiéndose optar únicamente por un tratamiento de soporte. El principal blanco de infección de estos virus son las células endoteliales de las microvasculaturas, encontrándose la sintomatología de las enfermedades asociadas a un aumento de permeabilidad vascular y una respuesta inflamatoria exacerbada. Poco se conoce aún sobre los mecanismos involucrados en la patogenia de estas enfermedades y, en particular, los linfocitos B (LB) han sido ampliamente desatendidos hasta el momento en dicho contexto. En por ello que el objetivo principal de este trabajo de tesis fue estudiar el rol de los LB humanos en las infecciones por hantavirus. El hallazgo de numerosos inmunoblastos en frotis sanguíneos de pacientes con SPH es de frecuente descripción, e incluso utilizado como herramienta diagnóstica. Sin embargo, hasta el momento no se había definido el linaje ni el posible rol de los mismos. En línea con esto, en este trabajo se encontró una respuesta de plasmoblastos (PB) masiva en sangre periférica de pacientes con SPH infectados con ANDV. Estos PB resultaron morfológicamente compatibles con los inmunoblastos mencionados. Presentaron además reactividad tanto contra antígenos virales como antígenos inespecíficos, sugiriendo una respuesta policlonal por activación bystander. Aún más, una proporción elevada de dichos PB eran IgA+, un fenotipo compatible con un origen en tejidos linfoides asociados a mucosas. Debido a que las células endoteliales de las microvasculaturas alveolares son el principal blanco de infección de los hantavirus, estos resultados sustentan la hipótesis de una respuesta de PB inducida en la vecindad del sitio de infección. Adicionalmente, se hallaron niveles elevados de numerosas citoquinas activadoras de LB en sueros de pacientes con SPH, entre ellas IL-6, IL-10 y BAFF, surgiendo su posible participación en una activación bystander de LB. En busca de explicaciones alternativas al origen de los PB polireactivos, y brindando una posible explicación causal para el riesgo aumentado de desarrollar linfomas tipo B en pacientes que sufrieron FHSR, como fuera descripto en el pasado, se comprobó que los LB son susceptibles de infección por hantavirus causantes tanto de SPH como FHSR. La capacidad infectiva y de producción de nuevos virus infectivos in vitro mostró variabilidad según la especie. Resulta interesante que tanto ANDV como HTNV fueron capaces de infectar LB, mientras que PUUV, causante de una variante leve de FHSR, no compartiese esa característica. Finalmente, analizando un posible rol del endotelio vascular en la activación de los LB, se demostró que células primarias endoteliales de la microvasculatura pulmonar (HMVEC-L) ii infectadas con hantavirus son capaces de activar a todos las subpoblaciones de LB y aumentar la sobrevida de los mismos a través de mediadores solubles secretados. Los sobrenadantes de HMVEC-L infectadas mostraron tendencia a niveles incrementados de IL-6 y BAFF, citoquinas de gran relevancia en la activación, diferenciación y supervivencia de los LB. En conclusión, hemos caracterizado por primera vez a los LB en pacientes con SPH, identificándolos como un nuevo blanco de infección de los hantavirus y comprobado que el endotelio infectado puede modularlos de manera indirecta. Este trabajo de tesis se constituye así, en el primero enfocado en el estudio de los LB en el contexto de una infección viral responsable de dos enfermedades emergentes, altamente letales y de gran relevancia a nivel regional y global.

Descripción: Mostramos en ratas de diferentes edades que las hormonas tiroideas (HT) modularían la actividad marcapasos mediante el sistema del óxido nítrico (NO) auricular, dicha regulación se llevaría a cabo mediante la vía del Akt sólo a edades perinatales. El hipertiroidismo incrementó la producción de NO ventricular, independiente de la vía Akt. Este incremento se acompañó de un remodelado cardíaco que fue diferente dependiendo del género y la edad. Por otro lado, las acciones de las HT sobre la actividad de la mtNOS dependen de la edad en la cual el desorden tiroide se instaura. Los cambios en la biodisponibilidad del NO mitocondrial modificarían la producción de ATP, y en consecuencia la actividad marcapasos y la función contráctil del miocardio. Estas acciones no estarían mediadas por la vía del Akt. Durante el estado hipovolémico, la hipotensión inmediata observada tempranamente fue independiente del sistema del NO y del estado tiroideo, pero dependiente de la edad. En la fase más tardía post-hemorragia el NO podría modular la presión arterial. La biodisponibilidad de NO indujo una activación dinámica y heterogénea de las isoformas de la NOS, independiente del estado tiroideo y de la edad.

