Director(a):
Sales, María Elena
Co-Director(a):
Lombardi, María Gabriela
Jurado:
Kordon, Edith - Lanari, Claudia - De Siervi, Adriana
Institución otorgante:
Universidad de Buenos Aires.   Facultad de Farmacia y Bioquímica
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Facultad de Medicina
Fecha de la defensa:
2015-07-08
Tipo de documento:
tesis de maestría - info:eu-repo/semantics/acceptedVersion
Grado alcanzado:
Magíster de la Universidad de Buenos Aires en Biología Molecular Médica 
Editor:
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica
Formato:
application/pdf  |   kb.   |  95 p.
Idioma:
español
Area Temática:
Descripción:
El sistema colinérgico no neuronal (SCnN) está conformado por la acetilcolina, la enzima que la sintetiza, la colina acetil transferasa, la enzima que la degrada, la acetilcolinesterasa y los receptores nicotínicos y muscarínicos (M) presentes en células de origen no nervioso. Este sistema participa en la regulación de funciones celulares fisiológicas y patológicas. En este sentido se ha reportado la participación del SCnN en la progresión tumoral. En particular, la sobreexpresión de los receptores M se ha descripto en un gran número de tumores. Hemos demostrado la expresión de estos receptores en células de la línea MCF-7, derivadas de un adenocarcinoma mamario humano, así como también en células tumorales mamarias murinas y la ausencia de expresión en células no tumorigénicas mamarias humanas como las de la línea MCF-10A. Además observamos que la activación de los receptores M aumenta la proliferación, la migración celular y la angiogénesis in vivo. Sobre la base de estos antecedentes nos propusimos evaluar si la expresión de los subtipos 3 y 4 de los receptores M en las células MCF-10A promueve la transformación celular hacia un fenotipo tumoral. Para esto generamos por transfección tres líneas celulares que expresan los subtipos 3 y/o 4 de los receptores M, que denominamos: MCF-10A-M3, MCF-10A-M4 y MCF-10A-M3M4. En estas tres líneas estudiamos el efecto de la activación colinérgica sobre el ciclo celular, la migración celular, la respuesta angiogénica y el crecimiento tumoral in vivo, utilizando a las células MCF-7 como control positivo. Demostramos que las tres líneas celulares generadas expresan el transcripto y las proteínas para los subtipos 3 y 4 de receptores M. Observamos que el tratamiento con el agonista carbacol incrementó el porcentaje de células en fase S/G2/M en las células MCF-10A-M3, MCF-10A-M4 y MCF-10A-M3M4 con respecto al control y que el efecto estimulante del carbacol se revierte en presencia del antagonista no selectivo atropina. También estudiamos el efecto del agonista en la migración celular y en la expresión de la metaloproteinasa-9 (MMP-9), como parámetros fundamentales en la invasión tumoral. Demostramos que el tratamiento con carbacol incrementó la capacidad migratoria y la expresión de MMP-9 en las células MCF-10A-M3, MCF-10A-M4 y MCF-10A-M3M4 de manera comparable a lo observado en las células tumorales MCF-7, mientras que no tuvo efecto sobre estos parámetros en las células MCF-10A. Estos efectos se redujeron en presencia de atropina así como de los antagonistas selectivos de los subtipos M3 y M4, 4-DAMP y tropicamida respectivamente. La angiogénesis es un paso central en la progresión tumoral. Estudiamos la capacidad de las células MCF-10A-M3, MCF-10A-M4 y MCF-10A-M3M4 para generar nuevos vasos sanguíneos in vivo. Encontramos que estas células aumentan la neovascularización de manera semejante a las células MCF-7. Además, las células transfectadas adquirieron la capacidad de sintetizar el principal promotor de la angiogénesis que es el factor de crecimiento del endotelio vascular-A (VEGF-A), una propiedad constitutiva en las células MCF-7. Por ultimo evaluamos la capacidad tumorigénica in vivo y encontramos que las células MCF-10A-M3, MCF-10A-M4 y MCF-10A-M3M4, forman tumores en ratones NUDE mientras que las células MCF-10A carecen de esta capacidad. Concluimos que la expresión de uno o más subtipos de los receptores M en células de mama humana no tumorigénicas es suficiente para aumentar la proliferación, la migración e indujo la producción de MMP-9 in vitro y adquirir de novo la capacidad de inducir neovascularización, sintetizar VEGF-A y formar tumores in vivo.
Ver resumen completo
Abstract:
