Charif, Santiago Elias
2018-03-09

Temas:   Reproducción   -  VIZCACHA   -  FOTOPERIODO   -  REPRODUCCION   -  AMERICA DEL SUR   -  VIZCACHA   -  FOTOPERIODO   -  MELATONINA   -  REPRODUCCION

Descripción: El control estacional de la reproducción a través de la información fotoperiódica se basa en la melatonina como mensajero clave que actúa sobre los componentes del eje hipotalámicohipofisario- gonadal (H.H.G.). Esta hormona es producida en la glándula pineal por la enzima AANAT, y se une a los receptores MT1 y MT2 del hipotálamo, hipófisis y ovario, modulando la secreción de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH), la hormona luteinizante (LH) y los esteroides sexuales estradiol y progesterona, respectivamente. La vizcacha de las llanuras de Sudamérica (Lagostomus maximus) posee caracteres reproductivos únicos, como poliovulación natural de hasta 800 oocitos por ciclo estral, inhibición de la atresia folicular, una preñez prolongada con reabsorción embrionaria selectiva y reclutamiento folicular, y una pseudo-ovulación con generación de cuerpos lúteos accesorios durante la gestación. Presenta dos períodos reproductivos al año, siendo el que va de abril a agosto más eficiente que el que abarca de octubre a febrero. El objetivo de este trabajo fue estudiar la in?uencia del fotoperíodo sobre el funcionamiento del eje H.H.G. de la vizcacha. En primer lugar se determinó la secuencia del ARNm de la prepro-GnRH hipotalámica. Se encontraron dos isoformas que difieren únicamente en el largo de la secuencia 5?-UTR. La variante de GnRH determinada fue mGnRH, y presentó un alto grado de conservación entre caviomorfos emparentados, mientras que la secuencia del péptido asociado a GnRH (GAP) mostró alta una variabilidad. El análisis de la expresión del sistema melatoninérgico a lo largo del ciclo reproductivo de la vizcacha arrojó como resultado la co-localización de GnRH con ambos receptores de melatonina en núcleos hipotalámicos que controlan la reproducción, el área preóptica y los núcleos supraóptico y supraquiasmático. Además, se determinó un incremento de la expresión de AANAT y de los niveles de melatonina conforme progresa la gestación, y los menores niveles de MT1 y MT2 hipotalámicos se registraron en la etapa media de la preñez. Esto indicaría que el sistema melatoninérgico contribuye al mantenimiento de la extensa gestación de la vizcacha. El efecto de la disponibilidad lumínica se determinó en vizcachas en fase folicular y en fase lútea inducida. En el primer caso, la exposición contínua a la luz redujo los niveles séricos de melatonina pero incrementó la expresión de AANAT y en el ovario aumentó el número de folículos antrales y de cuerpos lúteos, los niveles de progesterona y la expresión de MT2, mientras que la oscuridad constante incrementó los niveles de GnRH y MT1, los niveles séricos de estradiol y la expresión de MT1 en el ovario. En animales en fase lútea, la luz incrementó los niveles de melatonina y de LH, mientras que la oscuridad estimuló la expresión de AANAT y del MT1 hipotalámico. Estos resultados indicarían que los desajustes fotoperiódicos y hormonales alteran la respuesta del hipotálamo, de la hipófisis y del ovario de manera diferencial en función de la etapa del ciclo estral. La expresión hipotalámica de los receptores de estrógenos ? (RE?) y ? (RE?) también varió con la disponibilidad lumínica; en animales en fase folicular se observó un incremento de los niveles de RE? con la luz y un aumento de RE? con la oscuridad. Por otro lado, en animales en fase lútea, la luz constante aumentó la expresión hipotalámica del RE?. En ensayos de pulsatilidad, se observó que la melatonina estimula la secreción de GnRH y de LH en hembras con ovulación inducida. Asimismo, se determinó el efecto inhibitorio del neuroestradiol sobre la secreción de GnRH, mientras que la incubación con melatonina revirtió ese efecto. Por otro lado, la incubación conjunta de melatonina con estradiol o con un agonista del RE? incrementó la liberación de GnRH, sugiriendo que la interacción de melatonina y estradiol resulta necesaria para la actividad del eje H.H.G. En conclusión, este es el primer trabajo que demuestra que en la vizcacha, la regulación de cada órgano a través de la información fotoperódica, así como su respuesta a la melatonina y el contexto hormonal del ciclo estral, confluyen en la modulación del eje reproductivo de manera de ajustar el inicio de la actividad del eje H.H.G. con la estación más favorable para la reproducción. Esta regulación particular, dependiente de la etapa del ciclo estral y de la disponibilidad lumínica, demuestra la relevancia de la información ambiental para llevar a cabo una gestación exitosa y remarca la importancia de esta especie como un valioso modelo de regulación neuroendócrina de la reproducción en mamíferos.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 161 h

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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Quintana, María Eugenia
2019-03-25

Descripción: El Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB) representa un importante desafío a nivel productivo debido a su carácter endémico a nivel mundial. La infección por el VDVB es altamente prevalente en la Argentina y provoca pérdidas económicas para la industria lechera y ganadera, asociadas mayormente a problemas reproductivos. La enfermedad provocada por el VDVB se presenta con una variada signología que puede ir desde un curso subclínico a cuadros agudos hemorrágicos cuyo desenlace suele ser fatal. A esto se suma el efecto inmunosupresor del VDVB que predispone a infecciones bacterianas y parasitarias que pueden comprometer la vida del animal. El VDVB pertenece a la familia Flaviviridae, género Pestivirus y está representado por 3 genotipos: VDVB-1, VDVB-2 y VDVB-3 o ?Virus HoBi-like?. A su vez, este agente puede ser clasificado según su biotipo en citopático (CP) y no citopático (NCP). Una característica fundamental del VDVB es su capacidad de generar infecciones persistentes. El nacimiento de animales persistentemente infectados (PI) tiene lugar cuando las hembras preñadas se infectan con una cepa NCP del VDVB entre los días 30 y 150 de gestación. Estos individuos no son capaces de montar una respuesta inmune y eliminan grandes cantidades de virus en todas las excreciones y secreciones. Actualmente se proponen dos medidas principales para el control de la enfermedad: la detección y eliminación de animales PI, y la posterior vacunación de todo el rodeo no PI. La primera medida es recibida con fuerte resistencia por parte de los productores. Por otro lado, la inmunidad que confieren las vacunas que se encuentran en el mercado requiere más de dos semanas para desarrollarse e incluso de más de una dosis, siendo dudosa su eficacia en presencia de inmunidad materna. A estos inconvenientes se suma que la mayoría de las formulaciones comerciales no brindan cobertura contra todas las cepas del virus que circulan en el campo. Para complementar el conjunto de herramientas para el control del VDVB se precisan antivirales que puedan prevenir la dispersión viral y evitar la inmunosupresión. Los antivirales podrían utilizarse en casos de brotes o como preventivo antes de ciertas maniobras como el transporte, encierro, inseminaciones, introducción de nuevos animales, etc. En este trabajo proponemos el uso de Interferones (IFNs) ya que son antivirales naturales, de sencilla producción y amplio espectro. En contraste con la respuesta inmune adaptativa, los mecanismos innatos de defensa inmune mediados por los IFNs son inmediatos, y resultan operativos incluso en las primeras etapas de desarrollo intrauterino. La administración de IFNs como agentes bioterapéuticos es una medida efectiva para el tratamiento de varias infecciones virales. Tradicionalmente, en terapias desarrolladas para humanos, se ha utilizado el IFN de tipo I (IFN-?). Este está siendo actualmente reemplazado, dada su toxicidad hematológica, por el IFN de tipo III (IFN-?). El efecto antiviral de esta última citoquina es idéntico al del IFN-? pero localizado en epitelios, principalmente en mucosas, sin efecto sobre las células sanguíneas. La familia del IFN-? se encuentra conservada en bovinos y el tratamiento con IFN-?3 ha mostrado ser eficaz en controlar la infección oronasal por el virus de la fiebre aftosa (VFA). No se ha estudiado la aplicación terapéutica ni la funcionalidad del IFN-?3 contra otros virus que afectan la producción ganadera. Este trabajo plantea las siguientes hipótesis: ?El IFN-?3 bovino posee actividad antiviral contra el VDVB?; y ?El IFN-?3 bovino recombinante es un candidato para ser utilizado como bioterapéutico en infecciones con el VDVB?. Para contrastar estas hipótesis, hemos clonado y expresado el IFN-?3 y el IFN-? bovinos en células de mamífero en cultivo y evaluamos su actividad antiviral frente a distintas cepas del VDVB tanto in vitro como in vivo para comprobar su potencial uso como bioterapéutico en bovinos. Los IFN recombinantes (IFNr) producidos en sobrenadantes de células HEK293T transfectadas fueron cuantificados en función a las unidades activas determinadas sobre un virus de referencia y utilizando un ensayo reportero de actividad basado en células de riñón bovino Madin-Darby T2 (MDBK-T2) transfectadas en forma estable con el promotor del gen Mx río arriba del ORF para la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Para establecer la sensibilidad de cepas de campo y de referencia del VDVB a los IFNr, desarrollamos una técnica de alto rendimiento aplicable a cepas CP y NPC. Se trata de un ELISA en células que permite la medición directa de la infección detectando una proteína no estructural del virus en microplacas de cultivo celular, sin necesidad de cosechar las células. Utilizando este ensayo estimamos la concentración inhibitoria 50% para cada IFNr utilizando seis cepas de VDVB de diferente biotipo y genotipo, verificando que las cepas CP son más susceptibles a ambos IFNr que las NCP y, particularmente, las cepas NCP de tipo 2 resultaron más sensibles al IFN-?. La actividad de los IFNr fue evaluada luego in vivo, en un modelo murino de virulencia desarrollado en nuestro laboratorio, en el que ratones de la cepa BALB/c infectados con cepas del tipo 2 del VDVB desarrollan viremia a los 4 ó 7 días post infección (dpi), según la virulencia de la cepa. La cepa de alta virulencia suprimió además la respuesta proinflamatoria en estos animales. A juzgar por nuestros resultados, el tratamiento de los ratones infectados con la cepa 98-124 (de baja virulencia) con IFNr murinos comerciales mostró que el IFN-? fue más eficiente en prevenir la infección mientras que el IFN-? evitó la viremia. Experimentos de tratamiento combinado con dos dosis de IFN pre y post infección, combinando el uso de ambos IFNs, reveló que el tratamiento con IFN-? antes de la infección seguido luego por IFN-? fue efectivo en controlar la viremia en los ratones. Además, el tratamiento pre y post-infección con IFN-? resultaba igualmente protector. La limitación de la replicación del VDVB se verificó además por la ausencia de TNF-? sistémico. Estos resultados entonces indicaron que el IFN-? resultaba efectivo contra el VDVB in vivo, y que no era necesario combinarlo con IFN-?. Para evaluar el uso de nuestros IFNr en bovinos establecimos primero la inocuidad de los mismos sobre células sanguíneas bovinas (ex vivo) donde ambos IFNs mostraron ser seguros a las dosis de uso propuestas, a pesar de que el IFN-? causó apoptosis de células inmunes bovinas a dosis altas. La determinación de la inocuidad posológica se realizó directamente en los animales mediante el control de parámetros hematológicos durante 14 días post-inoculación, revelando la ausencia de toxicidad con las diferentes dosis de IFN?r evaluadas. A partir de estos resultados se realizó una prueba de concepto en terneros para evaluar la factibilidad de la utilización de IFN-?r frente a la infección con una cepa de baja virulencia aislada en la provincia de Buenos Aires, del genotipo 2 y biotipo NCP, ampliamente caracterizada en nuestro laboratorio. Se seleccionaron para el estudio 6 terneras libres del VDVB, que fueron infectadas con la cepa antedicha. Cuatro de ellas fueron inoculadas por vía sub-cutánea con dos dosis de IFN-?r dos días previos a la infección y dos días posteriores a la misma, mientras que las otras dos terneras recibieron tratamiento placebo (medio de dilución). Los animales infectados-no tratados desarrollaron enfermedad clínica con síntomas respiratorios entre los 2 a 4 días post-infección, detectándose también viremia y excreción viral a través de secreciones nasales. Los animales del grupo tratado con IFN-?r no desarrollaron enfermedad ni presentaron signos clínicos. En tres de ellos no de detectó viremia ni excreción viral nasal. Un individuo de este último grupo presentó viremia y excreción viral pero con valores menores a los del grupo no tratado. Hemos desarrollado un antiviral seguro y eficaz, IFN-?3 bovino recombinante, demostrando la factibilidad de su potencial utilización para la prevención y el tratamiento de las infecciones por el VDVB. Comprobamos el efecto antiviral del IFN-?r sobre cepas de campo y de referencia in vitro, como así también su inocuidad y eficacia en bovinos contra una cepa de campo Argentina del genotipo 2, biotipo NCP. Además, establecimos un modelo ratón de viremia por el VDVB, de gran utilidad para los estudios in vivo con este virus. Desarrollamos una técnica novedosa, que consiste en un ELISA en células que utiliza un anticuerpo detector contra una proteína conservada no estructural que puede ser potencialmente aplicable para medir con precisión la infectividad de cualquier cepa viral, independientemente de su capacidad de causar la muerte de células en cultivo. Este trabajo constituye la primera evidencia experimental del potencial bioterapéutico del IFN-? bovino contra el VDVB in vivo, abriendo una nueva perspectiva enfocada en el uso de antivirales biológicos económicos, biodegradables y seguros para reducir la incidencia de las infecciones virales en animales en ámbitos productivos. La aplicación de esta herramienta podría impactar indirectamente en la disminución del uso de antibióticos al decrecer la tasa de infecciones bacterianas que devienen de las infecciones virales inmunosupresoras.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 143 p.

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Lomónaco, Marina
2018-04-19

Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: unknown  (tamaño kb)  Pag. 86 h.

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Dibárbora, Marina
2016-03-28

Descripción: La infección por Influenza A virus (IAV) es considerada una de las principales causas de enfermedad respiratoria en cerdos. Además, su carácter zoonótico representa un riesgo para la salud pública. En Argentina, si bien existían reportes de presencia de anticuerpos, el primer aislamiento de IAV en cerdos fue en el año 2008, de un subtipo H3N2 completamente humano. Luego, asociado a la pandemia humana del año 2009, se aisló un subtipo H1N1 pandémico (H1N1pdm09) y se reportaron múltiples cuadros clínicos relacionados a este virus. Es por ello que el objetivo general de este trabajo fue caracterizar las cepas de IAV circulantes en cerdos en Argentina y la forma de presentación de dicha infección. Se realizaron estudios clínicos, patológicos, serológicos y virológicos en nueve granjas intensivas porcinas. Los resultados demostraron una presentación clínico-epidemiológica endémica en 8 granjas en animales de entre 21 y 50 días. Desde el punto de vista anatomopatológico, el diagnóstico más frecuente fue la bronconeumonía supurativa con bronquiolitis necrotizante. Los estudios serológicos evidenciaron dos patrones. En uno de ellos se observó una caída de los anticuerpos calostrales entre los 21 y 49 días y un posterior aumento marcado en el porcentaje de animales seropositivos (20 a 80%), lo cual se asoció con una circulación activa del virus. En cambio, en el otro patrón, observado en dos granjas, se detectó un bajo porcentaje de animales seropositivos en reproductores, menos del 50%, y en la línea de producción, el mayor porcentaje de cerdos positivos fue del 20%, lo cual es sugerente de una infección endémica con baja circulación del virus. Los resultados de los ensayos de Inhibición de la Hemoaglutinación detectaron anticuerpos contra H1pdm09, ?H1 y H3 en todas las granjas y en el 75% de los animales presencia de anticuerpos contra más de un subtipo. Se detectó, mediante rRT-PCR, IAV en 7 granjas, la mayoría entre los 21 y 50 días de vida, y se obtuvieron 5 aislamientos, 4 fueron caracterizados como subtipo H1N1pmd09 y uno como subtipo H3N2. Se realizaron además, estudios clínicos y virológicos en 12 granjas intensivas que reportaron cuadros compatibles con infección por IAV. La inspección clínica determinó, en 8 granjas, el cuadro clínico endémico y en 4 granjas se observó la forma epidémica. La edad de presentación de los signos clínicos fue variable, siendo los animales de postdestete los más afectados (30 a 40 días). Todas las granjas evaluadas fueron positivas por rRT-PCR y la edad de detección del virus coincidió con la edad de presentación de los signos clínicos. Se obtuvieron un total de 13 aislamientos de IAV, H1N1pdm09 (7), H1N2 ?2 (3) y H3N2 cluster II (3). Se evaluó la circulación de IAV en pequeños productores y productores familiares. Se tomaron muestras de 57 establecimientos de distintas regiones del país. Los estudios serológicos detectaron la presencia de anticuerpos contra H1pdm09 en más del 60% de los establecimientos y en el 40% de los animales, mientras que menos del 17% de los establecimientos y del 2% de los animales fueron positivos para el subtipo H3. Se realizó el diagnóstico y la caracterización de IAV a partir de muestras enviadas al Laboratorio de Aves y Porcinos, CICVyA, INTA. Se recibieron muestras de 51 establecimientos, de 10 provincias y se obtuvieron 27 aislamientos. El 70% de los subtipos aislados fueron caracterizados como H1N1pdm09. También se obtuvieron aislamientos de los subtipos ?2 H1N2; ?2 H1N1; ?1 H1N1 y H3N2. El análisis filogenético del total de los aislamientos (N=45), mostró un predominio en la circulación del subtipo H1N1pdm09. Solamente 5 aislamientos se caracterizaron como subtipo H3N2 cluster II, 8 aislamientos como ?2 H1N2, un único aislamiento como subtipo ?2 H1N1 y el restante como subtipo ?1 H1N2. Todos ellos poseen gen M pandémico y genes externos de IAV humanos estacionales. Se identificaron 9 introducciones de IAV de humanos a cerdos, 7 relacionadas con la pandemia H1N1 del año 2009 y 2 con IAV humanos estacionales H3 y H1, circulantes más de una década atrás. Los estudios de cartografía antigénica demostraron que, a pesar de la similitud a nivel genético en los virus detectados en el país, las diferencias antigénicas son marcadas. La infección por IAV se encuentra ampliamente diseminada en cerdos de nuestro país. En la mayoría de las granjas evaluadas se observó la presentación endémica (subclínica). Estos resultados alertan sobre la posible generación de virus reasortantes y la presencia de un porcentaje variable de animales sin anticuerpos contra IAV que permitirían la persistencia de la infección. La totalidad de los subtipos de IAV circulantes en cerdos en Argentina corresponde a introducciones de virus de origen humano, en algunos casos relacionados con cepas circulantes más de una década atrás. Esto resalta la importancia del hombre en la epidemiología de IAV en cerdos en nuestro país y supone un riesgo para la población humana por la posibilidad de reintroducciones. La información generada en este estudio muestra que los subtipos circulantes en el país no se corresponden con los reportados en Norteamérica y Eurasia. Este hecho, sumado a la alta variación antigénica observada y a la rápida evolución de IAV, alerta sobre la necesidad de desarrollo de inmunógenos locales y ensayos diagnósticos que permitan el correcto control de IAV en las explotaciones porcinas de nuestro país.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 105 h.

