Director(a):
Mollerach, Marta
Co-Director(a):
Di Gregorio, Sabrina
Jurado:
Centrón, Daniela - Gutkind, Gabriel - Basualdo Farjat, Juan
Institución otorgante:
Universidad de Buenos Aires.   Facultad de Farmacia y Bioquímica
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Facultad de Medicina
Fecha de la defensa:
2016-09-19
Tipo de documento:
tesis de maestría - info:eu-repo/semantics/acceptedVersion
Grado alcanzado:
Magíster de la Universidad de Buenos Aires en Biología Molecular Médica 
Editor:
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica
Formato:
application/pdf  |   kb.   |  98 p.
Idioma:
español
Area Temática:
Palabras clave:
Descripción:
Staphylococcus aureus, forma parte de la microbiota colonizante de piel y mucosas en humanos y animales. Sin embargo, este patógeno oportunista es uno de los patógenos más frecuentes e importantes, aislado tanto en el ámbito nosocomial como en la comunidad, responsable de una gran variedad de infecciones tales como endocarditis, osteomielitis y sepsis. En el presente trabajo se caracterizaron cuatro aislamientos clínicos de S. aureus recuperados de un paciente que padeció cuatro episodios sucesivos de bacteriemia. Los primeros 3 aislamientos fueron sensibles a cefoxitina (FOX) y oxacilina (OXA), mientras que el último resultó resistente a OXA. Se determinó la isogenicidad de los cuatro aislamientos recuperados del paciente por la técnica de PFGE. La genotipificación indicó que estos aislamientos pertenecen al ST8, y spa tipo t024, linaje que no se encuentra dentro de los más frecuentes en Argentina. Se profundizó el estudio del primer aislamiento, SAMS1, y del último, SA2 dado su fenotipo poco frecuente en nuestro medio (sensibilidad a FOX y resistencia a OXA) La detección molecular del gen mecA que codifica la PBP2a, mecanismo más frecuente asociado a resistencia a oxacilina, dio resultado negativo. Se descartó también la presencia del gen mecC y de las diferentes recombinasas descriptas en los SCCmec. En consecuencia, se evaluaron mecanismos alternativos que pudiesen explicar este fenotipo. No se detectaron mutaciones en el gen pbp4 entre los aislamientos. El aislamiento SA2 presentó mayor actividad de ?-lactamasas que el aislamiento SAMS1. Sin embargo, no se encontraron mutaciones en el operón bla, que pudieran justificar esta hiperproducción. Se pudo evidenciar también, la presencia de una mutación en la posición 1350 del gen pbp2 de la cepa SA2 respecto de la SAMS1, que resultó en una sustitución Ala450Asp. Este cambio no se evidenció en la cepa SAMS3 (aislada en el tercer episodio de bacteriemia), lo que sugiere que esta mutación se podría vincular con la emergencia de resistencia a oxacilina en SA2. El análisis del efecto de esta mutación con modelos tridimensionales muestra el reemplazo de un aminoácido hidrofóbico como la alanina, por uno ácido como el aspártico, en un entorno hidrofóbico y cercano a la cavidad del sitio activo del dominio transpeptidasa de la PBP2 de SA2. La carga introducida en ese entorno hidrofóbico produciría una distorsión del ?-hélice y del cercano bolsillo de reacción, dificultando así el ingreso de la molécula de OXA. Posiblemente, tanto la hiperproducción de ?-lactamasa como la mutación que resulta en la sustitución Ala450Asp en PBP2, descriptas en la cepa SA2, contribuyan al fenotipo de resistencia observado. No se descarta la posible coexistencia de otros mecanismos moleculares que contribuyan a la resistencia a este antibiótico. La detección de aislamientos resistentes a oxacilina pero carentes del gen mec, representa un gran desafío para los laboratorios clínicos, dado que no se detectan utilizando el disco de FOX. Si bien el CLSI recomienda, dentro de las pruebas cualitativas, el uso del disco de FOX para informar la sensibilidad a antibióticos ?-lactámicos, este trabajo demuestra la emergencia en Argentina de aislamientos de S. aureus resistentes a OXA que no se detectan con ese método y serían reportados como SAMS.