The non neuronal cholinergic system (nNCS) is constituted by acetylcholine (ACh), choline acetyl transferase and acetylcholinesterase, the enzymes that synthesize and degrade ACh, and nicotinic and muscarinic receptors (mAChR), all of them expressed in cells with non nervous origin. The nNCS has been implicated in the regulation of cellular physiological and pathological functions. Regarding the latter, previous works reported the participation of nNCS in tumor progression. Particularly, mAChR are over-expressed in a great number of tumors. We demonstrated the expression of these receptors in MCF-7 cells, derived from a human mammary adenocarcinoma, as well as in murine mammary tumor, cells and their absence in the non tumorigenic cell line, MCF-10A. Furthermore, we observed that the activation of mAChR stimulates cell proliferation and migration in vitro and the angiogenic response in vivo. Taking into account these previous results, we set out to investigate whether the expression of the subtypes 3 and 4 of mAChR in MCF-10A cells promotes the malignization of these cells. For this aim, we generated three cell lines by transfection, which expressed the subtypes 3 and 4 of mAChR denominated: MCF-10A-M3, MCF- 10A-M4 and MCF-10A-M3M4. In these three cell lines, we studied the effect of cholinergic activation on cell cycle, and cell migration in vitro, as well as neovascularization and tumor growth in vivo. We used the MCF-7 cell line as positive control. We demonstrated that all cell lines transfected express mRNA and proteins for the subtypes 3 and/or 4 of mAChR. We observed that the cholinergic agonist carbachol increased the percentage of cells in S/G2/M phase in MCF-10A-M3, MCF-10A-M4 and MCF-10A-M3M4 cells, and that this effect was reduced by atropine, a muscarinic non-selective antagonist. We also studied the effect of the agonist on cell migration and metalloproteinase-9 (MMP-9) expression, as fundamental parameters in tumor invasion. The treatment with carbachol increased migration and MMP-9 expression in all transfected cell lines, in a similar manner to that observed in MCF-7 cells, while it had no effect over these parameters in MCF-10A cells. The action of carbachol was reduced by atropine and also by 4-DAMP or tropicamide, selective antagonists for M3 and M4 receptors, respectively. Angiogenesis is a central step for tumor progression and for this reason, we studied the ability of MCF-10A-M3, MCF-10A-M4 and MCF-10A-M3M4 cells to generate new blood vessels in vivo. We found that cells increased neovascularization similarly to MCF-7 cells. Also, the transfected cell lines expressed de novo vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A), a constitutive property in MCF-7 cells. Finally we evaluated tumorigenic ability in vivo and we found that MCF-10A-M3, MCF-10A-M4 and MCF-10AM3M4 cells generate tumors in NUDE mice, while MCF-10A cells lack of this ability. In conclusion, the expression of one or more subtypes of mAChR in mammary human non-tumorigenic cells is enough to increase cell proliferation, migration and MMP-9 production in vitro, and to acquire the ability to induce neovascularization, to produce VEGF and to generate tumors in vivo.
See complete abstract
Calificación:
Sobresaliente (10 Diez puntos)
Dictamen:
El trabajo de tesis fue expuesto en forma, concisa y clara. La redacción fue ordenada y con bibliografía actualizada. El trabajo permite avanzar en la comprensión de la importancia de los receptores muscarínicos en el cáncer de mama. El trabajo realizado exigió un gran esfuerzo y dedicación, combinando estudios de laboratorio en cultivo e in vivo. La presentación oral de la tesis fue excelente y la maestranda defendió con mucha solvencia su trabajo y demostró un conocimiento acabado de la bibliografía.
Identificador(es):
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=masteruba&cl=CL1&d=HWA_1125
Filiación Institucional:
Fil: Martinez Pulido, Paola. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina
Institución aportante:
Facultad de Farmacia y Bioquímica
Biblioteca cooperante:
Biblioteca de la Facultad de Farmacia y Bioquímica
Derechos:
info:eu-repo/semantics/openAccess
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/
Licencia de uso:
Licencia Creative Commons

Descargar texto: 1125.PDF (tamaño kb)

Cita bibliográfica:

Martínez Pulido, Paola (2015-07-08). Rol de los receptores muscarínicos en la tumorigénesis mamaria  (tesis de maestría). Universidad de Buenos Aires.  Facultad de Farmacia y Bioquímica. [consultado:  ] Disponible en el Repositorio Digital Institucional de la Universidad de Buenos Aires:  <http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=masteruba&cl=CL1&d=HWA_1125>