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Ramos, María Laura
2017-04-10

Descripción: El crecimiento demográfico y la creciente demanda de alimentos de origen animal han originado una intensificación de los sistemas de producción ganadera. La aplicación de excretas de feedlot como fertilizantes a suelos agrícolas es una fuente relevante de incorporación de metales al suelo, debido principalmente a la suplementación mineral en las raciones de los animales engordados en confinamiento. En los sistemas pastoriles de producción ganadera, los proveedores naturales de minerales son las pasturas y el agua de bebida. Por lo tanto, la fertilización de los forrajes que consumen los bovinos con enmiendas orgánicas ricas en elementos traza, se presenta como una alternativa a la suplementación animal de minerales usualmente realizada vía sistémica. El objetivo general del presente trabajo de Tesis Doctoral ha sido evaluar el enriquecimiento de forrajes destinados a rumiantes con micronutrientes mediante la aplicación de enmiendas orgánicas y su absorción a nivel ruminal. Los contenidos del trabajo de tesis incluyen: a) Micronutrientes en excretas de sistemas intensivo de engorde bovino. En este Capítulo se evaluó en primer lugar, la evolución de la ganadería hacia la intensificación de sistemas ganaderos. Posteriormente se analizaron características generales de los sistemas intensivos de producción, producción de excretas y análisis de su composición, haciendo énfasis en el contenido total y biodisponibilidad de micronutrientes (Cu, Zn, Co y Mo). b) Carencia de micronutrientes en sistemas extensivos de ganadería bovina. En este Capítulo se realizó una revisión de los factores determinantes de carencias minerales y una descripción de los cuadros carenciales de presentación frecuente en nuestro país. Así mismo, se evaluó el contenido total y la biodisponibilidad de micronutrientes (Cu, Zn, Co, Mo y Se) en suelos de la provincia de Buenos Aires donde fue reportada la carencia. c) Enriquecimiento de forrajes con micronutrientes: prueba preliminar de fertilización en microcosmos y ensayo en parcelas. En estos capítulos, se presentan ensayos de fertilización, donde se utilizan excretas provenientes de sistemas intensivos de producción, ricas en micronutrientes (Cu y Zn), como enmiendas orgánicas. d) Metabolismo de micronutrientes en rumiantes. En este Capítulo se evalúa la liberación en rumen de elementos minerales (Cu y Zn), a partir de mezclas forrajeras con y sin tratamiento de fertilización con micronutrientes. Los resultados obtenidos a partir de los estudios realizados permiten concluir: - Las excretas provenientes de sistemas intensivos de producción bovina, presentan altos contenidos totales de Cu y Zn provenientes de la dieta. A partir del fraccionamiento secuencial de las mismas; se determinó un mayor porcentaje de fracción soluble o intercambiable de elementos traza respecto de excretas provenientes de sistemas extensivos de producción sin suplementación mineral. - Las muestras de suelos analizadas, presentaron valores de concentración total Cu, Zn y Se cercanos al límite inferior del rango considerado normal para suelos agrícolas, perteneciendo las mismas a zonas de la Región Pampeana donde se reportó la carencia de dichos minerales. Así mismo, a partir del fraccionamiento secuencial, se determinó que las muestras de suelo analizadas presentaron baja disponibilidad de Cu, Co y Mo; mientras que para Zn la biodisponibilidad vario considerablemente entre las distintas muestras.- A partir de la prueba preliminar de fertilización en macetas, se obtuvieron respuestas positivas al agregado de excretas como enmiendas orgánicas, habiéndose observado un incremento en el porcentaje de materia seca determinada por maceta, y una mejora en los parámetros de crecimientos de las especies forrajeras utilizadas (raigrás perenne y trébol blanco). - La incorporación de excretas provenientes de sistemas intensivo de producción, permite incrementar las concentraciones de Cu y Zn en la biomasa foliar de las especies forrajeras analizadas, 30 días post siembra de las mismas. Esta mayor asimilación de dichos metales traza, se ve favorecido por el mayor contenido total y mayor porcentaje de fracción soluble de dichos metales traza, aportado por las excretas a los suelos. - A partir de los resultados obtenidos del ensayo de fertilización en parcelas, se pudo corroborar el enriquecimiento de Cu y Zn en forrajes implantados a partir del agregado de excretas intensivas a los 30 días post aplicación de las mismas.- Así mismo, se obtuvieron mejores respuestas a la fertilización con enmiendas orgánicas respecto al uso de fertilizantes inorgánicos (CuSO4 ? ZnSO4), independientemente de la dosis utilizada. - La aplicación de excretas provenientes de sistemas intensivos a los suelos como fertilizantes, promueve un efecto sobre la movilidad y liberación gradual de elementos traza desde fracciones menos disponibles para las plantas (como las fracción unida a materia orgánica e fracción inorgánica) obtenidas por fraccionamiento secuencial. - La forma de aplicación, dosis y persistencias de sulfato de Cu y sulfato de Zn en los suelos luego de su aplicación, son factores que condicionan incorporación de dichos elementos trazas a los forrajes. - Las concentraciones determinadas de Cu y Zn en las muestras de forrajes obtenidas en las experiencias en parcelas 30 post aplicación de los diferentes tratamientos de fertilización, permitirían cubrir los requerimientos de dichos micronutrientes en bovinos de carne, debiendo también considerarse factores del animal y del alimento. - A tiempos de cosecha más tardíos (90 días pos aplicación de los tratamientos), se obtuvieron respuestas variables a la aplicación de enmiendas orgánicas y fuentes inorgánicas de fertilización. - La dinámica de crecimiento de las especies forrajeras, el envejecimiento de los tejidos de las plantas y la defoliación pueden explicar las menores concentraciones de Cu y Zn en la biomasa foliar a tiempos más tardíos de cosecha independientemente del tratamiento de fertilización aplicado. - La incubación ruminal de forrajes frescos (enriquecidos en Cu y Zn, y sin fertilización) mostró altos porcentajes de degradabilidad de la materia seca total acompañado por altos porcentajes de liberación de Cu y Zn al medio ruminal a tiempos cortos de incubación (3 ? 9 horas). El secado en estufa de las muestras de forraje disminuye la degradabilidad de la materia seca incubada afectando la disponibilidad posterior de nutrientes contenidos en el alimento. La aplicación de excretas provenientes de sistemas intensivos de producción bovina como fertilizantes, favorece la incorporación de Cu y Zn en especies forrajeras debido principalmente a los mayores contenidos y aporte de formas biodisponibles de dichos metales a los suelos. De esta forma, la reutilización de dichas enmiendas orgánicas disminuye el peligro potencial de contaminación ambiental a partir del excedente de micronutrientes eliminados en excretas; como así también permite compensar carencias de Cu y Zn en zonas de cría de ganado vacuno. El aporte de micronutrientes a partir de los forrajes, permite cubrir los requerimientos minerales del ganado vacuno; hecho favorecido por la alta tasa de liberación ruminal de elementos traza a partir de los mismos.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 246 p.

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Moro, Lucía N.
2015-03-17

Descripción: La extinción de especies animales es una de las consecuencias más alarmantes provocada por el deterioro ambiental y nos priva, de manera irreversible, de un material genético único e irremplazable. La Familia Felidae no escapa a esta problemática y es por este motivo que las biotecnologías reproductivas se convierten en herramientas muy poderosas para la conservación de estas especies. La hipótesis de la presente tesis doctoral radica en que es posible utilizar ovocitos u ovoplastos de gata doméstica (Gd) para desarrollar técnicas reproductivas aplicables a felinos silvestres. Por ende, nuestro principal objetivo fue adaptar las biotecnologías existentes, para reproducir y conservar felinos en peligro de extinción. Debido a la limitada disponibilidad de ovocitos de felinos silvestres, se utilizó como modelo experimental ovocitos de Gd para desarrollar las diferentes técnicas. En el Capítulo I, se estudiaron diferentes condiciones de maduración y cultivo embrionario para mejorar los resultados de la técnica de inyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI) en el Gd. De esta manera, determinamos que utilizando el suplemento insulina-transferrina y selenio (ITS) durante la maduración de los ovocitos, y baja tensión de oxígeno (5%O2) durante el cultivo, se obtienen mayores tasas de formación de blastocistos, que realizando la maduración sin ITS o cultivando con 21% O2. Luego, se seleccionaron las mejores condiciones para generar embriones interespecíficos inyectando espermatozoides de chita (Ch, Acinonyx jubatus) y leopardo (Leo, Panthera pardus) en ovocitos de Gd. En este experimento, se obtuvieron tasas similares de formación de blastocisto tanto en el control de ICSI homoespecífica de Gd como en los embriones interespecíficos, sin necesidad de realizar activación química luego de la inyección del espermatozoide. Con este trabajo fue posible evaluar la capacidad de desarrollo de los espermatozoides de felinos silvestres por la técnica de ICSI interespecífica utilizando ovocitos de Gd. En el capítulo II, se estudió la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT, del inglés somatic cell nuclear transfer) en felinos. El objetivo consistió en desarrollar nuevas estrategias de SCNT para mejorar la técnica en el Gd y en felinos silvestres. En primer lugar evaluamos tres técnicas diferentes de SCNT en el Gd, dos de las cuales no habían sido previamente reportadas en esta especie. Las tres técnicas fueron: fusión de la célula donante de núcleo en ovoplastos con zona pelúcida (ZP), inyección de la célula donante de núcleo en ovoplastos con ZP, y fusión de la célula donante de núcleo en ovoplastos libres de ZP. Esta última fue la que resultó más eficiente por lo que se decidió utilizar esta técnica para determinar la capacidad del ovoplasto de Gd de reprogramar células de felinos filogenéticamente distantes por SCNT interespecífica (SCNTi). Las células donantes utilizadas fueron de gato bengal (Be, híbrido entre gato doméstico y leopardo asiático), chita y tigre (Ti, Panthera tigris). Asimismo, se evaluó el efecto de la agregación embrionaria cultivando los embriones reconstituidos libres de ZP en micropozos de manera individual (1X) o de a 2 clones de la misma especie juntos (2X, embriones agregados), con el objetivo de mejorar el desarrollo in vitro y la calidad de los embriones, tal como se había reportado para otras especies. En este experimento, se obtuvieron embriones hasta el estadío de blastocisto de todas las especies. La agregación de embriones mejoró la tasa de desarrollo en todos los grupos y la calidad de los blastocistos de Gd y de Ti. Además, se estudiaron los niveles relativos de expresión de genes asociados a pluripotencia y diferenciación temprana (OCT4, NANOG, SOX2 y CDX2) en blastocistos clones de Gd, Be y Ch. Este estudio reveló que los embriones de Gd1X tenían mayor nivel relativo de expresión de los cuatro genes comparado con embriones del grupo control de fecundación in vitro (FIV). Sin embargo, esta sobre-expresión se vio reducida en los blastocistos derivados del grupo Gd2X, en los que se determinó que los cuatro genes alcanzaron niveles relativos de expresión similares a los de FIV. Por otra parte, los niveles relativos de expresión de los cuatro genes en los embriones de chita fueron inferiores que los del control, observándose también este resultado para los niveles relativos de expresión del gen OCT4 en embriones de bengal. Como conclusión, podemos afirmar que la técnica de ICSI representa una metodología directamente aplicable a la reproducción de felinos silvestres, especialmente cuando las muestras seminales son de baja calidad. Con respeto a la SCNT y SCNTi, los ovocitos de gata doméstica fueron capaces de reprogramar células de otras especies silvestres y generar blastocistos. Además, la agregación de clones ha demostrado mejorar el desarrollo de los embriones en todos los grupos y normalizar la expresión relativa de genes en el gato doméstico, pero no en los embriones interespecíficos. La SCNT representa una alternativa para generar animales que no están en edad reproductiva o que han muerto y sus células fueron criopreservadas. La presente tesis aporta nuevas metodologías biotecnológicas y conocimiento para la reproducción en felinos.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 132 h

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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Moro, Lucía N.
2015-03-18

Descripción: La extinción de especies animales es una de las consecuencias más alarmantes provocada por el deterioro ambiental y nos priva, de manera irreversible, de un material genético único e irremplazable. La Familia Felidae no escapa a esta problemática y es por este motivo que las biotecnologías reproductivas se convierten en herramientas muy poderosas para la conservación de estas especies. La hipótesis de la presente tesis doctoral radica en que es posible utilizar ovocitos u ovoplastos de gata doméstica (Gd) para desarrollar técnicas reproductivas aplicables a felinos silvestres. Por ende, nuestro principal objetivo fue adaptar las biotecnologías existentes, para reproducir y conservar felinos en peligro de extinción. Debido a la limitada disponibilidad de ovocitos de felinos silvestres, se utilizó como modelo experimental ovocitos de Gd para desarrollar las diferentes técnicas. En el Capítulo I, se estudiaron diferentes condiciones de maduración y cultivo embrionario para mejorar los resultados de la técnica de inyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI) en el Gd. De esta manera, determinamos que utilizando el suplemento insulina-transferrina y selenio (ITS) durante la maduración de los ovocitos, y baja tensión de oxígeno (5%O2) durante el cultivo, se obtienen mayores tasas de formación de blastocistos, que realizando la maduración sin ITS o cultivando con 21%O2. Luego, se seleccionaron las mejores condiciones para generar embriones interespecíficos inyectando espermatozoides de chita (Ch, Acinonyx jubatus) y leopardo (Leo, Panthera pardus) en ovocitos de Gd. En este experimento, se obtuvieron tasas similares de formación de blastocisto tanto en el control de ICSI homoespecífica de Gd como en los embriones interespecíficos, sin necesidad de realizar activación química luego de la inyección del espermatozoide. Con este trabajo fue posible evaluar la capacidad de desarrollo de los espermatozoides de felinos silvestres por la técnica de ICSI interespecífica utilizando ovocitos de Gd. En el capítulo II, se estudió la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT, del inglés somatic cell nuclear transfer) en felinos. El objetivo consistió en desarrollar nuevas estrategias de SCNT para mejorar la técnica en el Gd y en felinos silvestres. En primer lugar evaluamos tres técnicas diferentes de SCNT en el Gd, dos de las cuales no habían sido previamente reportadas en esta especie. Las tres técnicas fueron: fusión de la célula donante de núcleo en ovoplastos con zona pelúcida (ZP), inyección de la célula donante de núcleo en ovoplastos con ZP, y fusión de la célula donante de núcleo en ovoplastos libres de ZP. Esta última fue la que resultó más eficiente por lo que se decidió utilizar esta técnica para determinar la capacidad del ovoplasto de Gd de reprogramar células de felinos filogenéticamente distantes por SCNT interespecífica (SCNTi). Las células donantes utilizadas fueron de gato bengal (Be, híbrido entre gato doméstico y leopardo asiático), chita y tigre (Ti, Panthera tigris). Asimismo, se evaluó el efecto de la agregación embrionaria cultivando los embriones reconstituidos libres de ZP en micropozos de manera individual (1X) o de a 2 clones de la misma especie juntos (2X, embriones agregados), con el objetivo de mejorar el desarrollo in vitro y la calidad de los embriones, tal como se había reportado para otras especies. En este experimento, se obtuvieron embriones hasta el estadío de blastocisto de todas las especies. La agregación de embriones mejoró la tasa de desarrollo en todos los grupos y la calidad de los blastocistos de Gd y de Ti. Además, se estudiaron los niveles relativos de expresión de genes asociados a pluripotencia y diferenciación temprana (OCT4, NANOG, SOX2 y CDX2) en blastocistos clones de Gd, Be y Ch. Este estudio reveló que los embriones de Gd1X tenían mayor nivel relativo de expresión de los cuatro genes comparado con embriones del grupo control de fecundación in vitro (FIV). Sin embargo, esta sobre-expresión se vio reducida en los blastocistos derivados del grupo Gd2X, en los que se determinó que los cuatro genes alcanzaron niveles relativos de expresión similares a los de FIV. Por otra parte, los niveles relativos de expresión de los cuatro genes en los embriones de chita fueron inferiores que los del control, observándose también este resultado para los niveles relativos de expresión del gen OCT4 en embriones de bengal. Como conclusión, podemos afirmar que la técnica de ICSI representa una metodología directamente aplicable a la reproducción de felinos silvestres, especialmente cuando las muestras seminales son de baja calidad. Con respeto a la SCNT y SCNTi, los ovocitos de gata doméstica fueron capaces de reprogramar células de otras especies silvestres y generar blastocistos. Además, la agregación de clones ha demostrado mejorar el desarrollo de los embriones en todos los grupos y normalizar la expresión relativa de genes en el gato doméstico, pero no en los embriones interespecíficos. La SCNT representa una alternativa para generar animales que no están en edad reproductiva o que han muerto y sus células fueron criopreservadas. La presente tesis aporta nuevas metodologías biotecnológicas y conocimiento para la reproducción en felinos.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 132 p.

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Pechin, Guillermo Héctor
2016-08-08

Temas:   Nutrición   -  Ovinos   -  Zinc   -  Fuente orgánica   -  Fuente inorgánica   -  Nutrición   -  Zinc   -  Nutrición   -  Ovinos

Descripción: Con los objetivos de: 1) desarrollar un modelo de deficiencia subclíncia de zinc (Zn) en ovinos y 2) estimar la biodisponibilidad relativa (BDR) del Zn en un complejo Zn-aminoácidos con respecto al sulfato de Zn (ZnSO4) para ovinos en crecimiento, se llevaron a cabos dos ensayos. En el primer ensayo, 10 corderos de raza Corriedale, con un peso promedio de 10,09 kg de peso, fueron asignados aleatoriamente a dos grupos: Basal (B) y Suplementado con Zn (Z). La dieta B contenía 10 ppm de zinc (Zn), base materia seca (MS), y la dieta Z fue suplementada con ZnSO4, para aportar un nivel extra de 30 ppm de Zn. El ensayo se extendió por el término de 5 meses, período durante el cual los animales se pesaron mensualmente. También con esta periodicidad, fueron sangrados de vena yugular, para la posterior medición de parámetros hematológicos y de los niveles de Zn, Cu y fosfatasa alcalina (FA) en plasma. A los 45 días y hacia el final del período experimental, se realizaron ensayos de balance de Zn, Cu y nitrógeno (N). Posteriormente, se procedió al sacrificio de los animales y se recogieron muestras de músculo (longissimus dorsi, supraescapular y semimembranoso), hígado, páncreas, testículo, riñón, pulmón, hueso (metacarpo y metatarso) y lana para la determinación de los niveles de Zn y Cu. Por otro lado, también se tomaron muestras de piel (zonas del flanco y del vientre), hueso (metacarpo y metatarso, tercios distales), testículo, páncreas y del epitelio de lengua, esófago, rumen y vejiga para ser procesadas histológicamente. La ganancia de peso y la calidad de la lana fueron similares en ambos grupos, mientras que la producción de lana fue superior en el grupo Z. Los niveles de Zn plasmático fueron significativamente mayores en el grupo Z que en el grupo B, pero los niveles de FA plasmática, el hematocrito, la concentración de hemoglobina, y el número de glóbulos rojos, leucocitos y linfocitos en sangre no difirieron entre grupos. Las cupremias tendieron (p<0,10) a ser mayores en el grupo B. De acuerdo al primer ensayo de balance, las retenciones de Zn y de N fueron significativamente mayores en el grupo Z. La retención porcentual de Zn en grupo B fue mayor y mostró la puesta en marcha de los mecanismos homeostáticos. La retención de Cu tendió (p<0,10) a ser mayor en el grupo B. En el segundo ensayo de balance los resultados (Zn, Cu y N) fueron similares. En el segundo ensayo, 20 corderos Corriedale, con un peso de 15,3 kg fueron asignados en forma aleatoria a cinco grupos: Basal (dieta con 10 ppm de Zn), suplementados con ZnSO4 y con un complejo Zn-aminoácidos para proveer, en ambos casos, niveles adicionales de 10 y 20 ppm. Con los animales, se trabajó con una metodología similar al primer ensayo. Para la determinación de la BDR del Zn a partir del complejo Zn aminoácidos en comparación con ZnSO4 fueron elegidas las cinco variables que respondieron, en las dos fuentes, con incrementos lineales al aumento de la dosis de Zn. Las mismas fueron: Zn aparentemente digerido (períodos 1 y 2), retención de Zn (períodos 1 y 2) y Zn hepático. Si bien, en los cinco casos la pendiente del complejo Zn aminoácidos fue numéricamente mayor que la de la fuente patrón (BDR entre 105 y 125), las diferencias no llegaron a ser estadísticamente significativas.Tomados en su conjunto, los resultados de ambos trabajos demuestran la validez del modelo de deficiencia de Zn, en el que varios indicadores pueden ser utilizados en ensayos de BDR. Bajo las condiciones de nuestro ensayo, la BDR del Zn a partir del complejo Zn aminoácidos no parece ser mayor a la del ZnSO4.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: unknown  (tamaño kb)  Pag. 152 h.