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Abstract:
Staphylococcus aureus is part of skin and mucous membranes colonizing flora, both in humans and animals. However, this opportunistic microorganism is one of the most common and important pathogens isolated both from nosocomial and community environments, responsible for a variety of infections such as endocarditis, osteomyelitis, and sepsis. Four clinical isolates of S. aureus recovered from a patient who suffered four consecutive episodes of bacteremia were characterized in this work. The first three isolates were susceptible to cefoxitin (FOX) and oxacillin (OXA), while the latter was resistant to OXA. The isogenicity of the four isolates was determined by PFGE. Genotyping indicated that these isolates belong to ST8, spa type 024. This lineage is not prevalent in Argentina. The first isolate (SAMS1) and the last one (SA2) were further studied, considering the rare phenotype observed in SA2 (FOX sensitivity and OXA resistance). Molecular detection of the mecA gene, the most common mechanism associated with OXA resistance, was negative. The presence of mecC gene and recombinase genes described in different SCCmec were also discarded. Consequently, alternative mechanisms that could explain this phenotype were evaluated. No mutations in pbp4 gene were detected among isolates. The SA2 isolate showed higher ?-lactamase activity than the SAMS1 isolate. However, no mutations in the bla operon, that could justify this overproduction, were found. Comparison of SA2 and SAMS1 pbp2 gene sequences revealed a mutation at nucleotide 1350, resulting in an Ala450Asp substitution. This change was not detected in the SAMS3 strain (isolated in the third episode of bacteremia), suggesting that this mutation could be linked with the emergence of oxacillin resistance in SA2 A tridimensional model showed the replacement of a hydrophobic aminoacid such as alanine, by an acid one as aspartic, placed in a hydrophobic environment close to the active site cavity of the transpeptidase domain of SA2 PBP2. This change would generate distortions that could hinder the OXA molecule entrance. Both ?-lactamase overproduction and PBP2 Ala450Asp substitution described in SA2 strain, would contribute to the resistance phenotype described herein. The possible coexistence of other molecular mechanisms that could contribute to the oxacillin resistance could not be discarded. Detection of oxacillin resistant, mec negative isolates, represents a major challenge for clinical laboratories, since they are not detected using FOX disc diffusion method. This work demonstrates the emergence of OXA resistant S. aureus isolates in Argentina that are not detected with current CLSI recommendations.
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Calificación:
Sobresaliente
Dictamen:
Tanto la presentación escrita como oral fue excelente. Los resultados obtenidos constituyen un aporte significativo al estudio geno y fenotípico de la resistencia a antibióticos mediada por mecanismos no convencionales en Staphylococcus aureus, demostrando una adecuada utilización de la biología molecular como herramienta en el estudio de la resistencia en esta especie. La estrategia experimental fue pertinente para los objetivos planteados. El trabajo presenta bibliografía actualizada y está claramente escrito.
Identificador(es):
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=masteruba&cl=CL1&d=HWA_1631
Filiación Institucional:
Fil: Weltman, Gabriela Débora. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
Institución aportante:
Facultad de Farmacia y Bioquímica
Biblioteca cooperante:
Biblioteca de la Facultad de Farmacia y Bioquímica
Derechos:
info:eu-repo/semantics/openAccess
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/
Licencia de uso:
Licencia Creative Commons

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Cita bibliográfica:

Weltman, Gabriela Débora (2016-09-19). Staphylococcus aureus resistente a oxacilina por mecanismos alternativos a la presencia del gen mecA  (tesis de maestría). Universidad de Buenos Aires.  Facultad de Farmacia y Bioquímica. [consultado:  ] Disponible en el Repositorio Digital Institucional de la Universidad de Buenos Aires:  <http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=masteruba&cl=CL1&d=HWA_1631>