Descripción: La Enfermedad de Alzheimer (EA), la ansiedad, la depresión y el dolor son patologías de alta prevalencia que disminuyen la calidad de vida y limitan la productividad de los individuos y constituyen un importante problema para la salud pública a nivel mundial. A pesar de la existencia de fármacos para el tratamiento de estas patologías, hay una necesidad clínica de hallar nuevos compuestos con menos efectos secundarios y más ventajas terapéuticas. Los productos naturales, entre los que se encuentran los flavonoides, son un importante reservorio para el descubrimiento de nuevos fármacos. Estos productos son capaces, entre otras acciones a nivel del Sistema Nervioso Central (SNC), de interactuar de manera directa y/o indirecta con los sistemas esenciales de neurotransmisión cerebral y de modular la actividad de diversas enzimas. Debido a su capacidad de actuar sobre múltiples blancos biológicos y/o en modelos animales involucrados en estas patologías, se postula que los flavonoides son compuestos eficaces para el tratamiento de estas enfermedades. El objetivo de este trabajo fue obtener derivados de flavonoides, del tipo chalcona y flavanona, para desarrollar fármacos más eficaces y/o con menos efectos secundarios que la terapéutica existente para la EA, la ansiedad, la depresión, el dolor y sus comorbilidades asociadas. Existen antecedentes en la literatura que describen diversos derivados de chalconas y flavanonas con actividad relacionada a las patologías en estudio. Teniendo en cuenta los requerimientos estructurales compartidos según los datos bibliográficos, se sintetizaron veintiún chalconas mediante condensación aldólica, y dos flavanonas, por bromación del núcleo flavanona o ciclación de la chalcona correspondiente, con altos rendimientos. Las chalconas obtenidas presentaron sustituciones en los anillos A, B o ambos anillos de su estructura (con grupos metoxilo (-OCH3), hidroxilo (-OH), nitro (-NO2), metilo (-CH3), amino (-NH2), flúor (-F) cloro (-Cl) y bromo (-Br) en distintas posiciones del anillo A y grupos dimetilamino (-N(CH3)2), nitro (-NO2), cloro (-Cl) y bromo (-Br) en distintas posiciones del anillo B). Se evaluó la capacidad de estos compuestos de inhibir la agregación del péptido beta amiloide (A?1-42) y la actividad de las enzimas acetilcolinesterasa murina (muAChE), butirilcolinesterasa humana (hBChE), monoaminooxidasa A y B humana (hMAO A y B) y de unirse a distintos receptores cerebrales por el desplazamiento de ligandos específicos marcados: FNZ (sitio de unión de las benzodiazepinas en el receptor GABAA (suv BDZ)), 8-OH-DPAT (serotonina 5-HT1A) y DAMGO (?-opioide). Trece chalconas presentaron actividad inhibitoria por la hMAO B (con CI50 < 10 ?M); tres presentaron actividad antiagregante del péptido A?1-42 (con un porcentaje de inhibición en la agregación > 40 % a 10 ?M); dos inhibieron a la muAChE (con CI50 < 10 ?M); nueve derivados mostraron afinidad por el receptor ?-opioide (con Ki < 30 ?M), siete compuestos por el su- BDZ (con Ki < 30 ?M) y solo dos chalconas presentaron afinidad por el receptor 5-HT1A (con Ki < 30 ?M). Los compuestos más activos fueron evaluados en modelos animales murinos relacionados con su efecto in vitro. Los resultados mostraron que: _ La 5?metil-2?-hidroxichalcona (9) (CI50 muAChE: 10.2 ± 1.7 ?M y CI50 hMAO B: 2.4 ± 0.5 ?M) y la 4?, 5?-dimetil-2?-hidroxichalcona (11) (CI50 muAChE: 6.9 ± 1.3 ?M, CI50 hMAO B: 0.2 ± 0.02 ?M y 41.4 ± 1.7 % de inhibición de la agregación A?1-42 a 10 ?M) no afectaron la memoria de trabajo evaluada en el ensayo de laberinto en Y, y no lograron revertir el deterioro cognitivo inducido por la escopolamina (modelo farmacológico de deterioro cognitivo relacionado a la EA). _El núcleo chalcona (1) (Ki 5-HT1A: 20.8 ± 1.5 ?M) presentó actividad símilantidepresiva en el ensayo de suspensión por la cola. _ La 5?metil-2?-hidroxichalcona (9) (Ki su-BDZ: 6.1 ± 1.5 ?M) reveló efectos ansiolíticos en el ensayo en cruz elevado, sin presentar los efectos adversos comunes de las benzodiacepinas, como sedación, miorrelajación y ataxia. _La 5?-cloro-2?-hidroxichalcona (6) y la 3-nitrochalcona (17) presentaron efectos antinociceptivos a nivel periférico. _La 5?-metil -2?- hidroxi-3?-nitrochalcona (12) (Ki ?-opioide: 13.5 ± 6.9 ?M) ejerció efectos antinociceptivos a nivel periférico y central (ensayo de contorsiones abdominales inducidas por el ácido acético y de la plancha caliente), sin presentar alteraciones de la coordinación motora ni efectos sedativos a las dosis evaluadas. Los estudios in vitro e in vivo (antagonismo) sugieren que esta acción estaría mediada por el receptor ?-opioide. _La 3,3-dibromoflavanona (Ki ?