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Buzzano, Orlando Omar
2019-06-28

Descripción: Esta investigación priorizó el interés de evaluar e interrelacionar los diferentes datos obtenidos de los veinte pacientes caninos con CMD primaria con los cuales hemos trabajado. En este contexto, realizamos distintos estudios para conocer si se presentaban cambios en la estructura cardíaca, en las funciones o en la condición eléctrica y, de ser así, poder cuantificarlos para comprobar los efectos terapéuticos del clorhidrato de amiodarona (A) y de su combinación con el maleato de enalapril (A+E). Los pacientes con CMD primaria incluidos se separaron en dos grupos (G); (G1- CMD y G2-CMD). Según los protocolos terapéuticos utilizados, los mencionados grupos recibieron la denominación definitiva de G1-CMD+A y G2-CMD A+E respectivamente. En el G1-CMD+A se logró controlar o mejorar las variables relacionadas con las alteraciones electrofisiológicas. Dicho efecto es atribuido a las propiedades del clorhidrato de amiodarona. No ocurrió lo mismo con las variables relacionadas con los cambios estructurales y funcionales, ya que, el propio avance de la CMD primaria, en general, continuó deteriorándolas. A través de los distintos controles cardiológicos realizados, observábamos que,los resultados más importantes se produjeron en el G2-CMD A+E. En dicho grupo, también mejoraron las variables electrofisiológicas alteradas, los aspectos funcionales y anatómicos, hecho que atribuimos al efecto del maleato de enalapril. Además, fueron relevantes en el G2-CMD A+E las modificaciones que se encontraron tanto en las variables de estructura como en las de función sistodiastólica del ventrículo izquierdo (VI). Estos cambios, demostraron en general, una mejor función de bomba y el control de la disritmia ventricular. Los aspectos comparativos de todos los casos se refieren a los valores pre y postratamiento intragrupo. Creemos que hubiésemos logrado mejores resultados en algunas de las variables estudiadas, prolongando el lapso terapéutico. Para explicar más claramente lo que sucedió en nuestra investigación,agrupamos las veintinueve variables y los dos índices, con los que trabajamos, de la siguiente manera: 1.- Evaluación de la función sistólica del VI. Para estudiar los cambios pre y post tratamiento de esta función, hemos analizado en ambos grupos la evolución de dieciocho variables. Estas se detallan en materiales y métodos, y sea analizan en resultados. Como mencionáramos, dicha función mejoró en el G2-CMD A+E, encontrándose: 1.- Una disminución en los valores de: la SSPE, del DDVI, del DSVI, de la MMVI, del IMMVI, del VDF, del VSF, del PPE, y del IE (este último desde ambas ventanas). La VacCf reveló una tendencia a la reducción del tiempo de acortamiento, pero no hubo diferencias significativas. 2.- Un aumento de: la FA%, la FAm%, la FEy%, la Vp. Ao, del PE, y la onda S` tisular parietal.3.- No hemos encontrado modificaciones en el EPR. Es importante mencionar que el AI continuó aumentando sus dimensiones en los grupos tratados; consecuentemente, suponemos que el maleato de enalapril no remodeló inversamente esta cámara, pero si lo hizo en el VI, en el cual se observó la disminución de ambos diámetros. Con respecto a los dos índices estudiados (Weissler y Tei) se observó que, al inicio de la investigación ambos estaban aumentados en los dos grupos (G1-CMD y G2- CMD). Al final de la experiencia dichos índices se redujeron en el G2-CMD A+E, indicando una mejoría de la función sistólica y sistodiastólica respectivamente. 2.- Evaluación de la función diastólica del VI: Esta función se ha estudiado analizando en forma conjunta cinco variables. Hemos comprobado por Doppler de flujo transmitral que el G1 presentó características de un patrón restrictivo, indicativo de alteración diastólica. No ocurrió lo mismo en el G2-CMD A+E, en el cual se observó la disminución de: la Vp. de la onda E y de la relación E/A, así como el aumento del Tpo.D.E, de la Vp. de la onda A y del TRIV. 3.- Evaluación electrofisiológica no invasiva.Hemos analizado y categorizado seis variables electrofisiológicas de la siguiente manera: 3.1.- Evaluación de las alteraciones de la repolarización ventricular: 3.1.1.- El IQT se prolongó aproximadamente un 10% en ambos grupos. Asimismo, en todos los caninos con CMD no tratados, dicho IQT fue menor a causa del aumento compensatorio de la FC.3.1.2.- La DTR (IT-p-e) se redujo en los dos grupos tratados con clorhidrato de amiodarona. El efecto contrario ocurrió en los dos grupos previo al tratamiento. 3.1.3.- No hemos hallado MAlt.T en ninguno de los grupos investigados. 3.2.- Evaluación del sistema nervioso autónomo: 3.2.1.- La VFC en el componente SDNN disminuyó en los G1-CMD y G2-CMD por efecto del incremento de la FC. En ambos grupos tratados (G1-CMD+A y G2-CMD A+E) observamos un valor mayor del SDNN. 3.2.2.- El parámetro TO% de la TFC fue negativo en el G1-CMD y G2-CMD y positivo tanto en el G1-CMD+A como en el G2-CMD A+E. La amiodarona incrementó la longitud de ciclo RR post CPV, y no lo hizo de la misma manera en la secuencia pre CPV. El TS mseg/RR fue mayor que la referencia de normalidad y disminuyó en los dos grupos tratados. 3.3.- Evaluación del segmento ST: 3.3.1. - En ninguno de los grupos de caninos con CMD (pretratados y posteriormente tratados) se comprobó la existencia de supra o infradesnivel del segmento ST significativa. Consideramos que, tanto la hipótesis como los objetivos planteados en esta investigación han sido cumplidos. Asimismo, hemos dado a conocer nuestros resultados a través de diversas publicaciones científicas con referato.Un aspecto fundamental de la presente investigación es que, si bien el tratamiento utilizado no cura la enfermedad, ha permitido mejorar la calidad de vida de los enfermos estudiados y prolongar su supervivencia.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: unknown  (tamaño kb)  Pag. 177 h.

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Fernández, Silvina
2017-08-16

Descripción: El ácido hialurónico, glicosaminoglicano lineal no sulfatado de alto peso molecular, se encuentra presente en el epitelio del reservorio oviductal espermático y en los fluidos uterinos de los rumiantes. El principal receptor de membrana de ácido hialurónico (CD44) es una glicoproteína localizada en el oviducto bovino, en donde la unión del ácido hialurónico al receptor cumpliría un rol en la maduración del ovocito, el almacenamiento de espermatozoides, la capacitación espermática y en interacciones vinculadas con la fertilización. La heparina es también un glicosaminoglicano presente en el tracto genital de la hembra bovina, que se utiliza frecuentemente en esta especie como inductor fisiológico de la capacitación espermática in vitro. Diferentes enzimas se encuentran involucradas en la transducción de señales durante la capacitación espermática, entre ellas adenilato ciclasa, proteína quinasa A, tirosina quinasa y proteína quinasa C. En células espermáticas se ha identificado la participación de estas enzimas no sólo en la capacitación sino también en la reacción acrosomal y la motilidad espermática. Los espermatozoides son células metabólicamente activas debido a que poseen las enzimas necesarias para llevar a cabo vías metabólicas como la glucólisis, el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria mitocondrial. El objetivo de dichas vías es la obtención de energía, ya que la capacitación espermática requiere de abundante energía para su inducción y sostenimiento. El metabolismo espermático está compuesto por numerosas enzimas entre las que se destacan en el espermatozoide bovino, lactato deshidrogenasa, creatina quinasa y enzimas del ciclo de Krebs como isocitrato y malato deshidrogenasa. Los reportes de otros autores y los resultados obtenidos previamente en nuestro laboratorio justifican la necesidad de profundizar la investigación sobre el rol del ácido hialurónico en la capacitación, es así que el objetivo general de la tesis fue determinar en el espermatozoide bovino criopreservado durante la capacitación con heparina o ácido hialurónico, los cambios en señales intracelulares (adenilato ciclasa de membrana, tirosina quinasa y proteína quinasa C), de actividades enzimáticas (lactato deshidrogenasa, creatina quinasa, malato deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa) vinculadas con la obtención de energía y consumo de oxígeno, utilizando piruvato y lactato como sustratos oxidativos, para optimizar la preparación de la gameta en la fertilización del ovocito bovino in vitro. En el presente estudio, la concentración óptima hallada para la capacitación con ácido hialurónico y el mantenimiento de la viabilidad espermática fue de 1000 ?g/ml con 60 minutos de incubación. En la capacitación del espermatozoide bovino criopreservado inducida por heparina o ácido hialurónico, se estarían involucrando distintos mecanismos de señales intracelulares, estas diferencias serían las responsables de que los inductores requieran diferentes tiempos de incubación y concentraciones. La capacitación inducida con ácido hialurónico fue menor que la alcanzada por heparina, sin embargo ambos glicosaminoglicanos promovieron cambios intracelulares que permitieron la reacción acrosomal verdadera in vitro inducida por lisofosfatidilcolina en el espermatozoide bovino. A partir de los resultados obtenidos se infiere que para mantener la viabilidad y la capacitación espermática es la combinación de piruvato y lactato la mejor opción para asegurar un metabolismo activo en la gameta. Es así que bajo condiciones de provisión de lactato y piruvato en el medio de incubación, el ácido hialurónico provoca un patrón metabólico donde los esqueletos carbonados son usados por la lactato deshidrogenasa, generando lactato en el medio de incubación, que no se deriva a la obtención de piruvato para producir energía a través del ciclo de Krebs y la cadena respiratoria. Este último glicosaminoglicano mantiene un metabolismo caracterizado por la participación de las enzimas lactato deshidrogenasa, creatina quinasa, isocitrato y malato deshidrogenasa dependientes de NADP para producir energía y coenzimas suficientes para la capacitación espermática. En cambio, la heparina desencadena un metabolismo oxidativo mitocondrial, confirmado por el aumento del consumo de oxígeno que provoca este inductor, junto con un aumento de la actividad de isocitrato y malato deshidrogenasa dependientes de NAD, y baja actividad de lactato deshidrogenasa y creatina quinasa. Respecto a las señales intracelulares estudiadas, el bloqueo de la capacitación y descenso del metabolismo oxidativo en muestras espermáticas capacitadas con heparina en presencia de los inhibidores de adenilato ciclasa de membrana, proteína quinasa C y tirosina quinasa sugieren que se requiere de la actividad de dichas enzimas para modular la capacitación y el metabolismo oxidativo. Contrariamente, la inhibición de adenilato ciclasa de membrana no bloquea completamente la inducción de la capacitación producida por el ácido hialurónico y no afecta al consumo de oxígeno mitocondrial, pero disminuye la actividad de lactato deshidrogenasa y creatina quinasa. Al inhibir proteína quinasa C y tirosina quinasa, la capacitación con ácido hialurónico evidenció estar mediada por estas enzimas, al igual que la actividad de isocitrato y malato deshidrogenasa dependientes de NADP. La motilidad en la capacitación con heparina estaría mediada por tirosina quinasa, y en la capacitación con ácido hialurónico por proteína quinasa C y tirosina quinasa. La heparina y el ácido hialurónico son dos glicosaminoglicanos capaces de provocar la capacitación en el espermatozoide bovino involucrando diferentes vías metabólicas y regulación de señales intracelulares dependientes de adenilato ciclasa de membrana, proteína quinasa C y tirosina quinasa, es decir diferentes caminos para alcanzar la capacidad fertilizante. El presente trabajo de tesis contribuye a optimizar las condiciones de capacitación in vitro de semen criopreservado bovino, que impactará sobre la fertilización in vitro de esta especie. A través del conocimiento de los mecanismos intracelulares y las variaciones del metabolismo espermático, se valida el uso de ácido hialurónico como inductor fisiológico de la capacitación espermática.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 140 h

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Toriggia, Paula Gabriela
2015-03-31

Descripción: La enfermedad periodontal (EP) es un proceso de pérdida progresiva de los elementos de sostén del diente, habiéndose establecido que es la enfermedad más común en perros y gatos adultos. Muchas investigaciones han empleado el microscopio electrónico de barrido (MEB) para estudiar las características de la dentina y el cemento en dientes humanos. Sin embargo, muy pocos estudios se han realizado en relación con la dentina de dientes de perro y ninguno en relación con el cemento, ni en dientes sanos ni en aquellos involucrados en EP. Tampoco se han reportado en esta especie, trabajos que evalúen la eficacia de los distintos instrumentos utilizados para el curetaje y alisado radicular en la EP. El objetivo del presente trabajo fue describir las características estructurales de la dentina y del cemento en dientes sanos, permanentes y maduros de perros y en aquellos involucrados en EP, así como sus modificaciones con la terapia periodóncica y determinar la prevalencia de esta enfermedad en nuestro medio.Para el estudio de la dentina, se observaron con el MEB, 36 dientes normales, sometidos a distintas fuerzas oclusales, extraídos de 12 perros de dos grupos etarios definidos y 6 colmillos de distintos perros, todos mayores a 7 años de edad involucrados en enfermedad periodontal severa. Se determinó la forma, diámetro y densidad de los conductillos dentinarios, así como también el área ocupada por ellos. Se observaron microfotografías digitales de la cara vestibular de la cavidad pulpar a distintos niveles de dientes sanos e involucrados con EP. Se obtuvieron los siguientes resultados: el diámetro y el área de los conductillos disminuyeron en sentido corono apical; el diámetro y el área de los conductillos aumentaron con la fuerza oclusal; el diámetro y el área de los conductillos disminuyeron con la edad; la densidad de los conductillos disminuyó en sentido corono apical; la densidad de los conductillos no se vio influenciada por la edad ni por la fuerza oclusal; no se hallaron diferencias significativas entre la dentina de la cavidad pulpar de dientes normales y los involucrados en enfermedad periodontal severa. Respecto del cemento de dientes sanos, se estudió -con el MEB- la cara vestibular de 38 raíces dentales, en sus tercios coronario y apical. Se realizó una clasificación morfológica de la superficie y se midió el diámetro de fibras de Sharpey, estableciéndose el porcentaje que ocupaban en una superficie determinada. En el tercio coronario se encontró cemento de tipo acelular, con fibras de Sharpey densamente agrupadas, ocupando casi la totalidad de la superficie. El diámetro de las fibras fue de 5.31 ± 0.98 ?m. En el tercio apical, se encontró cemento celular con una densidad de fibras de Sharpey menor al 55%, siendo el resto fibras intrínsecas y lagunas celulares. El diámetro de las fibras fue de 5.47 ± 1.31 ?m. Los diámetros de las fibras de Sharpey del tercio apical fueron significativamente mayores que aquellos del tercio coronario. Puede concluirse que la superficie del cemento no es uniforme, presentando variaciones entre los tercios coronario y apical, así como también dentro del mismo tercio del diente. En relación con el cemento de dientes involucrados en enfermedad periodontal, el estudio fue dirigido principalmente hacia la presencia y características de las reabsorciones radiculares producidas por la EP. Se observaron con el MEB 43 raíces dentales involucradas distintos grados de enfermedad periodontal, determinados en forma clínica y radiográfica. Se evaluó el número de reabsorciones en cada tercio radicular, su área, el porcentaje del tercio radicular reabsorbido, la invasión de la dentina y la evidencia radiográfica de reabsorciones en cada diente. La ubicación predominante de todas las reabsorciones fue el tercio coronario. Los dientes involucrados en EP grado 4 mostraron un mayor número de reabsorciones y un mayor porcentaje de tercio radicular reabsorbido. El tamaño de las reabsorciones, fue mayor en el tercio apical. Un bajo porcentaje de reabsorciones (11,7%) llegaron a involucrar la dentina y sólo aquellas extremadamente grandes y profundas se detectaron radiográficamente. La efectividad de los instrumentos utilizados frecuentemente en medicina veterinaria para la limpieza de la superficie radicular fue evaluada usando para tal fin el MEB. Se utilizaron 28 raíces dentales involucradas en enfermedad periodontal severa y con un mínimo de 3 mm de retracción gingival. Las raíces fueron divididas en 4 grupos, aplicándole a cada uno de ellos un tratamiento distinto: limpieza con cavitador ultrasónico, curetaje ?ambos métodos con y sin pulido de la superficie tratada-. Se tomaron microfotografías de 2 zonas distintas -coronaria y apical- realizándose una clasificación según una modificación del índice de cálculo remanente y el índice de pérdida de sustancia dental (Lie, 1985). El ultrasonido con posterior pulido demostró ser el tratamiento más eficiente. Diversos estudios epidemiológicos a nivel mundial, indican que la EP es la enfermedad más frecuente en los perros adultos. Al no haberse efectuado, hasta el momento, trabajos similares en nuestro medio, se consideró incluirlo en este estudio. Se recabó información de 114 perros, en los cuales se realizó un examen periodóncico completo, registrándose también edad, peso, raza, conformación craneana, alimentación y enfermedades concomitantes. La prevalencia de la EP hallada en nuestro medio fue de 93,9%; se encontró correlación positiva entre la EP y la edad de los animales y negativa entre la EP y el peso corporal. No se encontró asociación entre enfermedad periodontal y el tipo de alimentación, hábitos masticatorios, conformación craneana, oclusión ni enfermedades concomitantes.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 211 h.

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Cardillo, Natalia Marina
2012-03

Descripción: La Toxocariosis es una de las enfermedades parasitarias de mayor prevalencia en caninos y felinos a nivel mundial. Toxocara cati es un nematode que parasita el aparato digestivo de los felinos. Producen huevos que son eliminados con la materia fecal de sus hospedadores, contaminando el ambiente. El huevo larvado se desarrolla en el medio y es la forma infectante para otros felinos, hospedadores paraténicos y el hombre. Existe escasa evidencia sobre el comportamiento biológico e inmunológico de los hospedadores frente a la infección por T. cati, pero se sabe que las larvas tienen capacidad migratoria por los tejidos y en el ser humano producen, entre los más reconocidos: el Síndrome de Larva Migrans Visceral; Toxocariosis ocular y Toxocariosis Encubierta. El ratón es un hospedador paraténico natural de T. cati y las larvas tisulares son infectantes para felinos cazadores. Como modelo de experimentación, el ratón presenta similitudes con el humano tanto en la ruta migratoria como en la patogénesis de la enfermedad. Los antígenos de excreción-secreción (ES) liberados por las larvas parásitas durante el proceso migratorio juegan un papel relevante en el diagnóstico de la Toxocariosis humana, cuya utilización evidencia la presencia de inmunoglobulinas específicas de la infección. Se realizó un estudio experimental en ratones, con tres pruebas independientes y diferentes dosis de huevos larvados de Toxocara cati, obtenidos de materia fecal de felinos naturalmente infectados. Se estudió el patrón migratorio y las características de las lesiones producidas durante la etapa aguda y crónica de infección. La respuesta inmunológica se determinó por detección de inmunoglobulinas especificas M y G. Las larvas migraron al hígado, pulmón y cerebro en la fase aguda y se concentraron en los músculos del ratón en la etapa crónica. Se observaron lesiones macroscópicas en la superficie del cerebro y en el pulmón, en la etapa aguda, y microscópicamente, lesiones inflamatorias en el hígado, pulmón cerebro y músculo en ambas etapas. No se observó la formación de granulomas parasitarios o signos de encapsulamiento de larvas en ningún momento de la infección. Se observaron diferencias significativas en el comportamiento de las curvas de Inmunoglobulinas M y G, entre el grupo infectado y el grupo control y entre las fechas p.i., pudiendo diferenciarse la infección aguda y crónica. La evidencia de bandas de bajo peso molecular (31 y 52 Kda.) en el Western Blot de los sueros positivos a la técnica de ELISA, son indicativas de una respuesta especifica a Toxocara spp. y difirieron entre inmunoglobulinas entre las fases aguda y crónica. Las bandas de IgM se observaron con mayor intensidad que las IgG en la etapa aguda, estas últimas presentes en todos los días p.i. Los resultados de este estudio demuestran la infectividad de los huevos de T. cati que son eliminados al ambiente con la materia fecal del gato. El comportamiento migratorio de las larvas de T. cati en el ratón y la tendencia a concentrarse en la musculatura esquelética, refuerzan la importancia del ratón como hospedador paraténico y reservorio en el ciclo del parásito en la naturaleza. La presencia de lesiones inflamatorias en los tejidos, en ausencia de formación de granulomas parasitarios podría sugerir una menor virulencia de esta especie con igual patogenicidad que T. canis. Este aspecto podría traducirse en una menor restricción inmunológica de las larvas.El comportamiento inmunológico del ratón frente a las larvas migrantes de T. cati mostró una tendencia explicativa de las etapas aguda y crónica de la migración e indicó una respuesta específica frente a esta especie en las bandas de bajo peso molecular observadas en el Western Blot de los sueros positivos. Los resultados del presente estudio integral de la infección de T. cati en el modelo animal murino, aportan nuevos conocimientos sobre el comportamiento de las larvas durante el proceso migratorio y sobre la respuesta inmunopatológica del ratón frente a la infección; demuestran el potencial del antígeno obtenido de larvas de huevos presentes en materia fecal y posibles herramientas para el diagnóstico de Toxocariosis en el humano.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: unknown  (tamaño kb)  Pag. 216 h.