-opioide: 0.8 ± 0.3 ?M) mostró actividad antinociceptiva dosis dependiente, a nivel periférico y central, en modelos de nocicepción térmicos (ensayo de la plancha caliente) y químicos (ensayos de contorsiones abdominales y formalina), mediada por el receptor ?-opioide. Además, presentó efectos símilantidepresivos (ensayo de suspensión por la cola) en las mismas dosis en las que presentó antinocicepción. A diferencia de la droga de referencia morfina, no evidenció sedación, incoordinación motora, disminución de la motilidad gastrointestinal, tolerancia y dependencia, en las dosis ensayadas. Por lo tanto, las chalconas obtenidas representan estructuras prometedoras en la química medicinal con actividad sobre múltiples blancos biológicos y con diversos efectos in vivo. A su vez, la 3,3-dibromoflavanona surge como un derivado promisorio para el tratamiento del dolor, con la ventaja de presentar efectos símil-antidepresivos, comorbilidad asociada a esta patología, y sin producir los efectos adversos más comunes de la morfina. Estos resultados contribuyen al desarrollo de nuevas drogas derivadas de flavonoides con acción sobre el SNC, con el objetivo de obtener medicamentos efectivos, con menos efectos secundarios y más ventajas terapéuticas que los utilizados en la actualidad para el tratamiento de los trastornos mentales y el dolor.

Descripción: El sistema inmune es afectado por la malnutrición haciendo que aumente la susceptibilidad a las infecciones. La malnutrición y las infecciones por nematodes gatrointestinales son enfermedades crónicas que coexisten en individuos de países en desarrollo. Dentro de los diferentes tipos de malnutrición, las deficiencias calórico-proteica y proteica (DP) poseen efectos más generalizados. La trichinellosis es una zoonosis parasitaria endémica de nuestro país en la que anualmente se registran brotes epidémicos. El ciclo de vida de T. spiralis comienza cuando un hospedador ingiere carne con el estadio infectivo (larva muscular, LM). En el estómago son liberadas las LM y al llegar a intestino éstas mudan a vermes adultos (VA). Allí los VA copulan y permanecen hasta que son expulsados por el hospedador a través de la respuesta inmune de mucosas. Las VA hembras liberan al siguiente estadio, las larvas recién nacidas (LRN; desde el día 5 hasta el 13 post infección en el modelo murino). Una vez liberadas, las LRN pasan al sistema linfático y al torrente sanguíneo donde se diseminan por todo el organismo, pasando por diferentes órganos hasta alcanzar el músculo esquelético. Al llegar a su destino, cada una de ellas penetra una célula muscular y finalmente, se forma una cápsula de colágeno (quedando encapsulada). Los mecanismos inmunológicos esenciales de protección contra T. spiralis están dirigidos a nivel intestinal contra los VA y a nivel sistémico y tisular contra las LRN. El ataque inmunológico contra los VA se manifiesta por un rechazo acelerado en intestino. Las LRN son destruidas en presencia de leucocitos activados mediante el mecanismo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA). En simultáneo con la respuesta intestinal se produce una respuesta inflamatoria a nivel del parénquima pulmonar donde habría retención y destrucción de la LRN. El objetivo general de esta Tesis fue estudiar el efecto de la deficiencia proteica en la dieta a nivel inmunológico durante la infección con T. spiralis en un modelo experimental en ratas a partir del destete. En particular, se estudió la respuesta inmune en el intestino y en pulmón por ser órganos de importancia durante la respuesta inmune contra T. spiralis. Para ello, dos grupos de ratas de la cepa Wistar a partir del destete recibieron una dieta deficiente en proteína (DP) o dieta control (C). Luego de 10 días, un grupo de cada dieta se infectó por vía oral con 900 LM (grupos DPI y CI) y otros dos permanecieron sin infectar (grupos DPNI y CNI). A distintos tiempos post-infección (p.i.) se midieron parámetros nutricionales, parasitológicos e inmunológicos tanto en intestino como pulmón (órganos de importancia en el ciclo de T. spiralis). Con respecto a los parámetros nutricionales se observó que tanto el peso corporal como el consumo de dieta y proteínas fueron menores en el grupo DPI con respecto a CI. Incluso se observó un menor peso del grupo DPI con respecto a DPNI. En cuanto a la respuesta inmune tanto en intestino como en pulmón se observó que el número de células caliciformes, mastocitos, eosinófilos, células IgE+, entre otras, alcanzaron menores números en animales del grupo DPI con respecto a CI; habiendo inicialmente un retraso en el aumento de dichas poblaciones en el grupo DPI. Con respecto