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Gilardoni, Liliana Rosa
2012

Temas:   Microbiología   -  Bovinos   -  Paratuberculosis   -  Diagnóstico

Descripción: La paratuberculosis (PTBC) es una enfermedad crónica de los rumiantes, caracterizada por presentar un largo período de incubación y producir enteritis granulomatosa y diarrea profusa en estadios avanzados. Es causada por Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (Map). Su importancia económica se debe a las pérdidas asociadas con el descenso de la producción láctea, el desmejoramiento de los animales y la mortalidad. Según la severidad de los signos clínicos, la evolución de la PTBC bovina puede dividirse en cuatro estadios: silencioso, subclínico, clínico y avanzado. Los animales que cursan los primeros estadios, que habitualmente son los de mayor duración, excretan Map por calostro, leche y heces sin evidenciar signos clínicos. De esta manera transmiten la infección a otros animales susceptibles, particularmente a los terneros. Por lo expuesto, el control de la enfermedad debería basarse en la detección precoz y eliminación temprana de los animales infectados. Sin embargo, las pruebas diagnósticas disponibles actualmente adolecen de una marcada falta de sensibilidad, que las hace incompatibles con este tipo de estrategia. Las pruebas reconocidas y corrientemente en uso para el diagnóstico de PTBC son el cultivo de materia fecal y la prueba de ELISA indirecto para la detección de anticuerpos séricos. En estadios subclínicos la sensibilidad de estas pruebas se encuentra por debajo del 50%. A fin de mejorar la sensibilidad diagnóstica se desarrollaron técnicas de biología molecular, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que puede ser aplicada en muestras de materia fecal, leche y tejidos. Sin embargo, la eliminación de Map por las dos primeras vías es intermitente y con una baja concentración. Por consiguiente, para incrementar la sensibilidad se desarrolló un método de concentración de microorganismos: la separacióni inmunomagnética (IMS) mediante la utilización de nanopartículas imantadas acopladas a anticuerpos policlonales antiMap. El procedimiento aplicado a la leche bovina no solo aumenta la concentración de Map, sino que además elimina los componentes lácteos inhibidores de la PCR. La finalidad de esta tesis fue desarrollar un procedimiento de identificación de Map en muestras de leche. El protocolo elaborado cuenta con dos etapas: a. concentración del microorganismo por separación inmunomagnética con nanopartículas imantadas (perlas inmunomagnéticas) acopladas a anticuerpos monoclonales y policlonales específicos, producidos en la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Buenos Aires. b. identificación del material genético mediante la aplicación de una PCR IS900 con cebadores diseñados en la misma casa. Además, a fin de evaluar la técnica en condiciones de campo (evaluación preliminar), se analizaron muestras de leche cruda de bovinos procedentes de establecimientos infectados y libres de PTBC. La máxima capacidad de adhesión de las perlas inmunomagnéticas se obtuvo cuando se utilizaron de manera simultánea perlas acopladas a anticuerpos monoclonales y perlas acopladas a anticuerpos policlonales (107 UFC/mL). La PCR IS900 con los cebadores diseñados por la Dra. S. L. Mundo, en la Facultad de Ciencias Veterinarias mostró mayor sensibilidad analítica que con los cebadores diseñados por el Dr. Collins y col. y que la PCR ISF57, detectando 101, 103 y 102 UFC de Map/mL, respectivamente. Además, no presentó reacción cruzada cuando fueron enfrentadas con otras micobacterias como M. avium subsp. avium, M. phlei, M. fortuitum ni con M. scrofulaceum. En el ensayo a campo, se tomaron muestras de leche, materia fecal (MF) y sangre de 147 animales asintomáticos provenientes de 5 establecimientos infectados, y de 118 animales de 4 establecimientos libres de PTBC. Dichas muestras fueron analizadas por el método desarrollado (IMS-PCR IS900), por cultivo de leche y de MF y por ELISA indirecto en suero. De las muestras provenientes de los establecimientos infectados se obtuvieron los siguientes resultados positivos: IMS-PCR IS900: 80 (54,4%), cultivo de leche: 2 (1,4%), cultivo de MF: 17 (11,6%) y ELISA: 52 (35,4%). Las 118 muestras de los establecimientos libres resultaron negativas a todas las pruebas.La concordancia entre IMS-PCR IS900 y el cultivo de MF, y entre IMS-PCR IS900 y el ELISA presentó un nivel leve. Esto es consistente con la baja sensibilidad que tanto el cultivo como el ELISA presentan en animales asintomáticos. La sensibilidad y la especificidad relativas del cultivo de materia fecal con respecto a IMS-PCR IS900 fueron estimadas en 18,8% y 98,9% respectivamente. Para el ELISA, estos parámetros fueron estimados en 36,2% y 87,6% respectivamente. La ausencia de resultados positivos en los establecimientos libres es un indicador del alto nivel de especificidad demostrado por la IMS-PCR IS900. Los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que la técnica de IMS-PCR IS900 tiene una capacidad de discriminación más eficiente que las pruebas actualmente disponibles. Además, frente al cultivo de MF o de leche presenta la ventaja en el tiempo de procesamiento, que es significativamente más reducido que el necesario para un cultivo. Lo mencionado justifica que el método sea validado y posteriormente implementado para su uso como diagnóstico rutinario de muestras de campo.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: unknown  (tamaño kb)  Pag. 123 h.

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Vidal Figueredo, Ramiro José
2012

Descripción: La epilepsia idiopática, tanto en medicina veterinaria, como en medicina humana, es una enfermedad que afecta a una gran cantidad de individuos. Se caracteriza por crisis cerebrales sin ninguna causa comprobable, mas que una posible predisposición genética. Para ambos casos la clasificación de las crisis epilépticas y de las epilepsias se basa en la utilización de criterios fenotípicos como por ejemplo las características semiológicas, el tipo de estímulo que las induce y la edad en que aparecen por primera vez. En medicina veterinaria, se menciona que en la mayoría de los pacientes no se identifica la causa de la epilepsia y en consecuencia, se asume que padecen epilepsia idiopática, por ausencia de hallazgos positivos. Desde el momento en que se han estandarizado su metodología de registro y análisis, el EEG juega un papel fundamental en el diagnóstico de las epilepsias. Sin embargo sólo presenta grafoelementos patlológicos en el 33% de los casos. Los neurofisiólogos hacen hincapié en que no hay función nerviosa que no se halle regida por una métrica temporal, desde el acto motor más sencillo hasta la actividad cognitiva más compleja. En base a esto el análisis matemático del EEG, denominado electroencefalograma cuantificado (EEGc) y, en particular, el estudio de la coherencia cerebral sería capaz de discriminar entre la actividad eléctrica normal y la patológica. El objetivo del trabajo fue obtener los valores normales de coherencia cerebral en perros adultos sanos y evaluar las diferencias que existieran con los valores de coherencia cerebral en perros que padecen epilepsia idiopática, para evaluar la posibilidad de incorporar dicho estudio al protocolo de diagnóstico de la epilepsia idiopática en perros. Para tal fin se obtuvieron EEG de perros adultos sanos y perros adultos con epilepsia idiopática y libre de medicación al momento del estudio. Se trabajó con un equipo de EEGrafía de 12 canales. Para obtener los registros EEGráficos se utilizó un programa especialmente diseñado para electroencefalografía computada y reconstrucción por mapeo cerebral. El tiempo mínimo de registro fue de 30 minutos. La restricción de los animales se realizó xylazina en dosis de 1 mg/kg. Se utilizaron para el análisis sólo electroencefalogramas que presentaban trazados normales al análisis visual, es decir, sin grafoelementos patológicos. A continuación se seleccionaron al menos quince segmentos estacionarios de 2 segundos de duración (épocas) libres de artificio. Se obtuvieron los valores de coherencia cerebral para las combinaciones interhemisféricas (T3-T4; Fp1-Fp2; F3-F4; P3-P4; O1-O2) e interhemisféricas (O-P; O-F; O-Fp; Fp-T; T-O) Los valores de coherencia cerebral se obtuvieron de dos maneras diferentes: A) De la forma cotidiana, es decir espectro de potencia cruzado, espectro de coherencia y espectro de fase, b) El promedio de la coherencia de las bandas electroencefalográficas alpha y theta. De acuerdo a nuestros estudios, podemos describir en los perros adultos sanos la existencia de dos grupos de canales con dinámica eléctrica diferente tanto para el análisis de la coherencia interhemisférico como para el análisis de coherencia intrahemisférico: A) Para el análisis interhemisférico el grupo de los canales dorsales (Fp1-Fp2; F3-F4; P2-P4; O1-O2) Presentan el PPC en X 7,62 Hz.; mientras que el grupo de los canales temporales (T3-T4) el valor de la frecuencia al que se presenta el PPC es de X 5,25 Hz. B)Para el análisis intrahemisférico el grupo de canales dorsales (O-P; O-F; O-Fp) presentan el PPC a una frecuencia de X 7,58 Hz. y en el grupo de canales halo (Fp-T; T-O) el valor de referencia al que se presenta es de X 6,30 Hz. En los perros epilépticos idiopáticos hemos hallado que el valor de la frecuencia en el que se presenta el PPC es menor que en los perros sanos. En todos los canales evaluados el valor de la frecuencia se encuentra comprendido dentro del valor de la banda electroencefalográfica theta (4-7 Hz.); sin embargo se mantienen las diferencias entre los grupos de canales descriptos anteriormente para las combinaciones interhemisféricas e intrahemisféricas. Aunque el análisis de las bandas electroencefalográficas (alpha y theta) arroja datos similares a los que arroja la forma clásica de obtener los datos, el trabajo con una gran cantidad de valores hace de éste un análisis muy engorroso y dificulta la utilización como herramienta de uso cotidiana en el diagnóstico rutinario. El estudio de coherencia cerebral se presenta como una herramienta del EEGc útil para describir la actividad cerebral, identificando los osciladores específicos de las áreas cerebrales, permitiendo establecer las conexiones anatómicas entre ellas. En este aspecto es capaz de reconocer alteraciones en los osciladores, en las conexiones y la participación de ellos en eventos patológicos, de manera que puede utilizarse como herramienta para el diagnóstico de alteraciones eléctricas. Por este motivo podría incorporarse sin dificultad al protocolo diagnóstico de epilepsia idiopática en perros. Finalmente hemos hallado que los perros epilépticos idiopáticos presentan una llamativa similitud con los hallazgos que se han reportado en humanos, por lo que podría utilizarse como modelo de estudio de la epilepsia en humanos, especialmente en lo referido a instrumento de diagnóstico eléctrico.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: unknown  (tamaño kb)  Pag. 231 h.

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Franco Mahecha, Olga Lucía
2014-12-19

Descripción: El virus de la diarrea viral bovina (VDVB) es un patógeno del ganado que causa inmunosupresión en los animales infectados, provocando la muerte de los linfocitos y monocitos-macrófagos. El VDVB no afectaría a las células dendríticas (DC), sin embargo, no existen estudios que describan la actividad del virus sobre estas células a las pocas horas post-infección. El control de esta enfermedad se ve afectado por la falta de vacunas eficaces. Las vacunas tradicionales (virus inactivado) no logran inducir protección y no se ha avanzado en el uso de vacunas de nueva generación. Uno de los problemas es la dificultad de contar con animales libres del virus para evaluar las vacunas. Estas evidencias apoyan la búsqueda de herramientas creativas para la selección de antígenos vacunales, reduciendo el número de pruebas realizadas en la especie destino. En el presente trabajo se investigó la posibilidad de seleccionar inmunógenos candidatos vacunales según su actividad sobre las DC. Estudiamos también la interacción entre el VDVB infectivo y las DC durante el primer día de infección, a fin de establecer la influencia de estas células en la inmunopatogenia del virus. Se estableció un protocolo de selección de antígenos vacunales de acuerdo a su capacidad de inducir la activación de DC in vitro, tanto en DC murinas como bovinas. Se evaluaron: el virus inactivado, la glicoproteína E2 (principal blanco de la respuesta neutralizante) truncada, expresada en el sistema Baculovirus recombinante-células de insecto (Bt-E2) y plásmidos que expresan t-E2. La activación de las DC se estableció midiendo la expresión de moléculas co-estimulatorias y la producción de citoquinas pro-inflamatorias. Los resultados obtenidos muestran que solamente los vectores plasmídicos lograron una completa activación de las DC, por lo que no requerirían de adyuvante, mientras que la Bt-E2 y el virus inactivado, no inducían una activación completa. Se obtuvieron resultados similares con DC murinas y bovinas. Los antígenos candidatos vacunales se evaluaron en ratones, cobayos y bovinos. Las vacunas génicas no fueron eficientes en activar la respuesta humoral, mientras que la Bt-E2 formulada con diferentes adyuvantes indujo altos niveles de anticuerpos (Ac) neutralizantes e inmunidad celular. El perfil de la respuesta inducida fue influenciado por el adyuvante. La aplicación de un adyuvante nanoparticulado diseñado especialmente para activar a las DC, permitió una mejor respuesta, humoral y celular, aún con baja masa antigénica. La inducción de altos niveles de Ac neutralizantes en bovinos guardó relación con la masa de E2 de la vacuna, ya sea recombinante o propia del virus inactivado. Verificamos que Bt-E2 puede ser utilizada como aditivo antigénico para alcanzar una masa adecuada de E2 en las vacunas. Demostramos que el VDVB es capaz de infectar y replicar rápidamente en las DC, y que a pesar de tratarse de un virus de biotipo citopático, no induce apoptosis en estas células. Las Mo-DC infectadas no pueden adquirir un fenotipo activado durante las primeras horas de infección. Proponemos que, al infectar y mantener la viabilidad de las DC, el virus ganaría acceso al tejido linfoide, causando la muerte masiva de linfocitos. La metodología desarrollada en este trabajo resultó ser especialmente útil para comparar antígenos de la misma naturaleza química. La selección de antígenos en base a su capacidad de inducir la activación de DC murinas in vitro, constituye una herramienta muy útil en el desarrollo de vacunas veterinarias porque permite reducir el número de candidatos vacunales para evaluar in vivo; apoyando los esfuerzos por reducir, refinar y finalmente reemplazar los ensayos con animales para la evaluación de productos biológicos.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 138 h.

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Miceli, Diego Daniel
2017-03-29

Descripción: El Síndrome de Cushing (SC) se define como el exceso crónico de glucocorticoides en sangre. Es una de las enfermedades endocrinas más prevalentes en los perros. El SC se caracteriza por presentar disturbios en el metabolismo de los hidratos de carbono y lípidos, entre los que se destacan la tendencia a la hiperglucemia de ayuno, la hipercolesterolemia, la hipertrigliceridemia, la esteatosis hepática y, en los casos más severos, la Diabetes Mellitus (DM). Dichos disturbios se originan porque el cortisol antagoniza muchas funciones de la insulina, induciendo un estado de insulinorresistencia. El péptido símil glucagón 1 (GLP-1) es un péptido intestinal que potencia la secreción de insulina. En humanos con DM, los niveles de GLP-1 se encuentran reducidos. La 11? Hidroxiesteroide Deshidrogenasa tipo 1 (11?-HSD1) es una enzima que convierte la cortisona en cortisol en los tejidos y su alteración está relacionada con el desarrollo de Síndrome Metabólico, obesidad y SC. La Óxido Nítrico Sintasa endotelial (eNOS) produce óxido nítrico (NO) e interviene en la regulación fina (inhibitoria) de la esteroidogénesis adrenal. La metformina es un fármaco de amplio uso en el tratamiento de la DM en humanos, que permite reducir la hiperglucemia, las dislipemias y la insulinorresistencia. Los objetivos de la presente Tesis fueron: evaluar si existen cambios en la expresión de las enzimas 11?-HSD1 y eNOS y en la concentración del GLP-1 en los perros con SC, respecto a los perros sanos. A su vez, evaluar si dichas alteraciones están relacionadas con la persistencia del hipercortisolismo, la dislipemia y la progresión hacia DM en los perros con SC. Estudiar la concurrencia entre SC y DM y evaluar Estudio de la 11?-HSD1 y del GLP-1 en perros con Síndrome de Cushing los posibles factores de riesgo en los perros con SC que podrían predisponer el desarrollo de DM en forma concurrente. Asimismo, implementar nuevas terapias coadyuvantes, como la metformina, que permitan normalizar dichas alteraciones metabólicas. Se realizó el Test de Tolerancia Oral a la Glucosa (TTOG) en perros con SC, en obesos y en controles, y se evaluaron los niveles de GLP-1, insulina y glucemia en los tiempos 0, 15, 30, 60 y 120 minutos. Paralelamente, se evaluaron los índices HOMA (Homeostatis Model Assessment) así como también los niveles de GLP-1 en perros con SC y DM, y en perros con DM. A su vez, se tomaron muestras de tejido adiposo visceral de perros con SC y se evaluó la expresión enzimática de la 11?HSD1 a través de inmunohistoquímica y western blot. Asimismo, se tomaron muestras de glándulas adrenales de perros con SC y se evaluó la expresión enzimática de la eNOS a través de inmunohistoquímica y los niveles de NO plasmático. Se estudió la concurrencia entre SC y DM, se calculó la sobrevida y se evaluaron los factores de riesgo en los perros con SC que podrían predisponer el desarrollo de DM. Por último, se implementó la terapia coadyuvante con metformina en los perros con SC para evaluar si corrige las alteraciones metabólicas mencionadas previamente. Los perros con SC presentaron mayores niveles de GLP-1 (p<0.01), glucemia (p<0.01) e insulinemia (p<0.01), menor sensibilidad insulínica (p<0.01) y mayor funcionalidad de la célula ? pancreática (p<0.01). Los obesos presentaron un comportamiento intermedio. Las mayores concentraciones de GLP-1 podrían sobreestimular a la célula ? pancreática, predisponiendo su agotamiento y posterior Estudio de la 11?-HSD1 y del GLP-1 en perros con Síndrome de Cushing desarrollo de DM. Los perros con DM y con DM-SC presentaron niveles de GLP-1 similares a los perros con SC. La expresión de la enzima 11?-HSD1 en los adipocitos del tejido adiposo visceral de los perros con SC fue significativamente mayor respecto a los perros controles y obesos (p<0.05, p<0.001). La expresión de la enzima eNOS en la corteza adrenal (zona fasciculada) de los perros con SC fue significativamente menor respecto a los perros controles (p<0.01). Los niveles de NO plasmático fueron significativamente menores en los perros con SC, respecto a los controles (p<0.001). La concurrencia de SC y DM fue del 13,61%. Los perros con glucemias > 100 mg/dl (p<0.01, RR 1.16, PPV 0.98), con colesterol total > 350 mg/dl (p<0.01, RR 1.13, PPV 0.98), con triglicéridos > 250 mg/dl (p<0.05, RR 1.17, PPV 0.95), con Relación cortisol creatinina en orina > 100x10-6 (p<0.05, RR 1.13, PPV 0.95) tienen mayor riesgo de desarrollar DM. Los perros con adenoma hipofisario (p<0.05, RR 0.85, PPV 0.08) y las hembras no castradas (p<0.05, RR 0.86, PPV 0.77) tienen una mayor predisposición a desarrollar DM. La aparición de DM en perros con SC reduce el tiempo de sobrevida (p<0.01 con un Hazard ratio de 0.36). La pronta detección de los factores de riesgo permitirá implementar terapias para reducir la incidencia de DM en perros con SC. La implementación terapéutica de metformina resultó efectiva en la normalización de la glucemia (p<0.01), triglicéridos (p<0.05) y colesterol total (p<0.01) durante los primeros meses del tratamiento, acortándose así los tiempos de recuperación. Palabras clave: Síndrome de Cushing, Péptido símil glucagón-1, 11?Hidroxiesteroide Deshidrogenasa 1, Óxido Nítrico Sintasa endotelial, Metformina, Diabetes Mellitus.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 181 h.

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Bucafusco, Danilo
2014-03-27

Temas:   Inmunología   -  Ternero   -  Neonato   -  Virus de la fiebre aftosa   -  Respuesta inmune   -  Calostro   -  Calostrales   -  Respuesta adquirida   -  Aftosa

Descripción: La Fiebre Aftosa es la primera enfermedad para la cual la OIE estableció una lista de países y zonas libres Argentina ha sido declarada libre de la enfermedad sin vacunación hacia el sur del paralelo de 42º Sur, y con vacunación para el resto del país. La valoración de la potencia de las vacunas comerciales puede estimarse por desafío o bien indirectamente mediante la determinación de niveles séricos de anticuerpos (Ac) específicos por ELISA en fase líquida (FL-ELISA) o seroneutralización viral (SNV) a los 60 días post-vacunación. Partiendo de datos históricos de serología y desafío, se han construido curvas que permiten calcular una expectativa potencial de protección según el título de anticuerpos Ac. Al aplicar masivamente la vacunación, los animales de corta edad representan el eslabón más vulnerable ya que su inmunidad depende de la transferencia de calostro inmune desde la madre, y se desconoce cómo esto puede influir en la respuesta a la vacuna inactivada. Una evidencia práctica de este hecho es que los terneros representan la única categoría que se vacuna 2 veces por año, a diferencia de los adultos que sólo reciben una vacunación anual. Para el caso particular de la vacuna inactivada contra la fiebre aftosa existen sólo cuatro estudios publicados acerca de la posible interferencia de anticuerpos maternos en terneros, el más reciente es de hace 15 años. En estos trabajos se utilizan cepas que actualmente no circulan o no forman parte de la vacuna, y adyuvantes que son diferentes a los actuales. Las mediciones de Ac de estos estudios se hicieron mediante FL-ELISA o SNV (no ambas), por lo que nunca se aplicó más de una técnica serológica para estudiar la respuesta inmune de los terneros. El objetivo principal de esta tesis fue analizar los mecanismos inmunológicos que se desarrollan en los terneros a partir de la transferencia de inmunidad pasiva por parte de madres vacunadas. Para alcanzar este objetivo se determinamos la composición del calostro y las características de la transferencia de anticuerpos específicos contra el virus de la fiebre aftosa (VFA) al ternero. Estudiamos la magnitud y la duración de la respuesta humoral a la primovacunación en terneros de diferentes edades nacidos de madres vacunadas y la respuesta a la vacunación en un esquema de dos dosis en terneros con altos o bajos niveles de Ac calostrales . Finalmente, evaluamos la respuesta humoral y celular inducida por una dosis de vacuna anti-aftosa aplicada a los 32 días de vida terneros privados de calostro y en grupos de terneros recibieron cantidades equivalentes de preparaciones de calostro que diferían en la presencia o no de células inmunes maternas pero que eran equivalentes en cuanto a la cantidad y calidad de Ac anti VFA (Ac totales, neutralizantes, isotipos). Nuestros resultados muestran que el calostro proveniente de madres vacunadas transfiere al ternero anticuerpos mayormente neutralizantes y del isotipo IgG1. Calculamos la vida media de los Ac totales, neutralizantes, IgG1, IgG2 e IgM específicas contra VFA. Comprobamos que la presencia o ausencia de células inmunes en el calostro suministrado a los terneros no interfiere con la transferencia de los anticuerpos anti-VFA. Por otro lado pudimos detectar respuesta celular anti-VFA en terneros calostrados que aún no habían recibido vacunación anti-aftosa. La transferencia de células inmunes a través del calostro estaría brindando a los terneros no vacunados inmunidad celular específica sistémica durante los primeros meses de vida, sin interferir con la inducción de respuestas inmunes a la vacunación. Adicionalmente, los componentes solubles del calostro ejercerían algún efecto que favorece la respuesta inducida. Los terneros vacunados, no calostrados o tratados con calostros completos o acelulares, inducen respuesta celular anti-VFA a partir de la semana de vacunación, independientemente también de los niveles de Ac específicos transferidos desde el calostro. Por el contrario, demostramos que la presencia de altos títulos de Ac calostrales en los terneros interfiere con la inducción de respuesta de Ac neutralizantes anti-VFA por vacunación. En este sentido, la respuesta primaria al VFA (IgM) se hace evidente cuanto más bajos son los títulos de Ac calostrales. Verificamos que la aplicación de esquemas de vacunación-revacunación espaciadas en un mes en terneros con altos niveles de Ac calostrales, evita la caída de los Ac totales, medidos por FL-ELISA, pero no los de los Ac neutralizantes. En los programas de relevamiento serológico estos animales presentarían títulos de FL-ELISA correspondientes a una EPP superior al 75%, que es considerado aceptable para la cobertura vacunal poblacional. Sin embargo, las diferencias con los valores observados por SNV ameritarían profundizar el ajuste de las distintas técnicas serológicas (soportado con ensayos de desafío) para este grupo etario. Esta tesis constituye el primer reporte sobre las características del calostro proveniente de madres vacunadas, su composición a nivel humoral y su transferencia a los terneros. Describimos también por primera vez que la presencia o ausencia de células maternas en el calostro no modifica en forma sustancial la respuesta a la vacunación anti-aftosa. Los resultados de esta tesis constituyen además, los primeros datos disponibles sobre el estudio de la respuesta inmune humoral en terneros calostrados inducida por vacunación, evaluada no solo en cuanto a Ac totales o neutralizantes, sino también en cuanto a la avidez y al perfil de isotipos de los Ac inducidos. Nuestro trabajo analizó la respuesta inmune humoral y celular a la vacunación anti-aftosa en los terneros, considerando el posible efecto modulador de la transferencia de inmunidad pasiva por parte de madres vacunadas, un tema además poco explorado en relación a la inmunidad de los bovinos.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: unknown  (tamaño kb)  Pag. 137 h.

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Porta, Natalia Gabriela
2019-03-27

Temas:   Virología   -  Ternero   -  Virus de la leucosis bovina   -  Anticuerpos   -  BLV   -  ELISA   -  PCR   -  Ig Y   -  Transmisión   -  Leche

Descripción: En este trabajo se estudió el efecto del uso de anticuerpos de yema de huevo (IgY) anti BLV específicos como suplemento en la leche de consumo de terneros durante todo el período de cría, monitoreando a los animales desde el nacimiento hasta los 9 meses de vida. El objetivo central fue obtener evidencia que el consumo de leche pueda ser una vía de transmisión del virus y si así fuera, proponer una alternativa para interferir con el desafío natural de infección por BLV por consumo de leche. Como objetivo complementario, se realizaron infecciones experimentales en ovinos en las que se determinó la dosis mínima infectiva tanto de virus asociado a células FLKBLV como de virus libre en sobrenadante celular de FLK-BLV. También se analizó la capacidad neutralizante de los anticuerpos presentes en suero de un animal infectado con BLV. Cabe destacar que previamente al uso de animales se intentó poner a punto un ensayo in vitro. Se realizó la caracterización del rodeo donde se desarrolló la experiencia con terneros. Se observó una prevalencia individual de anticuerpos del 96% en las muestras de sangre, y de un 90% en las muestras de leche. Los títulos de anticuerpos en sangre fueron significativamente más altos que los encontrados en leche. Se detectó la presencia de provirus en el 82% de las muestras de sangre y 59% de las muestras individuales de leche. La carga proviral en leche fue significativamente menor que en sangre. En la leche de tanque del ordeñe diario, se encontraron anticuerpos con un título de 1:32 en todas las muestras, mientras que en las muestras de leches individuales el rango de títulos de anticuerpos variaba entre <1:16 y >1:64. Al comparar las leches individuales con un título de 1:32 con las leches de tanque que poseen el mismo título, se pudo observar que el 90% de las leches de tanque evidencian cargas provirales detectables, mientras que solo el 60% de esas leches individuales evidencian carga proviral detectable. Se detectaron anticuerpos anti BLV en el 95,5% de los terneros recién nacidos, lo que demostraría un correcto calostrado de los animales, de los cuales el 13% de los terneros nacieron infectados (detección de provirus en sangre). En el bioensayo de ovinos, se observó que fueron necesarias 5.000 células FLK-BLV por inoculo para generar la infección en los dos corderos inoculados, mientras que el virus libre en sobrenadante celular FLK-BLV resultó infectivo hasta la dilución 1/1.000. El suero bovino positivo a BLV impidió la infección en los corderos inoculados con el virus libre de células, mientras que todos los ovinos se infectaron cuando se inocularon con virus libre de células en presencia de suero bovino negativo a BLV. Se produjo la cantidad necesaria de un preparado de polvo de huevo con anticuerpos específicos anti BLV para el ensayo controlado de eficacia a campo. La preparación fue caracterizada por ELISA y por infección experimental en corderos. Todos los corderos resultaron infectados cuando fueron inoculados con virus libre de células FLK-BLV previamente incubado con la preparación de IgY concentrada anti BLV y con la preparación de polvo de huevo anti BLV, no demostrando la capacidad de las IgY anti BLV de neutralizar el virus presente en el sobrenadante de células FLK-BLV. Si bien el ensayo in vivo fue una alternativa para el ensayo in vitro con el objeto de analizar la capacidad neutralizante de los anticuerpos IgYs, y aunque no se obtuvieron los resultados esperados, su realización ha resultado beneficiosa para el grupo de trabajo, como una herramienta nueva y válida para realizar distintos estudios. Este polvo fue suministrado a los terneros en cada toma de leche durante la cría. Paralelamente en un grupo control, no se les ofreció ningún suplemento en las tomas diarias de leche. En los primeros días de vida de los terneros se observó tanto en el grupo control como en el grupo tratado, anticuerpos en el 93% de las muestras. Estos valores concuerdan con lo previamente reportado para infecciones en terneros recién nacidos. Los siguientes muestreos se realizaron hasta completar el seguimiento a los 9 meses de los terneros en donde se observó una prevalencia del 6.6% en el grupo tratado y del 7.7% en el grupo control. Este trabajo de tesis aportó datos sobre la epidemiologia natural de la infección, que deberían ser utilizados para el diseño y prosecución de una estrategia de control. En un contexto de infección natural francamente endémica, la estrategia de uso de anticuerpos como complemento en la toma diaria de leche podría ser valiosa para la reducción de la dinámica en la edad temprana.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 113 h.

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Alvarez, Gabriel Martín
2010

Descripción: La técnica de producción de embriones porcinos in vitro dista de ser óptima. Una de las principales causas es la deficiente maduración del ovocito in vitro. El desconocimiento de las variables involucradas en el proceso de maduración incluye al metabolismo del complejo ovocito-cumulus (COC) y a la regulación de su actividad metabólica por acción de las gonadotrofinas. Las características del cumulus que rodea al ovocito inmaduro han demostrado estar relacionadas con la capacidad de maduración del gameto, sin embargo no hay consenso sobre los criterios utilizados para evaluar el cumulus. Además, no se ha considerado la relación de las características del cumulus con la actividad metabólica del COC. El objetivo general del presente trabajo fue estudiar el perfil metabólico de los COCs porcinos durante la maduración in vitro. Los objetivos particulares fueron: establecer la calidad de los ovocitos inmaduros, evaluar la maduración in vitro en las diferentes categorías de COCs y estudiar el metabolismo de los hidratos de carbono, aminoácidos y lípidos y la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) analizando la injerencia del cumulus y de las gonadotrofinas en los patrones metabólicos durante el proceso de maduración. Los COCs inmaduros fueron clasificados en seis clases dependiendo del tamaño y el aspecto del cumulus que rodea al ovocito (clases A1, A2, B1, B2, C y D). En todas las experiencias realizadas para evaluar la participación del cumulus y de las hormonas en el metabolismo se maduraron COCs pertenecientes a las clases aptas para madurar nuclearmente (A1, A2, B1 y B2) en presencia y ausencia de gonadotrofinas. Se determinaron las variaciones en las concentraciones de glucosa, lactato y amoníaco en el medio de maduración del COC, el contenido de proteínas totales del COC, el contenido de lípidos neutros y el nivel de ROS endógenas del ovocito. Además, se evaluó el número de células del cumulus en las diferentes clases y su variación debida al efecto de las gonadotrofinas durante la maduración in vitro. Se observó un mayor porcentaje de ovocitos inmaduros vivos en las clases A, pero igual porcentaje de ovocitos en estadio de vesícula germinal en las clases A, B y C. El porcentaje de ovocitos que alcanzaron el estadio de metafase II luego de la maduración in vitro fue similar en las clases A y B, pero el porcentaje de ovocitos con capacidad de madurar citoplasmáticamente resultó superior en la clase A1. El número de células que forman el cumulus resultó similar en las clases A, aumentando durante la maduración con gonadotrofinas y disminuyendo al madurar sin estimulación hormonal. En las clases B se halló menor número de células del cumulus y no se apreció variación del mismo durante la maduración independientemente de la presencia de gonadotrofinas. La alta correlación positiva y la relación molar 1:2 entre el consumo de glucosa y la producción de lactato observadas indican que la glucólisis sería el principal destino de la glucosa consumida por el COC porcino durante la maduración in vitro. La actividad glucolítica y la producción de amoníaco resultaron mayores en las clases A y se incrementaron por acción de las gonadotrofinas, aunque con mayor intensidad en la clase A1. Al analizar de modo simultáneo la actividad de la glucólisis y el estadio nuclear luego del cultivo in vitro, no se halló relación entre estos parámetros. La inhibición de la glucólisis con fluoruro de sodio (NaF) y ATP se acompañó con una disminución paralela en el porcentaje de ovocitos que alcanzaron el estadio de metafase II. El AMP no modificó la actividad glucolítica en presencia o ausencia de gonadotrofinas, pero disminuyó el porcentaje de metafase II alcanzado. Se halló mayor contenido de proteínas en los COCs inmaduros de las clases A, el cual no se modificó luego de la maduración sin gonadotrofinas pero se incrementó al suplementar el medio con hormonas. Las clases de COCs evaluadas demostraron tener igual contenido de lípidos y nivel de ROS en el ovocito inmaduro, produciéndose una disminución similar de ambos parámetros en todas las clases luego de la maduración en ausencia o presencia de gonadotrofinas. Además, la adición de cisteína al medio de cultivo ocasionó una mayor disminución en el nivel de ROS de los ovocitos en todas las clases de COCs estudiadas. Si bien la vitalidad del ovocito inmaduro estaría relacionada con las características del cumulus, el estadio de vesícula germinal sería el factor principalmente vinculado con la maduración nuclear. La maduración meiótica podría completarse independientemente de las características del cumulus en las clases A y B, sin embargo la maduración citoplasmática tendría una dependencia mayor con las características del cumulus que rodea al gameto. La glucólisis y el metabolismo de aminoácidos se desarrollarían principalmente en las células del cumulus. El mayor número de células del cumulus explicaría en parte el mayor contenido de proteínas de los COCs inmaduros pertenecientes a las clases A y les permitiría responder al estímulo gonadotrófico durante la maduración in vitro incrementando la intensidad de la vía glucolítica, el catabolismo de aminoácidos y la síntesis de proteínas, sin embargo las particularidades del cumulus clase A1 conferirían una mayor capacidad de respuesta metabólica a las hormonas. El desarrollo de la actividad glucolítica en las células del cumulus sería independiente del progreso meiótico del ovocito, sin embargo la actividad de la vía sería necesaria para que los ovocitos puedan completar la maduración. El contenido de lípidos y el nivel de ROS del ovocito inmaduro no estarían asociados con el tipo cumulus que rodea al gameto. El consumo de lípidos endógenos y la disminución del nivel de ROS en los ovocitos durante la maduración serían independientes de las características del cumulus y de la estimulación gonadotrófica, por lo tanto el metabolismo del ovocito sería responsable de la regulación de estos aspectos metabólicos sin la participación de las células del cumulus. La adición de cisteína al medio de maduración contribuiría al control de la producción de ROS de los ovocitos durante el cultivo in vitro sin estar influido por el tipo de cumulus que rodea al gameto. En conclusión, los ovocitos rodeados por un cumulus íntegro y oscuro tendrían la mayor competencia de maduración in vitro. Las gonadotrofinas mejorarían la maduración de los ovocitos al modular el metabolismo de los hidratos de carbono y de los aminoácidos en las células del cumulus. La lipólisis y la producción de ROS en el ovocito serían independientes de las características del cumulus que lo rodea y no estarían reguladas hormonalmente.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: unknown  (tamaño kb)  Pag. 203 h.

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Gallelli, María Florencia
2015-12-18

Descripción: El dimorfismo sexual tanto morfológico como funcional del eje hipotalamo-hipofisario-adrenal ha sido descripto en diversas especies; así como también existen reportes acerca de la influencia de la estacionalidad sobre dicho eje. Sin embargo, no existen estudios que analicen estas caracteristicas en el perro. Por lo tanto el objetivo del presente estudio fue determinar si en el perro existen variaciones en las hormonas del eje HHA (adrenocorticotrofina , melanotrofina-alfa y cortisol) de acuerdo al sexo, estatus gonadal (castrado o no) y al fotoperiodo (positivo o negativo) en condiciones basales (anestro) y durante el ciclo estral. Asimismo se propuso evaluar si en el perro existe dimorfismo sexual morfológico del área corticotropa de la hipófisis y de la zona fascicular de la corteza adrenal; y si el mismo se ve afectado por la estacionalidad. Además se evaluó si el receptor de estrógenos alfa (RE?) se expresa en los tejidos mencionados y si el receptor de progesterona (RP) se expresa en la zona fascicular adrenal.nEn el caso del análisis hormonal, la población de estudio consistió en perras no castradas (n=11), perros machos no castrados (n=6), machos castrados (n=5) y hembras castradas (n=6).nEl estudio morfológico se realizó mediante un análisis inmunohistoquímico en hipófisis y adrenales obtenidas en fotoperiodo negativo (hembras y machos ) y en fotoperiodo positivo (hembras y machos ), para ACTH en hipófisis, y para RE?, el RP y el receptor para ACTH (melanocortin-2-receptor, MC2R) en la glándula adrenal. Se realizó una doble inmunofluorescencia para poder co-localizar al RE? y a la ACTH (para poder identificar si las células corticotropas expresan dicho receptor). En hipófisis se analizó la proporción de células corticotropas por campo, su área celular, citoplasmática y nuclear, y la densidad óptica de su inmunomarcación. La expresión del RE? y RP se analizó mediante la proporción de células positivas por campo y la del MC2R mediante la densidad óptica. En condiciones basales (machos castrados y no castrados, hembras castradas y hembras en anestro) la ACTH, la ?-MSH y el cortisol no se vieron afectados por el sexo ni el estatus gonadal. Por el contrario, el cortisol se encontró más elevado en el fotoperiodo negativo que en el positivo en todos los grupos (P<0.05), excepto en las hembras en anestro. Durante el ciclo estral, todas las hormonas estudiadas presentaron variaciones (P<0.0001). Las mayores concentraciones de ACTH se observaron en el proestro, mientras que la ?-MSH y el cortisol presentaron las máximas concentraciones en el estro. Las tres hormonas disminuyeron en el diestro. La ACTH y el cortisol se encontraron más elevadas en el fotoperiodo negativo (P=0.04 and P<0.0001, respectivamente), mientras que la ?-MSH fue mayor en el fotoperiodo positivo (P=0.012). En el grupo de perras no castradas, el estradiol y la progesterona correlacionaron con la ACTH (r=0.75, P<0.0001; r=0.34, P<0.01, respectivamente), ?-MSH (r=0.49, P<0.0001; r=0.52, P<0.0001, respectivamente) y el cortisol (r=0.33, P<0.01; r=0.5, P<0.0001, respectivamente). A partir del análisis morfológico se encontró que las hembras presentaron mayor cantidad de células corticotropas/totales por campo en ambos fotoperiodos (p<0.01). El área celular y citoplasmática de las mismas fue mayor en hembras que en machos en ambos fotoperiodos (p<0.001). No se encontraron diferencias significativas en estos parámetros entre estaciones para ninguno de los sexos. La densidad óptica de las células corticotropas fue mayor en hembras que en machos en ambos fotoperiodos (p<0.001); así como también fue mayor en fotoperiodo negativo que en fotoperiodo positivo en ambos sexos (p<0.001). El RE? fue identificado en la zona fascicular adrenal, siendo su expresión mayor en hembras que en machos (p<0.001). La densidad óptica de la inmunomarcación para MC2R fue mayor en hembras que en machos (p<0.001). No se encontró inmunomarcación para RP. En ambos sexos la expresión de los dos receptores fue mayor en fotoperiodo negativo (p<0.001). El RE? fue identificado en algunas células corticotropas, pero dada su baja expresión no se realizó un análisis cuantitativo.nEstos resultados evidencian que existe dimorfismo sexual tanto morfológico como funcional del eje HHA en el perro. Asimismo es la primera vez que se identifica la expresión del RE? en las corticotropas y corteza adrenal en dicha especie, postulándose un sitio de acción para el estradiol. De esta forma el estradiol podría tener un rol regulador sobre el eje HHA. Asimismo se obsevaron variaciones morfológicas y hormonales entre fotoperiodos, que podrían relacionarse con adaptaciones climáticas o metabólicas; las cuales quedan pendientes de estudio.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 145 h.

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Kotsias, Fiorella
2010-04-20

Descripción: El herpesvirus bovino 1 es un alfaherpesvirus que infecta al ganado bovino produciendo cuadros clínicos respiratorios, genitales y/o reproductivos. Es un virus neurotrópico que establece latencia en ganglios sensoriales, y la reexcreción viral luego de la reactivación de la infección latente es responsable de la perpetuación del agente en los rodeos. En nuestro país la seroprevalencia puede alcanzar el 80% y la vacunación es la estrategia utilizada para el control de la enfermedad. En nuestro laboratorio se desarrolló, a partir de la cepa BoHV-1.1 Los Angeles (LA), un virus recombinante mediante el reemplazo alélico del gen que codifica para la glicoproteina E por el gen lac z, denominada BoHV-1?gE?gal, para su utilización como vacuna marcadora. La caracterización genómica de la cepa BoHV-1?gE?gal verificó la ausencia de cambios en las regiones flanqueantes al gen gE y permitió identificar específicamente los sitios donde ocurrió el intercambio alélico. El estudio de RFLP mostró que esta cepa posee un patrón diferente al esperado, indicando modificaciones en ciertos sitios de restricción. El estudio del comportamiento in vitro mostró que esta cepa es menos eficiente en la producción de partículas virales infectivas así como en la dispersión viral respecto a la cepa parental BoHV-1 LA y a otras cepas gE-, tanto en el mecanismo de pasaje célula a célula como en el de liberación de partículas virales infectivas al medio extracelular. El virus BoHV-1?gE?gal se encuentra atenuado en su virulencia en el hospedador natural, y esta atenuación es mayor que la descripta para otras cepas gE-, ya que si bien induce una respuesta inmune humoral sérica y de mucosas, no se excreta ni produce enfermedad clínica luego de la infección intranasal, así como tampoco establece una infección latente ni se reactiva experimentalmente. La experiencia de infección viral con BoHV-1 y la metodología desarrollada en este trabajo aplicada al análisis de muestras provenientes de animales infectados constituyen una valiosa herramienta para el estudio de la patogenia de virus genéticamente modificados, virus recombinantes y aislamientos de campo. Por otro lado, resulta una contribución al conocimiento de la cepa parental BoHV-1 LA que se utiliza en las experiencias de desafío viral. Los resultados de este trabajo de Tesis, conjuntamente con los antecedentes de inmunogenicidad, protección frente al desafío viral e inocuidad de la cepa BoHV-1?gE?gal, sumado a la creciente tendencia mundial en el uso de vacunas marcadoras vivas en el control de la enfermedad causada por BoHV-1, indican que la cepa BoHV-1?gE?gal podría incorporarse como inmunógeno vivo en los esquemas de vacunación de futuros planes de control y erradicación de BoHV-1 en nuestro país sin riesgos de producir enfermedad, latencia o diseminarse a otros animales, reduciendo la incidencia de enfermedad respiratoria bovina.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 171 h.