a los anticuerpos tanto específicos como totales, también se observaron menores niveles en el grupo DPI comparado con CI. Los niveles de interleuquinas en extractos de ambos órganos fueron menores en DPI, con la excepción de IL-12 en extractos pulmonares. Estudios histológicos en intestino mostraron la presencia del VA hasta el día 33 p.i. en el grupo DPI, cuando en el modelo murino se encuentran presentes hasta aproximandamente los 14 dias p.i. Teniendo en cuenta este resultado, se evaluó el índice de fecundidad de los VA hembras a diferentes días y se observó que en el grupo DPI los VA hembras liberan LRN en mayor cantidad y a mayores tiempos p.i. con respecto al grupo CI. Cuando se analizó la respuesta contra el estadio migrante (LRN) se observó que los sueros de CI y DPI tenían la misma capacidad de participación en el mecanismo de CCDA. En cuanto a la capacidad de CCDA de las células pulmonares, se observó que las del grupo DPI recién a los 13 días p.i. podían ejercer el efecto citotóxico (combinadas con un suero con alto título de anticuerpos anti-LRN), mientras que en el grupo CI tanto a los 6 como 13 días p.i. las células eran capaces de ejercer efecto citotóxico. El estudio de las suspensiones celulares mostró un menor porcentaje tanto de neutrófilos como de eosinófilos (células efectoras del CCDA) en DPI. Al evaluar la capacidad de mediar CCDA de los anticuerpos presentes en los extractos pulmonares, se observó una menor respuesta en el grupo DPI con respecto a CI. Finalmente, cuando se evaluó la combinatoria de extracto pulmonar con su respectiva suspensión celular para cada grupo no se observó CCDA en el grupo DPI mientras que en CI se observó tanto a los 6 como a los 13 días p.i. Finalmente, al evaluar la carga parasitaria final en músculo de ambos grupos, se observó que el grupo DPI tuvo una carga diez veces mayor a la del grupo CI. Teniendo en cuenta todos los resultados en la presente Tesis, se puede concluir que la deficiencia proteica disminuye la respuesta inmune contra T. spiralis, retrasando la expulsión de los VA del intestino, lo cual sumado al mayor índice de fecundidad y la menor respuesta contra la LRN en pulmón, culminaría con la mayor carga parasitaria final.

Descripción: En la presente tesis identificamos y caracterizamos un nuevo mecanismo regulatorio de la actividad neurotrófica en neuronas en desarrollo, como una vía para entender los mecanismos que subyacen a la homeostasis y la fisiología neuronal. Identificamos a la proteína Tetraspanina 1 (Tspan1) y demostramos que es un regulador crítico de la señalización de TrkA y la diferenciación neuronal inducida por NGF. Tspan1 se expresa en neuronas sensoriales del ganglio de la raíz dorsal (DRG) positivas para TrkA y la disminución de su expresión en estas, lleva a un crecimiento axonal empobrecido. Además, nuestros datos demuestran que Tspan1 interactúa específicamente in vivo e in vitro con la forma inmadura de TrkA localizada en el retículo endoplasmático. Finalmente, la caída de Tspan1 reduce los niveles de membrana de TrkA promoviendo su degradación a través de la vía autofagica/lisosomal. En su conjunto, nuestros datos establecen un nuevo rol homeostático de la proteína Tspan1, funcionando como un modulador de la proteostasis del receptor TrkA, coordinando su maduración, tráfico biosintético y degradación, y promoviendo de esta manera, la señalización de la neurotrofina NGF.

Descripción: En el presente trabajo se estudiaron distintos aspectos relacionados con la valorización de subproductos agroindustriales, en particular la cáscara de semilla de soja, mediante su utilización como materia prima para la obtención de enzimas de interés comercial. Para esto, se obtuvieron extractos de cáscara de semilla de soja según condiciones optimizadas, teniendo en cuenta variables cuyos costos no incidan fuertemente en el proceso y cuya materialización sea fácilmente reproducible. Luego de identificar en el extracto de cáscara de semilla de soja las proteínas/enzimas candidatas por proteómica shotgun, se obtuvieron miniesferas de quitosano, a las que se confirió resistencia mecánica adecuada por entrecruzamiento químico. Seguidamente las miniesferas de quitosano fueron derivatizadas o funcionalizadas con diferentes estrategias, en función de la estructura aminoacídica de la proteína a inmovilizar/purificar en cada caso. De esta manera se lograron sintetizar distintas matrices aplicables a la purificación de proteínas en modo batch, las cuales fueron ensayadas para la purificación y/o inmovilización de las siguientes proteínas de interés identificadas: peroxidasa, ureasa, inhibidores de tripsina, quitinasa y ?-amilasa.