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Alvarez, Melina Andrea
2015-08-07

Descripción: El partido de Tres Arroyos se ubica en la zona sudoeste de la provincia de Buenos Aires. Éste se caracteriza por ser una zona de agricultura intensiva con una elevada producción de cereales de invierno y oleaginosas. Anualmente se aplican elevadas cantidades de diferentes pesticidas entre los cuales se encuentran los organofosforados, particularmente el clorpirifos. El efecto de los insecticidas ha sido ampliamente estudiado a nivel mundial dado la gran preocupación de los efectos que muchos de estos compuestos producen sobre los organismos no-blanco y el deterioro que generan sobre la calidad de los recursos hídricos. Los organismos que habitan estos cuerpos de agua son afectados por el clorpirifos, y otros compuestos organofosforados, a nivel del sistema nervioso y otras vías metabólicas que son cruciales para su supervivencia. En Argentina existen algunos trabajos que se refieren a este insecticida, pero ninguno que se haya realizado en nuestra zona de estudio como así tampoco en los cuales se considere su afinidad o tiempo de vida media en suelos de nuestra región. Entender la diseminación y el comportamiento de este insecticida en el ambiente es clave para determinar su destino e impacto sobre el mismo. Por ello, a lo largo de esta tesis se han realizado estudios de interacción y recuperación de clorpirifos, puro y en una formulación comercial, con matrices sólidas (suelos, sedimentos) de diferentes características físicoquímicas; se ha evaluado el tiempo de vida media en suelos a distintas concentraciones iniciales; se abordó el análisis físico-químico del agua y la concentración de nutrientes y clorpirifos, relacionando los resultados con las actividades agropecuarias de la zona; se ha estudiado también su existencia en sedimentos y biota acuática; se han analizado las respuestas de biomarcadores bioquímicos como herramientas de monitoreo en larvas de Rhinella arenarum expuestas hasta 96 horas a muestras de agua de Claromecó y Tres Arroyos. Finalmente se evaluó el riesgo que este insecticida estaría generando a las concentraciones halladas en nuestra zona de estudio. Los estudios de comportamiento sobre matrices sólidas muestran que el clorpirifos puro (98%) se recupera menos cuando los suelos poseen alto contenido de materia orgánica y bajo pH. Los porcentajes de recuperación del clorpirifos variaban según las concentraciones iniciales empleadas, siendo menores a mayor concentración inicial del producto. Al analizarse el comportamiento de un formulado comercial (48% de clorpirifos), se observó el efecto contrario, ya que los porcentajes de recuperación aumentaron con el aumento de la concentración inicial aplicada sobre el suelo, hasta que se alcanzó una concentración aproximada de 25 ppm, a partir de la cual la recuperación comenzó a disminuir. Cuando se estudió la persistencia de esta formulación sobre un suelo agrícola de la provincia de Buenos Aires se observaron tiempos de vida media de 15 y 6 días para las concentraciones de 3 y 6 ppm respectivamente. En ambos casos se encontró una degradación del 99,9% a los 21 días. En relación a la concentración de clorpirifos en agua y sedimentos del partido de Tres Arroyos, se observó una variación estacional con los tipos de cultivos producidos en la zona. Los mayores valores de concentración en agua se observaron durante el año 2009, tanto en las campañas de invierno como de verano. En cambio en los sedimentos, las concentraciones fueron más variables y poco predecibles. En los estudios realizados sobre la biota del lugar, los resultados en ejemplares de Australoheros facetus (chanchita), Oligosarcus jenynsii (dientudo), Rhamdia quelen (bagre sapo), Mugil sp. (lisa) y Cyrtograpsus angulatus (cangrejo de las rocas) mostraron que la concentración de clorpirifos variaba con el tipo de tejido y el contenido graso de los mismos. En todas las especies de peces analizadas se observó una mayor concentración del insecticida en cerebro, hígado y gónadas que son tejidos con alto contenido graso. En O. jenynsii y A. facetus se observó que los machos se encontraban el doble de contaminados que las hembras, mientras que en la especie R. quelen se observó lo inverso, siendo en éstas de diez veces mayor. Por otra parte, las mayores concentraciones se hallaron en ejemplares de R. quelen (Bagre sapo) y A. facetus (Chanchita), que son especies que viven asociadas al fondo. El cangrejo de las rocas mostro valores de clorpirifos de hasta 157 veces menor que las especies de peces y no hubo diferencias entre sexos. Las respuestas de los biomarcadores bioquímicos en larvas de Rhinella arenarum mostraron que, si bien las aguas de la zona presentaron trazas de clorpirifos, no se afectó al blanco primario AChE. Sin embargo, se obtuvieron respuestas significativas de CE, GST y GSH además de una fuerte respuesta antioxidante de CAT, aunque no descartamos la posibilidad de presencia de otros contaminantes no detectados en el análisis químico. En el caso del estudio de niveles de nutrientes en agua, se llegó a la conclusión que estos dependen de una multiplicidad de factores y que son de muy difícil predicción. Los resultados mostraron por un lado, que los rangos de concentración de nitratos no variaron en las campañas de invierno y verano, y por el otro, que la concentración de fósforo fue sumamente elevada durante todo el año con picos en primavera y verano. Finalmente, nuestros resultados revelan que por un lado, existen niveles de riesgo agudo y crónico elevados para algunas especies de invertebrados y vertebrados acuáticos, como así también un riesgo potencial para la salud de la población local.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 275 h.

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Gulin, Julián Ernesto Nicolás
2019-04-05

Descripción: La enfermedad de Chagas, endémica del continente americano, es una antropozoonosis causada por el protozoario Trypanosoma cruzi (T. cruzi) que afecta aproximadamente a 10 millones de personas provocando cerca de 10.000 muertes por año debido a complicaciones cardiovasculares y/o gastrointestinales. Los medicamentos disponibles, nifurtimox y benznidazol, se asocian a una frecuencia relativamente alta de eventos adversos, siendo los más comunes náuseas, anorexia, cefalea, molestias gastrointestinales y artralgias. También es común la aparición de eritema y prurito. Estos efectos, sumado a la prolongada duración del tratamiento (hasta 2 meses) y a la percepción de limitada efectividad durante la fase crónica, son causas frecuentes de abandono del tratamiento. En este escenario, la búsqueda de alternativas terapéuticas seguras y accesibles para el tratamiento de la enfermedad de Chagas es un objetivo pendiente. Existe escaso interés por parte de la industria farmacéutica en investigación y desarrollo de medicamentos para la enfermedad de Chagas, en gran medida debido a las características socioeconómicas de la población afectada. El reposicionamiento o reorientación de fármacos y la terapia combinatoria surgen como alternativas al desarrollo de nuevas moléculas, e implican una inversión de recursos significativamente menor. En este trabajo se seleccionaron fármacos disponibles para uso clínico y se desarrollaron métodos de evaluación in vitro en in vivo para determinar la actividad anti-T. cruzi de las drogas candidatas. Se evaluaron treinta y ocho fármacos sobre estadios tripomastigote y amastigote in vitro con un sistema de cribado de bajo rendimiento utilizando la cepa VD de T. cruzi, caracterizada previamente. Además, se estandarizó y optimizó un sistema de cribado de alto rendimiento con la cepa Dm28c/pLacZ, con el cual se evaluaron otras treinta y ocho drogas. A partir de estos resultados, cinco drogas (nitazoxanida, pirimetamina, ivermectina voriconazol y miltefosina) fueron evaluadas en un modelo murino de infección aguda con T. cruzi. Los efectos tripanocidas y/o tripanostáticos de las drogas estudiadas permiten confirmar la actividad anti-T. cruzi de los fármacos disponibles para uso clínico, validando la estrategia del reposicionamiento para identificar nuevos compuestos candidatos para el tratamiento de la enfermedad de Chagas.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: unknown  (tamaño kb)  Pag. 215 h.

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Raschia, María Agustina
2015-11-13

Descripción: Las razas bovinas Holando y Jersey son dos de las razas productoras de leche más importantes a nivel mundial y las principales en nuestro país. El objetivo del trabajo de tesis fue realizar un análisis exploratorio que permitiera identificar variantes alélicas asociadas a la producción de leche en un rodeo comercial con vacas Holando y cruzas Holando x Jersey. El material utilizado consistió en una base de datos de controles lecheros y registros de pedigrí de 1.859 bovinos pertenecientes a 25 familias de medias hermanas paternas de 16 tambos de la cuenca lechera central de la Argentina. A través de un abordaje con genes candidatos, todos los animales se genotipificaron para 56 SNPs de genes seleccionados por estar relacionados con características productivas y calidad de leche en bovinos mediante el sistema SNPlex®. Por otra parte, en 821 animales, se determinaron los genotipos de 12.460 SNPs incluidos en un microarreglo de mediana densidad y localizados en las regiones cromosómicas que contenían los genes candidatos seleccionados previamente. Con la información genotípica y los valores de cría (EBV) para producción de leche acumulada a 305 días durante la primera lactancia, estimados a través de un modelo lineal mixto, se realizó un análisis de asociación mediante la estrategia FASTA-GC del paquete GenABEL de R. Luego de realizar los respectivos controles de calidad de los genotipos, 10.227 SNPs se utilizaron en el análisis de asociación. Este análisis permitió la detección de 12 SNPs asociados al EBV para producción de leche en los BTAs 1, 20, 23 y 24. Por su cercanía a estos SNPs y por estar relacionados con la producción o composición de la leche, se secuenciaron regiones específicas de los genes PRMT2, BTN1A1 y S100B en 34 vacas con EBVs extremos. Con las secuencias obtenidas se exploró la presencia de polimorfismos que pudieran contribuir a las diferencias observadas en los valores de EBV para producción de leche de la población bajo estudio. Para las regiones PRMT2, BTN1A1_A y BTN1A1_B se obtuvo el 7%, el 22% y el 24% de los SNPs reportados, respectivamente, mientras que en S100B no se halló ningún SNP. Nueve de los SNPs del gen BTN1A1 generan mutaciones con cambio de sentido. Algunos de los SNPs hallados muestran diferencias apreciables de frecuencias alélicas en animales con diferentes fenotipos (bajo y alto EBV para producción de leche). Este análisis ha revelado tendencias que sería interesante estudiar en una población más numerosa, especialmente para el caso de SNPs en exones que dan lugar a un cambio en la estructura proteica que pueda afectar directamente la producción y las características composicionales de la leche. Los resultados obtenidos son de interés para la caracterización genotípica de los bovinos de Argentina de raza Holando y cruzas Holando x Jersey por cuanto la población analizada es representativa de la genética utilizada actualmente en la actividad tambera y podría constituir parte de una población de referencia para la utilización de la metodología de Selección Genómica en mejoramiento de bovinos para leche del país.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 221 h.

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Gil, Susana Beatriz
2017-04-10

Descripción: Los efectos ambientales provocados por los diferentes factores de producción se manifiestan como cambios en distintos componentes de los sistemas agropecuarios así como en sus funciones ecológicas, por ejemplo, ciclado de nutrientes. El grado de intensificación de los sistemas de producción animal puede definirse a partir de la relación entre la cantidad de unidades ganaderas e insumos asociados, y la superficie que ocupan. Desde este punto de vista, la producción ganadera sobre forraje califica como ?sistema extensivo?, mientras que el engorde a corral como ?sistema intensivo?. El objetivo general de esta tesis fue identificar y construir indicadores que pudieran ser base para elaborar índices ponderados que sirvan para diferenciar los sistemas de producción de carne bovina según niveles de intensificación en el uso de los nutrientes. Se identificaron y construyeron diversos indicadores; se analizó e integró la información originada por los indicadores seleccionados; se compararon los sistemas según indicadores de manejo de nutrientes e identificaron rangos de variación de los indicadores elaborados para cada grupo de sistemas de producción de carne. Para caracterizar los sistemas de producción se utilizaron Diagnóstico Estático y Flujogramas, considerando la selección de las unidades de estudio, reconocimiento de las vías de ingreso/egreso de nitrógeno y fósforo a los sistemas de producción y la recopilación de información productiva y agroecológica. El área de estudio se circunscribió a la provincia de Buenos Aires, Argentina, específicamente a los partidos Carmen de Areco, Trenque Lauquen, Chascomús, Maipú, Balcarce y Laprida. Se relevaron y seleccionaron predios, módulos de experimentación y corrales de encierre para obtener información sobre los distintos tipos de sistemas de producción de carne: extensivo con nula o mínima suplementación, semiintensivo (extensivo con suplementación) e intensivo en corrales de encierre, algunos complementados con actividad agrícola (mixtos). Se recopiló información del período 1996-2014 para obtener registros de varios ejercicios para la descripción de las transferencias internas de nutrientes. La información obtenida por unidad de estudio y ejercicio productivo fue reportada como una observación, identificada como ?Unidad de Análisis? (UdA). Para sistema Extensivo se relevaron 5 unidades de estudio que aportaron 31 UdAs, para Semiintensivo 13, que aportaron 17 UdAs, para Intensivo 35 UdAs y para Planteos Mixtos, 4 UdAs, totalizando 57 unidades de estudio y 87 UdAs. La recopilación de la información se realizó a través de encuestas semiestructuradas en entrevistas; estadísticas zonales; bibliografía y análisis de laboratorio para contenido de nitrógeno/fósforo de los insumos y productos agropecuarios. Se realizó análisis estadístico descriptivo, correlación de Spearman, comparación por la Prueba de la Mediana y multivariado por Componentes Principales y Conglomerados. Para la descripción y caracterización de los sistemas se seleccionaron Indicadores de Sustentabilidad Agroambiental relacionados con el manejo y uso de nitrógeno y fósforo, y con la alimentación, algunos desarrollados específicamente (Incremento por Transferencia, Balance por nutriente en producto Producido, Diferencias entre Balances por nutriente), otros adaptados particularmente para los sistemas de producción de carne y otros existentes, como Balance de Nutrientes. En los planteos mixtos con encierres a corral, los valores individuales de Balances prediales y Balances corral permitieron estimar los excedentes de nitrógeno y de fósforo, y sus transferencias internas a través del Índice Incremento por Transferencia, el que contribuyó a caracterizar y diferenciarlos según la homogeneidad de la distribución del nutriente ingresado al predio. A través de un conjunto de cinco Indicadores se pudieron agrupar a los sistemas Intensivos(In) y diferenciarlos de los sistemas de base Pastoril -Extensivos(Ex) y Semiintensivos(Se)-. Estos fueron: Balance de Nutriente por hectárea (Bal/ha), Balance por producto Producido (Bal-Prod-Pr), Balance por kilo de peso vivo por día (Bal/kgPV), Ineficiencia de Uso de Nutrientes (IeUN) y Eficiencia de Uso de Nutriente externo por la Producción (EUNexS-Pr). Se presentan los rangos de valores descriptivos. Para Nitrógeno, los sistemas Extensivos presentaron valores menores que los Semiintensivos para Bal N/ha(kgN/ha/dia): Ex 0,04-0,09 y Se 0,19-0,90; y para Bal/kgPV(gN/kgPV/día): Ex 0,10-0,23 y Se 0,28-0,98, y mejor eficiencia de uso, EUNexS-Pr(%): Ex: 9-20 y Se: 6-13. El Intensivo tuvo los valores más altos de Bal N/ha: 6,50-59 kgN/ha/día y bajos de IeUN: 21-59%. El menor valor de Bal-Prod-Pr fue 65 gN/kgPV-Pr en Intensivos y el mayor, 385 gN/kgPV-Pr en Semiintensivos. Para Fósforo, la diferenciación resultó menos acabada, contribuyendo los mismos indicadores a excepción de uno, el Bal-Prod-Pr. En su lugar, resultó significativo Balance por Nutriente en producto Producido. En los sistemas base Pastoril, Bal N resultó siempre positivo y Bal P con casos negativos, especialmente Extensivos con manejo de la cría poco intensificado. En Semiintensivos, mayores ingresos de Nitrógeno/Fósforo por alimentos originaron mayores Bal N-Bal P con consecuentes mayores Producciones de carne/hectárea. En Intensivos, dichos ingresos resultaron buenos predictores de los Balances corral. Se lograron seleccionar indicadores que permiten un primer avance en la caracterización de los sistemas de Producción de carne bovina para la provincia de Buenos Aires, en base al manejo del nitrógeno y/o del fósforo en relación con la sustentabilidad ambiental. Se realizaron aportes para futuros estudios con variedad más amplia de recursos alimenticios y/o formas de intensificación, o para otras zonas del país, y para la sistematización de la información y desarrollo de modelos productivos. Entre las implicancias prácticas, la intensificación a partir de fertilizantes debería armonizar productividad con Bal N-P que no resulten en excedentes importantes, y el aumento de Producción de carne a partir de cultivos anuales debería evaluarse en consonancia con los valores del Bal P. El indicador Bal/kgPV permitirá comparar el efecto de las dietas en la excreción ambiental, y al relacionarlo con densidad animal del corral se tendrá una aproximación a la carga de nutrientes que recibe el mismo. El conocimiento de estos indicadores en los sistemas de producción permitirá estar, de ser necesario, en condiciones más avanzadas para cumplimentar requerimientos de tipo ambiental.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 457 p.

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Barrionuevo, Florencia Mariel
2019-03-21

Descripción: La fiebre aftosa (FA) es una enfermedad viral infectocontagiosa de curso agudo que se caracteriza por producir lesiones vesiculares en tejidos de la mucosa oronasal (incluyendo lengua, encías y paladar), ubres, espacios interdigitales y rodetes coronarios de las pezuñas de los animales infectados. Su agente etiológico, el virus de la fiebre aftosa (VFA), es un virus perteneciente a la familia Picornaviridae que afecta a animales biungulados, incluyendo por tanto a bovinos, porcinos, caprinos y ovinos domésticos, junto con numerosas especies silvestres que pueden actuar como reservorios bajo determinadas condiciones ecológicas. La virulencia, el amplio rango de huéspedes, la diversidad de variantes y la alta capacidad infecciosa y de contagio del VFA, explican su presencia y re-emergencia en diversas partes del mundo y la convierten en un problema sanitario de escala global. La enfermedad genera enormes pérdidas económicas a la industria ganadera debido al cierre obligado de los mercados externos y a pérdidas considerables en el mercado interno, asociadas a la disminución de la producción, al sacrificio y al bloqueo del movimiento de animales. En trabajos previos de nuestro grupo de investigación, se evidenciaron respuestas inmunes de anticuerpos tanto a nivel sistémico como en mucosas, observables luego de la infección con VFA, así como de la vacunación sistémica en bovinos, siendo su ocurrencia, por lo tanto, independiente de la ruta inicial de contacto con el antígeno viral. Dentro de este panorama, la contribución relativa a la inmunidad protectora de los diferentes mecanismos inmunes potencialmente implicados en la respuesta generada, es difícil de discernir. La presente tesis doctoral plantea como hipótesis de trabajo que los anticuerpos sistémicos, administrados mediante la inmunización pasiva de terneros seronegativos para VFA, son capaces de evitar la diseminación del virus luego de la infección por vía aerógena y en ausencia de otros mecanismos inmunes. Para esto, inicialmente se realizaron una serie de experimentos donde se ajustaron las condiciones para la inmunización pasiva contra el VFA en terneros. En estos procedimientos se utilizaron plasmas de bovinos vacunados con formulaciones tetravalentes comerciales anti-aftosa de serie. Los mismos fueron reunidos en una sola fracción y diferentes volúmenes de esta preparación fueron transferidos a terneros seronegativos. Una vez realizado el procedimiento, se midieron diversos parámetros de inmunidad humoral específicos contra el VFA, entre las 0 h y los 30 días post-transferencia. A partir de estos resultados, se determinó el volumen de plasma requerido para llevar a cabo la inmunización pasiva, así como los protocolos de administración y los tiempos adecuados para realizar las infecciones posteriores en los animales pasivamente inmunizados. Para el segundo experimento, se utilizaron vacunas monovalentes de la cepa O1/Campos de alta carga antigénica, con las que se inmunizaron bovinos seronegativos (n=8). Se obtuvo plasma de cuatro de estos animales a los 7 días post-vacunación (dpv) y a los 26 dpv en los cuatro restantes. Así se conformaron dos pooles de plasma inmunes (7 y 26 dpv) que diferían tanto en la composición isotípica de las inmunoglobulinas, así como en los títulos de anticuerpos totales y neutralizantes anti-VFA. En el caso del pool de plasma de 7 dpv el isotipo predominante detectado fue la IgM y el título de anticuerpos neutralizantes fue 1,6; mientras que para el pool de 26 dpv, se detectaron ambos subtipos de IgG (1 y 2) y niveles menores de IgM, con un título de anticuerpos neutralizantes de 2,7. Los animales pasivamente inmunizados se infectaron por vía oronasal y estos resultados se compararon con los obtenidos en animales vacunados e infectados a los mismos tiempos post-vacunación (7 y 26 dpv). Nuestros resultados demostraron que los anticuerpos circulantes previenen la generalización de la fiebre aftosa solo en el caso de los animales pasivamente inmunizados con plasma de 26 dpv, ya que los animales que recibieron el plasma de 7 dpv mostraron signos clínicos de la enfermedad luego de la infección aerógena. Esto indicaría que, en ausencia de otros mecanismos inmunitarios adaptativos preexistentes, los anticuerpos circulantes en sangre efectivamente son capaces de evitar el desarrollo de la enfermedad, aunque existe un umbral de título de anticuerpos por debajo del cual se desencadena la enfermedad luego de la infección oronasal. Para el caso de los animales vacunados, se obtuvo una protección total de los mismos, tanto en los infectados a los 7 como a los 26 dpv. Esto ocurrió aun cuando el animal vacunado 7 días antes de la infección presentaba, al momento del desafío, niveles de anticuerpos sistémicos neutralizantes similares a los de los animales inmunizados pasivamente con plasma de 7 dpv y que mostraron signos clínicos de fiebre aftosa post-infección. El estudio de las respuestas de anticuerpos post-infección, tanto a nivel sistémico como en mucosas respiratorias, indicó que la vacunación promovió la generación de una respuesta de anticuerpos rápida tras la exposición al virus, presentando la misma un perfil de respuesta de tipo secundaria. En ambos casos, los infectados a los 7 dpv o a los 26 dpv, mostraron rápidos cambios de los isotipos predominantes de las inmunoglobulinas VFA-específicas, así como un aumento de los títulos de anticuerpos y de la avidez en los sueros obtenidos post-infección. Interesantemente, estas observaciones se verificaron tanto a nivel sistémico como local, en linfonódulos drenantes del tracto respiratorio. En conjunto estos resultados indican que los anticuerpos circulantes pueden ser suficientes para evitar la generalización de la enfermedad en bovinos infectados por la vía oronasal, aun en ausencia de otros mecanismos activos de inmunidad específica. A su vez, la caracterización de las respuestas de anticuerpos posteriores al desafío, tanto a nivel sistémico como local, reveló que la inmunización sistémica con vacunas convencionales anti-aftosa promovió rápidamente un aumento del título de anticuerpos, así como de la avidez de los sueros inmunes y la modificación en los isotipos en las inmunoglobulinas predominantes, todos cambios asociables a respuestas anamnésicas contra el virus. Se resalta el carácter protector de que estos procesos frente al establecimiento de la enfermedad, y el hecho que los mismos se verificaron en tiempos muy cercanos a la vacunación (7 dpv) y aun cuando la infección aerógena se realizó en presencia de títulos bajos de anticuerpos neutralizantes.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 140 h.

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Langellotti, Cecilia Ana
2012-03

Descripción: La Fiebre Aftosa es una enfermedad viral aguda y altamente contagiosa, causada por el Virus de la Fiebre Aftosa (VFA). La enfermedad afecta a bovinos, ovinos, cerdos y varias especies silvestres, se caracteriza por la aparición de fiebre y lesiones vesiculares localizadas en la cavidad bucal, lengua y alrededor de las pezuñas. Desde un punto de vista económico, es la enfermedad más importante del ganado a nivel mundial. Las consecuencias económicas de la infección se deben al deterioro físico y productivo más que a pérdidas por mortalidad, pero para los países exportadores de animales y de productos animales, como Argentina, las pérdidas de mayor importancia se deben a las fuertes restricciones en el comercio internacional. El VFA interacciona con las células dendríticas, tanto de sus huéspedes naturales como de los ratones, pero el impacto de esta interacción sobre la respuesta inmune adaptativa es controversial. Las vacunas utilizadas actualmente contra la fiebre aftosa contienen la forma inactivada del virus. Poco se conoce sobre las diferencias entre el virus infeccioso y el inactivado, en términos de subpoblaciones de células dendríticas involucradas en la activación de la respuesta inmune. En el presente trabajo de tesis, llevado a cabo en el modelo murino, mostramos como la infección con el VFA induce inmunosupresión temprana, a nivel de reducción en el número de células dendríticas esplénicas de las diferentes subpoblaciones y la inhibición de la activación y maduración de las mismas. Además, la infección induce la secreción de bajos niveles de IFN-a en sangre periférica. La linfoproliferación se encuentra inhibida en estadios tempranos de la infección, pero la respuesta celular se reestablece luego de cinco días postinfección. Por el contrario, el virus inactivado provoca un aumento del porcentaje de células dendríticas plasmacitoides en bazo y la producción de IL-10, que desencadena la activación de una respuesta de células T regulatorias en los ratones
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: unknown  (tamaño kb)  Pag. 128 h.

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Saccomanno, Daniela Marcela
2015-11-17

Descripción: En medicina veterinaria, y particularmente en los pacientes felinos, las enfermedades orales, y en especial las dentales, ocupan un lugar muy importante en la práctica clínico-quirúrgica diaria. Entre las que afectan principalmente al diente y su aparato de sostén se destacan la enfermedad periodontal (EP) y las lesiones odontoclásticas reabsortivas (LOR). Existen numerosas investigaciones que han utilizado el microscopio electrónico (MEB) para describir las características de los tejidos dentales en humanos. Sin embargo, sólo existen escasos reportes sobre las características del cemento y la dentina normales en la especie felina, y ninguno que las asocie con las distintas regiones del diente y las diferentes fuerzas oclusales que estos soportan. En relación con las enfermedades bucodentales, no se encontraron trabajos que relacionen la EP con alteraciones en la arquitectura del cemento ni la dentina pulpar, ni describan la presencia de reabsorciones radiculares a causa de la EP, no asociadas con LOR. Por ello, el objetivo general de esta investigación fue describir las características estructurales de la dentina y del cemento en dientes permanentes y maduros de gatos (normales y afectados naturalmente por LOR y EP (así como sus modificaciones frente a la terapia periodontal), con fines clínicoterapéuticos y de investigación, empleando particularmente el MEB y el análisis digital de imágenes. El trabajo de investigación fue avalado por el CICUAL (FCV-UBA), con el consentimiento informado de los propietarios de los pacientes incluidos en el estudio y se dividió en 4 partes: a) Estudio de la dentina normal y patológica: se incluyeron 48 dientes sanos, sometidos a distinta fuerza oclusal, obtenidos de 6 gatos adultos jóvenes y 6 gatos adultos mayores. Se observaron diferentes formas de los túbulos dentinarios, pero la redondeada-elíptica fue predominante. El diámetro medio de los conductillos del tercio radicular cervical fue de 1,0581 ± 0,2590 ?m, mientras que en el tercio 2 apical fue de 1,0248 ± 0,2931 ?m. A partir de los resultados obtenidos, se concluye que el diámetro, la superficie y densidad de los túbulos dentinarios disminuyen en sentido corono-apical y que su densidad disminuye con el aumento de la edad. Respecto de la dentina de dientes involucrados en EP, se evaluaron 8 colmillos superiores afectados. En todos los casos, los diámetros y las superficies de los conductillos dentinarios presentaron valores inferiores a los obtenidos a partir de dientes normales, mientras que la densidad tubular fue mayor en dientes afectados. Paralelamente, se estudió la dentina de 9 dientes afectados por LOR, en los cuales el diámetro y la superficie de los conductillos presentaron valores inferiores a las mediciones obtenidas de dientes normales, mientras que la densidad tubular fue menor en el tercio cervical y mayor en el tercio apical radicular en los dientes afectados con respecto a los normales. b) Estudio del cemento normal y patológico: se trabajó sobre 12 gatos, de los que se obtuvieron 75 raíces dentales, provenientes de 54 dientes normales que soportaban diferentes fuerzas oclusales (máxima, media, mínima). A través de las observaciones, pudo verificarse que la superficie del cemento presenta variaciones, según la morfología y disposición de las fibras de Sharpey, cuya densidad decrece en dirección corono-apical. Las mediciones de las fibras extrínsecas arrojaron un diámetro global para todas las fibras de 4,43 ± 1,39 ?m. En todos los tercios, el diámetro de las fibras extrínsecas de los dientes sometidos a fuerzas oclusales máximas fueron significativamente mayores a los de los otros dos grupos. Para la caracterización del cemento afectado por EP severa, se estudiaron 36 raíces provenientes de 14 gatos adultos, pudiéndose establecer una relación entre esta condición y la presencia de reabsorciones radiculares. Los tercios cervical y medio fueron los más afectados (incluidas lesiones en la furca radicular y unión cemento-esmalte) y algunas de las reabsorciones presentaron una profundidad suficiente como para involucrar a la dentina radicular. Además, fueron analizadas 20 raíces de 18 dientes con LOR, provenientes de 14 gatos afectados. Las reabsorciones radiculares observadas se presentaron predominantemente en el tercio cervical de la raíz, particularmente en la furca o UCE (en dientes unirradiculados). 3 c) Efecto de los tratamientos periodontales sobre la superficie radicular: seutilizaron 27 raíces correspondientes a 20 dientes con EP (grados 3 y 4). Se compararon dos métodos terapéuticos: limpieza manual (con cureta de Gracey Nº 11/12) y limpieza mecánica, con cavitador ultrasónico (US). Asimismo, un grupo de cada tratamiento fue sometido a un pulido con instrumental rotatorio y copa de goma. Los mejores resultados se obtuvieron con la aplicación de US y el pulido no incidió significativamente en los resultados. d) Epidemiología de las enfermedades bucodentales en el gato: se relevaron los datos de 103 pacientes felinos de nuestro medio, completando planillas ad-hoc. Los resultados obtenidos más significativos fueron: se corroboró una alta prevalencia de enfermedad periodontal (91,26%) y de LOR (41,8%), siendo los grupos etarios más afectados los comprendidos entre los 10 y 14 y entre los 6 y 14 años, respectivamente. No se halló asociación entre EP o LOR y enfermedades sistémicas, aunque sí pudo correlacionarse la presencia de EP y el consumo de dieta blanda. El empleo del método radiográfico, permitió detectar 69 lesiones, no percibidas durante el examen clínico, o complementar y ampliar la información brindada por éste. Es de esperar que los datos aportados por este trabajo de investigación, contribuirán a un mayor y mejor desarrollo de la odontología en el gato, especie relegada en la medicina veterinaria en general y en la práctica odontológica en particular.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 264 h.

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Colavecchia, Silvia
2011-03

Descripción: .La vacunación es el método más efectivo para controlar una infección.Las vacunas efectivas inducen una respuesta inmune protectora, activando linfocitos T y B, que convertidos en células de memoria controlan infecciones producidas por el patógeno incluido en la formulación de la vacuna. Las vacunas elaboradas con virus o bacterias inactivados o a subunidades tienen la capacidad de generar una respuesta inmune específica eficiente, pero a veces débil ya que no se multiplican en el huésped. Es por eso, que requieren el uso de adyuvantes que potencien la respuesta inmune. La selección de un adyuvante apropiado no solamente permite aumentar la respuesta inmune sino que también permite modular el isotipo de inmunoglobulina que se produce y también el tipo de perfil, Th1 o Th2. El Lipoarabinomanano (LAM) se encuentra unido de forma no covalente a la membrana plasmática de las micobacterias y se extiende hasta el exterior de la pared celular. Esta molécula juega un papel muy importante en la fisiología de las bacterias así como también en la modulación de la respuesta inmune del huésped durante la infección. Numerosos grupos de investigadores describen los efectos adyuvantes y moduladores de las micobacterias induciendo la respuesta hacia un perfil Th1 cuando se agregan a vacunas. El objetivo de este trabajo de tesis fue evaluar el efecto de la aplicación de ovalbúmina (OVA) junto con LAM y adyuvante de Freund incompleto (AFI) en la respuesta inmune celular y humoral de bovinos específica a OVA. Se extrajo y purificó LAM de Mycobacterium avium subsp. avium utilizando una extracción química publicada previamente por Hamasur et al. (1999), y se obtuvo un rendimiento similar al obtenido por dichos autoresMediante el uso del anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente LAM de Mycobacterium tuberculosis se confirmó que la estructura del LAM obtenido a partir de cultivos de Mycobacterium avium subsp. avium conserva un alto grado de similitud antigénica con el de Mycobacterium tuberculosis. Se utilizaron 22 terneros mestizos de entre 10 y 12 meses de edad los cuales fueron asignados al azar a 4 grupos de tratamiento, G-AFI, inmunizados con PBS y 1 mL de AFI, G-LAM, inmunizados con LAM 1 mg/dosis y AFI, G-OVA, inmunizados con OVA (1 mg/dosis) y AFI, y GOVALAM, inmunizados con OVA, AFI y LAM. Se inmunizaron en forma subcutánea a los días 0, 21 y 42. Dado que una de las limitantes más importantes del uso de adyuvantes es el posible efecto tóxico directo o indirecto sobre los productos derivados al consumo humano se evaluaron una serie de parámetros fisiológicos a fin de controlar la formulación del inmunógeno utilizado. El análisis de los parámetros evaluados (valores hematológicos, fórmula leucocitaria absoluta, perfil de proteínas séricas, ganancia de peso, reactividad a derivado proteico purificado de Mycobacterium avium subsp. avium (PPA)) indicó que el tratamiento con LAM no indujo alteraciones detectables, esto podría constituir un primer acercamiento a la evaluación de la inocuidad del inmunomodulador. Se evaluó la respuesta inmune innata a través de la detección de la producción de intermediarios reactivos de oxígeno en células periféricas adherentes a tiempo 0 (preinmunización) y a tiempo final (15 días post-tercera inmunización) y se ha detectado una disminución de la producción de los intermediarios reactivos del oxígeno en el grupo G-OVALAM evaluado a tiempo final. La modulación producida en la respuesta inmune celular se evaluó a través de la proliferación de células mononucleares estimuladas con mitógenos y antígenos, las subpoblaciones de linfocitos en sangre periférica, la producción de IFN? a tiempo 0 y tiempo final y la hipersensibilidad cutánea. específica. Se detectó un incremento en la respuesta proliferativa de aquellos animales pertenecientes al grupo G-OVALAM indicando que el LAM incrementa la respuesta inmune celular específica y con mitógenos como ConA. Se ha detectado un aumento en la producción de IFN? en sobrenadantes de cultivo de células mononucleares estimuladas in vitro con OVA y ConA, en los animales tratados con LAM con niveles de entre 600 y 800 pg/mL. Se obtuvo además, un incremento en el porcentaje de células con el marcador CD25 en superficie. La expresión de este marcador se relaciona con el incremento de subpoblaciones con funciones reguladoras aunque aún estas funciones no se han demostrado en bovinos. Dado que la respuesta específica frente a derivado proteico purificado de Mycobacterium bovis no pudo ser detectada en los grupos inoculados con LAM como inmunomodulador, los resultados obtenidos indican que la modulación por LAM no interfiere con el diagnóstico de tuberculosis in vivo ni en el de paratuberculosis in vitro. Se evaluó la cinética de respuesta específica de anticuerpos frente a OVA a los días 0, 21, 42 y 57 y la respuesta de isotipos utilizando anticuerpos anti IgM, IgG1, IgG2 e IgG3 bovinos. Los resultados obtenidos muestran que la modulación por LAM en bovinos indujo anticuerpos específicos de alto título desde la primera inmunización. Estos niveles se incrementaron en la segunda dosis y se mantuvieron luego de la tercera inmunización. La respuesta sérica predominante frente a OVA es IgG1 e IgG2 y en menor proporción IgG3. La relación entre IgG1/IgG2 mostró una disminución en los animales inmunizados junto con LAM. Esto sugiere una tendencia de LAM a inducir una respuesta de tipo Th1. Este trabajo de tesis nos permitió conocer el efecto del agregado de LAM al adyuvante de Freund incompleto como posible modulador hacia una respuesta de tipo Th1 frente a OVA inoculada simultáneamente.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 141 h.

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Maruri, Alejandro
2018-12-27

Descripción: Durante el siglo XX, la introducción de biotecnologías reproductivas innovadoras en la producción bovina le ha permitido a la ganadería un gran avance. La transferencia de embriones producidos por fecundación in vitro (FIV) aumentó significativamente, alcanzando en el año 2013 un máximo histórico a nivel mundial de 42% del total de embriones transferidos. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos científicos para optimizar los sistemas de producción in vitro (PIV), las condiciones de cultivo continúan siendo subóptimas. En consecuencia, el rendimiento y la calidad de los embriones es inferior respecto a los producidos in vivo lo que genera mayores pérdidas embrionarias, afectando negativamente la producción. El cocultivo con células somáticas podría mejorar las condiciones subóptimas y favorecer el desarrollo embrionario a través de la producción de compuestos con actividad mitogénica y sustancias que promueven la diferenciación celular, la detoxificación de embriotoxinas y la modificación de las concentraciones de sustratos energéticos. Asimismo, el estudio de sistemas de cocultivo podría proporcionar información valiosa sobre los requerimientos para el desarrollo embrionario temprano, la bioquímica de las células somáticas y su interacción con el embrión. El objetivo general de la tesis es optimizar la producción de embriones bovinos obtenidos por FIV, a través de la utilización de sistemas de cocultivo con células de granulosa y luteales bovinas, para incrementar el rendimiento y/o la calidad de los blastocistos obtenidos a través de dicha biotecnología. Se evaluó el efecto de dos sistemas de cocultivo con células de granulosa bovina durante la maduración in vitro (MIV): células de la línea BGC-1 (bovine granulosa cell line 1) y células del primer pasaje luego del cultivo primario (CGB-1). Paralelamente, se utilizaron células de pasaje 1 de cultivo primario de cuerpo lúteo bovino sin purificar, no obteniéndose resultados concluyentes. De igual modo, se evaluó el efecto de un sistema de cocultivo con células luteales bovinas purificadas de pasaje 1 (CLB-1) durante el desarrollo embrionario temprano. La presencia de BGC-1 no demostró tener un efecto beneficioso sobre la maduración nuclear ovocitaria respecto al grupo control (sin células). Se observaron porcentajes variables y en la mayoría de los casos la reanudación meiótica fue inhibida. Al emplear como modelo alternativo las CGB-1, se incrementó significativamente el porcentaje de maduración nuclear (85%) respecto al control (70%). Sin embargo, los porcentajes de ovocitos Anexina V-FITC positivos (determinación para apoptosis temprana) y de ovocitos muertos luego de la MIV no mostraron diferencias entre el cocultivo con CGB-1 y el control. También, se evaluó la apoptosis tardía (ensayo TUNEL) sin observar diferencias entre los grupos (CGB-1: 1,12% vs. control: 1,33%). Los niveles ovocitarios de especies reactivas derivadas del oxígeno (ERO) se determinaron a través del ensayo de DCHFDA luego de la MIV, observando un incremento significativo de los mismos en el cocultivo con CGB-1. Como parámetro indirecto de evaluación de la maduración citoplasmática se realizaron experimentos de FIV, en cuyo caso se agregaron gonadotrofinas al medio de MIV en el grupo control. El porcentaje de embriones segmentados se determinó a las 48 h post-FIV y fue similar en ambos grupos (CGB-1: 80,5% vs. control: 79,4%). Sin embargo, el rendimiento de blastocistos fue significativamente menor en el cocultivo (CGB-1: 14% vs. control: 25,6%). El cocultivo de embriones con CLB-1 se realizó durante las primeras 48 h de cultivo in vitro (CIV). Las CLB se aislaron y purificaron previamente mediante centrifugación diferencial en un gradiente discontinuo de Percoll®, determinando la pureza mediante inmunocitoquímica (ICQ) para 3?-HSD (enzima que cataliza la biosíntesis de progesterona a partir de la pregnenolona). Se observó que la totalidad de las células de pasaje 1 que habían sido seleccionadas (fracciones 5 y 6 del gradiente de Percoll®) fueron positivas a 3?-HSD. Utilizando el colorante rojo Nilo se determinó la presencia de vacuolas lipídicas citoplasmáticas en la totalidad de las células evaluadas, lo cual indicó actividad esteroidogénica conservada. Del mismo modo, las células de pasaje 1 sin selección mostraron un porcentaje del 80,6% ± 7,02 de positividad al colorante. El cocultivo con este sistema modificó la cinética de desarrollo embrionario respecto al sistema convencional sin células (control). Se observó un incremento significativo del porcentaje de blastocistos (CLB-1: 50% vs. control: 30%) y de blastocistos de estadio 6 (CLB-1: 37% vs. control: 24%). Los niveles de ERO se determinaron en embriones de día 2, siendo significativamente superiores en el cocultivo. Por otro lado, se planteó la detección del factor de proliferación celular Ki-67 como marcador temprano de calidad embrionaria. Mediante inmunofluorescencia para Ki-67 y tinción con Hoechst 33342 se determinó el porcentaje de proliferación celular y el número promedio de blastómeras en embriones de día 2. El porcentaje de proliferación celular en los embriones cocultivados con CLB-1 fue significativamente mayor respecto al control sin existir diferencias en el número de blastómeras. Se evaluó la apoptosis tardía (ensayo TUNEL) en blastocistos, observando un menor porcentaje de blastómeras apoptóticas en el cocultivo con CLB-1 respecto al control (4,10% vs. 10,90%). En conclusión, el sistema de cocultivo con BGC-1 no es una alternativa para optimizar la PIV de embriones bovinos. Sin embargo, el cocultivo con CGB1 mostró un efecto positivo sobre la maduración nuclear ovocitaria, no obstante, su utilización no resultó ser superior en términos de eficiencia respecto al sistema de PIV tradicional. Los efectos de este sistema de cocultivo se evidenciaron tardíamente y los menores rendimientos podrían asociarse a los mayores niveles de ERO en los ovocitos. Finalmente, la utilización de CLB-1 purificadas y en cocultivo durante las etapas tempranas de desarrollo demostró un marcado efecto embriotrófico con altos porcentajes de blastocistos de mejor calidad, optimizando la PIV de embriones bovinos.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: unknown  (tamaño kb)  Pag. 180 h.

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Morado, Sergio Adrián

Descripción: El papel de las especies reactivas del oxígeno (ROS) en los procesos relacionados con la manipulación y el cultivo de gametas y embriones in vitro es controversial. Se ha propuesto que un adecuado nivel de (anión superóxido) O2 - sería beneficioso durante la maduración in vitro (MIV) de ovocitos bovinos para aumentar su competencia de desarrollo. En concordancia, se observó un aumento gradual en los niveles de ROS desde el estadio de dos células al de mórula tardía, que podría depender de los cambios en el metabolismo del embrión bovino durante su desarrollo. Por otro lado, diversos estudios han demostrado la expresión de genes que codifican para enzimas antioxidantes a lo largo del cultivo in vitro de ovocitos y complejos ovocito-cumulus y sostienen que para que el embrión adquiera la competencia de desarrollo sería importante también que los antioxidantes sean almacenados en el ovocito (como ARNm o proteínas) durante el crecimiento y la maduración. Los reportes aparentemente contradictorios encontrados en la bibliografía y los resultados previos de nuestro grupo justifican la necesidad de profundizar la investigación para determinar si las ROS desempeñan un rol importante en el progreso meiótico y/o en la maduración citoplasmática del ovocito. Por lo tanto, el objetivo general de este trabajo fue determinar la posible fluctuación en la producción de ROS durante la maduración y activación in vitro de ovocitos bovinos en presencia de diferentes moduladores y su relación con los principales eventos de ambos procesos. En este trabajo la producción de ROS demostró ser fluctuante durante las 22 hs de la maduración. Se observó una significativa disminución en la generación de ROS entre las 2 y las 18 hs, que podría corresponder a un período que demanda una alta producción de energía por parte de la cadena respiratoria para la síntesis de proteínas requeridas durante las fases preparatorias para los eventos principales de la MIV. En cuanto al proceso de activación, observamos que existen patrones metabólicos diferentes entre ovocitos no activados, activados por espermatozoides y activados partenogenéticamente. El comportamiento contrastante observado en las fluctuaciones de los niveles ROS y de actividad oxidativa entre la activación mediada por espermatozoides y la partenogenética podría estar relacionado con la diferencia que presentan ambos tipos de activación con respecto a los picos de liberación de Ca+2. El pico único de liberación de Ca+2 desencadenado por la activación partenogenética no sería eficiente para estimular a la mitocondria en forma consistente, siendo así responsable de la menor competencia de desarrollo observada en este tipo de activación. Mediante la modulación de los niveles de glutatión reducido (GSH) pudimos observar que si bien el rol antioxidante del GSH podría ser suplido por otros componentes del sistema antioxidante del ovocito, su participación en el mantenimiento de la morfología del huso meiótico sería esencial para que se lleve a cabo la maduración. Al analizar el efecto de la modulación de los niveles de óxido nítrico (ON) exógeno y endógeno sobre la producción de ROS durante la MIV, la adición de un donante de ON demostró ser perjudicial para la maduración independientemente de las variaciones en los niveles de ROS. Por lo tanto, podemos concluir que un aumento en la concentración de ON en el ovocito impediría el progreso meiótico tanto por la formación de ONOO- como por la inhibición de la enzima Map quinasa y del factor promotor de la maduración, que intervienen en sistemas de señalización intracelular claves para la maduración. Mediante la adición de un inhibidor de la NADPH oxidasa al medio de MIV determinamos que la inhibición de la enzima no generaría cambios en los niveles de ROS del ovocito, pero la disminución del O2 - generado por esta enzima afectaría la tasa de clivaje embrionario, posiblemente por la participación de este compuesto en mecanismos de señalización intracelular necesarios para la ctivación. Al estudiar el efecto de la adición de sistemas enzimáticos moduladores de los niveles de H2O2 y O2 - observamos que si bien la adición de sistemas generadores de estos compuestos serían perjudiciales para la calidad del ovocito, el uso de scavengers alteraría el proceso de maduración por intervenir con diferentes mecanismos de señalización intracelular. Estos resultados estarían demostrando que determinados niveles de ROS son necesarios para que el ovocito bovino lleve a cabo la maduración posiblemente por participar en sistemas de señalización que intervienen en el proceso. Mediante la adición de moduladores de la actividad de la cadena respiratoria determinamos que el aporte de ATP de la respiración celular sería especialmente importante a las 12 hs, momento en el cual hay una elevada demanda de actividad metabólica con una activa síntesis proteica y que coincide con la transición entre las metafases I y II. En conclusión, se determinó una significativa fluctuación de los niveles de ROS a lo largo de la maduración y la activación de ovocitos bovinos in vitro. Las variaciones observadas tienen relación con eventos clave de ambos procesos y son relevantes para aumentar el conocimiento respecto de la competencia de desarrollo de los ovocitos y los embriones tempranos. Estos resultados justifican la importancia de realizar futuras experiencias para dilucidar si las fluctuaciones responden solamente a las variaciones en la actividad metabólica o si determinadas ROS intervienen además en sistemas regulatorios o de señalización celular. A su vez, estudios posteriores sobre el control metabólico de la activación partenogenética podrían contribuir a mejorar la performance de los embriones obtenidos mediante esta activación en diferentes aplicaciones biotecnológicas como transferencia nuclear, clonación y transgénesis.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 141 h.

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Vidal, Patricia Noemí
2019-03-22

Descripción: La Enfermedad de Cushing (EC) se caracteriza por un estado de hipercortisolismoncrónico, que provoca alteraciones metabólicas y sistémicas. Está asociada a gran cantidad de comorbilidades entre ellas la hipertensión arterial, de alta prevalencia, que conduce, junto con el hipercortisolismo, a la enfermedad renal, y ambas tienen repercusión en parámetros de coagulación, induciendo un estado denhipercoagulabilidad con riesgo de trombosis.nPara el estudio de estas comorbilidades se evaluaron perros con EC, evidenciándosendisminución del oxido nítrico (NO) correlacionado con el aumento del cortisol (r= -0.67; P<0.0001), asociados al aumento de presión arterial , con predominio de la presión diastólica (PD). PD correlacionó con cortisol (r=0.63; P<0.0001) de forma positiva y con el NO (r= -0.81; P<0.0001) de forma inversa. Repercutiendo la PD, en parámetros renales afectándose la tasa de filtrado glomerular (GFR) (r= - 0.58; P=0.007) y aumentando la proteinuria,nevidenciada por el aumento en la relación proteína/creatinina en orina (UPC) (r= 0.8;nP<0.001). UPC es un indicador de daño glomerular temprano. La utilización del Índicende resistencia (IR), relacionado al UPC y la presión arterial, posee gran valor pronostico de afección renal. Para el posterior empleo de la terapia renoprotectora enhipotensora más efectiva, se realizó la comparación entre 2 grandes grupos de perrosncon EC según valor de UPC, a su vez subdivididos según presión arterial. Se comparónenalapril vs doxazosina entre los distintos grupo, siendo más efectiva la Dozaxosina en reducir UPC (*P-valorBvsE= 0,01) y presión arterial (PS: P-valorBvsE = 0,01 y P-valorBvsD= 0,029; PD P-valorBvsE = 0,002).nSe pudo comprobar el estado de hipercoagulabilidad en perros con EC, a través de su comparación con un grupo control (perros sanos), encontrándose las concentracionesnde Factor de von-Willebrand (FvW) y el Inhibidor del Activador de Plasminogeno-1 (PAI-1) elevadas (P-valor=0,003 y P-valor=0,002 respectivamente), y disminuida la actividad de Antitrombina III (ATIII), la cual se asoció al aumento de UPC (r=-0,75; Pvalor <0,001) y presencia de Dímero-D + (DD) (r=-0,5; P-valor=0,008), habiendoncorrelación en ambos casos. Resultados de gran utilidad para su posterior utilizaciónncomo indicadores tempranos de riesgo de trombosis o Tromboembolismo pulmonarn(TEP), asociados a sintomatología clínica e imágenes confirmatorias, para posterior terapia profiláctica. Se evaluaron las concentraciones de aldosterona y angiotensina II (Ang II) en perrosncon EC comparándola con perros sanos, para explicar parte de los mecanismosninvolucrados en el desarrollo de hipertensión. Los resultados arrojaron que lanaldosterona no estaría involucrada, ya que su concentración fue la misma en controles sanos que perros con EC (P-valor= 0,8), no así la Ang II que se la encontró aumentada en los perros Cushing (P-valor< 0,0001). Los datos aportados en esta tesis son de gran relevancia para ampliar el conocimientonen la fisiopatología de esta enfermedad y mejorar el diagnóstico precoz de estasncomorbilidades e implementar terapias preventivas adecuadas en la clínica diaria quenmejorarán la calidad y sobrevida del paciente.nPalabras clave: Enfermedad de Cushing
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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Jolly, Ana
2016-12-05

Descripción: La paratuberculosis es una enfermedad granulomatosa, progresiva y crónica de los rumiantes causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map). Si bien su presentación es endémica a nivel mundial, su prevalencia está subestimada por las limitantes asociadas al diagnóstico. Presenta importancia en Salud Pública y fuerte impacto económico. Esto sumado a la carencia de medidas eficaces para su prevención, hacen de la paratuberculosis una enfermedad con muchos temas vacantes en materia de investigación. Si bien Map es un patógeno intracelular, la presencia de anticuerpos específicos en la luz intestinal al momento de la infección podría modular la respuesta del huésped. El objetivo de esta tesis fue evaluar el efecto de la opsonización de Map con anticuerpos anti-lipoaraninomanano (LAM, antígeno inmunodominante de superficie de Map) sobre la respuesta a la infección de macrófagos bovinos (in vitro) y de segmentos intestinales en terneros (in vivo). En ambos modelos, se emplearon anticuerpos séricos de bovinos sanos (n=2), con paratuberculosis natural (n=3) o inmunizados con LAM (n=3) para pretratar Map. En los experimentos in vitro, las variables estudiadas fueron el nivel de apoptosis y de secreción de TNF? e IL-10. Encontramos que la presencia de anticuerpos específicos incrementó significativamente la apoptosis de los macrófagos infectados. Por ejemplo, obtuvimos valores de 24,2 ± 2,9 % y de 22,4 ± 0,9 % al preincubar Map con anticuerpos de bovinos inmunizados con LAM o infectados, mientras que el porcentaje de apoptosis en presencia de anticuerpos de bovinos sanos fue de 17,2 ± 2,6 %. Este efecto estuvo acompañado por un incremento significativo del nivel de secreción de TNF? en ambos casos. Para el modelo in vivo, se realizó la infección quirúrgica de segmentos intestinales de 3 terneros con: Map en PBS, o preincubada con anticuerpos. Se evaluó el aspecto microscópico de los cortes tisulares, la presencia bacteriana y los niveles relativos de expresión de TNF? e IL-10, a las 3,5 horas post-infección. Como principal resultado encontramos una diferencia significativa en el nivel de recuperación bacteriana a partir de los segmentos infectados con los diferentes anticuerpos. Cuando la infección se produjo en presencia de anticuerpos específicos hubo una reducción significativa de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) recuperadas, tanto con los obtenidos de bovinos inmunizados con LAM como de infectados (2,6 ± 1,3 x 104 y 0,4 ± 0,3 x 104, respectivamente, vs. 5,4 ± 1,1 x 104 UFC/g tejido, para los segmentos inoculados en presencia de anticuerpos de bovinos sanos).En conjunto, los resultados de esta tesis indican que los anticuerpos específicos modulan los efectos de la infección por Map, tanto in vitro como in vivo, en los modelos bovinos estudiados. Asimismo, postulan por primera vez la capacidad de los anticuerpos de modular la apoptosis de macrófagos. A modo de reflexión final, es posible hipotetizar que la presencia local de altos niveles de anticuerpos específicos al momento de la infección natural por Map podría afectar la supervivencia bacteriana en el intestino, en parte por su contribución para el desarrollo de un microambiente pro-inflamatorio, con predominio de TNF? y por el incremento de los niveles de apoptosis de los macrófagos infectados. Estos efectos tendrían un impacto positivo sobre la respuesta inmune en desarrollo y sobre el control de la infección. Es necesario continuar nuestras investigaciones a fin de establecer la relevancia de la inmunidad mediada por anticuerpos en la prevención de la paratuberculosis bovina.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 171 h.

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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Fernández, Bárbara
2016-07-11

Descripción: La paratuberculosis, causada por el Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map), es una patología crónica intestinal que afecta a rumiantes. El diagnóstico es engorroso y permite identificar principalmente a los bovinos en estadios avanzados (clínico). El objetivo general del trabajo fue caracterizar los anticuerpos bovinos totales y específicos frente a Map y sus proteínas, e identificar su efecto en la viabilidad bacteriana. Los objetivos particulares fueron: Identificar el efecto de la infección con Map en los niveles de anticuerpos totales. Caracterizar la respuesta inmune humoral específica frente a Map y sus proteínas en sobre la viabilidad bacteriana intracelular. Los anticuerpos bovinos se estudiaron por la metodología de ELISA (niveles) y mediante un modelo de infección de macrófagos in vitro (funcionalidad). Se evaluaron un total de 120 animales. Los grupos de bovinos analizados difirieron según los experimentos, pero en general fueron: infectados naturalmente en estadio subclínico, clínico y terminal, infectados experimentalmente, expuestos, inmunizados con proteínas específicas de Map y controles sanos. Se demostró que: La paratuberculosis afecta los niveles de anticuerpos totales en muestras de suero y materia fecal, según el estadio. Los bovinos con paratuberculosis clínica presentan incrementos en los niveles de IgM sérica, así como de IgM, IgG e IgA a nivel local. El estudio del isotipo IgG2 específico frente a la bacteria entera o al antígeno protoplasmático de Map (PPA) mejora la identificación de bovinos infectados en estadio subclínico (sensibilidad de IgG2 e IgG/ELISA-PPA del 54% y del 23%, respectivamente). El isotipo IgG2 aparece de manera temprana en la infección experimental (p=0,013, a los 60 días postinfección). Los anticuerpos específicos frente a la proteína p34 inhiben la viabilidad intracelular de Map en el modelo de infección de macrófagos bovinos in vitro utilizado. Estos resultados impactan sobre las metodologías diagnósticas utilizadas en la actualidad y revalorizan el papel de los anticuerpos específicos frente a p34. Este hallazgo justifica la continuación de su análisis en modelos de infección y protección en la especie bovina.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 229 h.

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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Miño, Orlando Samuel
2017-08-23

Temas:   Virología   -  Potrillo   -  Síndrome diarreico   -  Diagnóstico   -  Virus   -  Rotavirus   -  Coronavirus   -  Norovirus   -  Equinos   -  Reoviridae

Descripción: Las diarreas neonatales representan uno de los síndromes clínicos más relevantes y frecuentes en potrillos menores de 6 meses de edad. Rotavirus grupo A (RVA) es el principal agente viral asociado a diarreas en potrillos, a nivel mundial. Sin embargo, en aproximadamente el 50% de los casos de diarrea no se puede establecer su etiología. Por estos motivos, los objetivos de este trabajo fueron, profundizar el conocimiento de la epidemiología molecular y, de las características evolutivas y estructurales de RVA equino, y estudiar la presencia de otros agentes virales como posibles causantes de diarreas en potrillos de nuestro país.nEl estudio de RVA equino comenzó con la determinación de la sensibilidad y especificidad de tres metodos de diagnóstico. En segundo lugar, se estudió la epidemiología molecular de los RVA circulantes en equinos durante el período 2009 ? 2014. Las variantes G3P y G14P fueron las cepas detectadas con una prevalencia cíclica y alternada entre los años bajo estudio. Con todas las cepas disponibles se realizó un estudio evolutivo, determinándose la monofilia de los RVA equinos de Argentina. Se identificó el genotipo E12 -correspondiente al gen codificante de la enterotoxina viral NSP4- como un indicador geográfico que permitió trazar la evolución de los RVA equino de Sudamérica, desde la primera fundación de Buenos Aires en 1536. El resultado obtenido permite plantear la hipótesis de una infección inter especie que dio origen a una cepa emergente resultado de la reasociación de genes entre las cepas de RVA de animales autóctonos (guanacos) y las cepas de RVA de los animales introducidos (equinos y bovinos). Se detectó el fenómeno de transferencia y fijación del genotipo E12 autóctono en las cepas de RVA circulantes en equinos y bovinos de Sudamérica. El estudio de RVA equino incluyó también un análisis estructural que permitió explicar el ligamiento genético observado entre las variantes de las proteínas estructurales VP7 y VP6. Finalmente, mediante la tecnología de ?next generation sequencing?, se estudió el viroma de la materia fecal de potrillos con diarrea. Así se determinó la presencia de otros agentes virales, potenciales causantes de diarrea.En conclusión, este trabajo profundizó aspectos relacionados con el diagnóstico de RVA equino, aportando datos novedosos respecto a los procesos evolutivos, filodinámicos y estructurales que podrían extrapolarse a otros virus de genoma segmentado. Asimismo, se describió por primera vez el viroma de materia fecal de potrillos con diarrea, sugiriendo otros posibles agentes causales. Nuestros resultados enfatizan la importancia de realizar una vigilancia epidemiológica continua de las diarreas en potrillos, profundizar en la identificación y caracterización de los agentes virales asociados, con el fin último de realizar el diseño racional de nuevas herramientas de prevención y control.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 157 p.

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Marfil, María Jimena
2019-03-29

Descripción: La tuberculosis bovina, causada por Mycobacterium bovis (M. bovis), es endémica en la Argentina. Su presencia en el ganado bovino representa un riesgo para la salud humana debido a su carácter zoonótico, pudiendo además afectar a diversos mamíferos. En el hombre, M. bovis causa enfermedad con presentación pulmonar o extrapulmonar siendo la clínica indistinguible de la producida por Mycobacterium tuberculosis. Los más expuestos son los niños que consumen leche o sus derivados sin pasteurizar, los adultos relacionados con la actividad laboral pecuaria y también los cazadores. Para evitar la llegada del agente al consumidor, una de las últimas barreras de protección es la inspección bromatológica en el frigorífico para poder detectar lesiones compatibles con tuberculosis y decomisar los órganos afectados y si está generalizado la res completa. Se realiza visualmente y por palpación, pero debido a la patogenia de la tuberculosis, sólo las lesiones crónicas pueden ser evidenciadas por este monitoreo. La micobacteria puede estar presente incluso en tejidos sin lesión aparente, siendo los principales órganos afectados los linfonódulos y los pulmones, pudiéndose encontrar en otros órganos parenquimatosos como el hígado. Esto puede conducir a escapes del sistema de vigilancia permitiendo que las micobacterias lleguen a los comercios y posteriormente al consumidor. En este trabajo fueron recolectados 210 pulmones junto con los linfonódulos orrespondientes y 6 hígados bovinos, provenientes de un frigorífico y de 6 carnicerías de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires y de la provincia de Buenos Aires. Los pulmones recolectados en el frigorífico fueron inspeccionados in situ y se tomaron muestras del órgano para el trabajo en el laboratorio. Los pulmones e hígados que fueron comprados completos en carnicerías y fueron inspeccionados en el laboratorio. Se obtuvieron un total de 5 aislamientos de M. bovis en medio Stonebrink confirmados por PCR IS-6110 (aislamientos N° 134, 719, 179, 182 y 184) y además 12 aislamientos de micobacterias no tuberculosas confirmadas por la secuenciación de los genes hsp65, rpoB, 16S ARNr y secuenciación genómica de alto rendimiento para uno de ellos. Los aislamientos de M. bovis fueron caracterizados molecularmente por Spoligotyping y MIRU-VNTR. Se pudieron distinguir 3 patrones de Spoligotyping que se correspondieron con 3 patrones de MIRU-VNTR, 3 aislamientos compartieron ambos patrones y los otros 2 fueron únicos. Adicionalmente, se investigó en 3 de los aislamientos su capacidad de resistencia a drogas utilizadas en el tratamiento de la tuberculosis en humanos (rifampicina, isoniazida, etionamida, levofloxacina y estreptomicina), encontrándose que el aislamiento 184 era resistente a isoniazida y el aislamiento 134 era multirresistente (presentando resistencia a los 4 antibióticos probados y considerado ?border? para levofloxacina). Se realizó la secuenciación completa del genoma de uno de los aislamientos identificado como M. kansasii empleando una plataforma Illumina mySeq. El genoma fue anotado y se describió sus características así como también se evaluó la presencia de single nucleotide polymorphism (SNPs) en genes de virulencia y genes relacionados a la resistencia a antibióticos y codificantes de antígenos empleados para el diagnóstico de tuberculosis. Se evaluó la virulencia y transmisibilidad de los aislamientos N° 134 y 182 junto con una cepa de referencia M. bovis AN5 (considerada de virulencia intermedia), en un modelo murino. Los animales fueron inoculados intratraquealmente, con 1x105 UFC de cada una de las cepas a evaluar, y dichos animales se pusieron en contacto con ratones sin inocular en una relación 1:1. Se evaluó la virulencia en los animales inoculados, mientras que en los contactos sanos, se evaluó la transmisibilidad de las cepas. Se realizó la eutanasia de 5 animales infectados y 5 animales contactos sanos de cada grupo, en los tiempos 30, 60 y 90 días post-inoculación. Se cultivaron los pulmones y bazos de todos los animales infectados y los contactos sanos en los medios apropiados, evaluando su crecimiento semanalmente. Adicionalmente, los bazos fueron procesados para cuantificar las citoquinas IL-4, TNF ? e INF? por citometría de flujo mediante el kit comercial Cytometric bead array. El aislamiento N° 134 demostró ser virulento por producir sintomatología incompatible con la vida al día 16 posterior a la inoculación, produciendo la muerte de 9 animales, los 6 restantes fueron eutanasiados. El aislamiento N° 182 generó esplenomegalia en los ratones infectados, pero no se observó el desmejoramiento ni la muerte de los animales. Además, se pudo describir la transmisibilidad del aislamiento 182, mediante el aislamiento de la micobacteria a partir de bazo de uno de los animales ?contacto?. A partir del presente trabajo se pudo detectar la presencia de micobacterias tanto zoonóticas como ambientales en vísceras comercializadas. La virulencia, transmisibilidad y la resistencia a antibióticos de cada una de ellas fue variable, requiriéndose de estudios futuros para una mejor comprensión del impacto de estas observaciones en la dinámica de la enfermedad tanto en el ámbito veterinario como en Salud pública.
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Tipo de documento: tesis doctoral  | Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 109 h.

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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