Director(a):
Chiappe Barbará, Angelina
Co-Director(a):
Simone, Emilio De
Institución otorgante:
Universidad de Buenos Aires.   Facultad de Ciencias Veterinarias
Tipo de documento:
tesis de maestría - info:eu-repo/semantics/acceptedVersion
Grado alcanzado:
Magister de la Universidad de Buenos Aires en Medicina Deportiva del Equino 
Editor:
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias
Formato:
application/pdf  |   kb.   |  50 h.
Idioma:
español
Area Temática:
Descripción:
La enfermedad articular degenerativa u osteoartritis (OA) es la enfermedad articular más frecuente en el caballo y es considerada a nivel internacional como responsable del 60 % de las claudicaciones del equino deportivo.En los deportes en los cuales la vida útil del equino es prolongada, es frecuente observar formas crónicas de esta enfermedad debidas al fracaso del cartílago articular para soportar el trauma cíclico de la actividad deportiva, sumado a los cambios propios de la edad. En animales jóvenes, las lesiones reiteradas pueden llevar al caballo al retiro de la competencia aún a edades relativamente tempranas. Este trauma repetido, producto de la competencia deportiva, produce sinovitis y capsulitis, daño a ligamentos colaterales, fracturas intra articulares y lesión del hueso subcondral. Estos procesos llevan a las manifestaciones clínicas de la OA, tanto agudas o crónicas con reagudizaciones recidivantes características de esta enfermedad. La OA puede ser definida como una enfermedad progresiva, degenerativa que se caracteriza por una pérdida del cartílago articular, eburnificación del hueso subcondral e inflamación de la membrana sinovial y aumento del líquido sinovial. Los procesos inflamatorios resultantes producen citoquinas proinflamatorias que activan metaloproteinasas (MMPs) que a su vez retroalimentan el proceso por destrucción de la matriz extracelular cartilaginosa (MEC). El diagnóstico de la OA se basa en la semiología clínica y en métodos complementarios. En el diagnóstico clínico es de fundamental importancia la descripción estandarizada de los síntomas de una enfermedad, asi como los signos de su evolución o progresión en el tiempo para unificar los criterios de diagnóstico entre los profesionales, para determinar el tipo y el nivel de gravedad de la misma, para definir las pautas de inclusión de los pacientes en trabajos de investigación, para caracterizar los modelos animales utilizados en la investigación de enfermedades que afectan al ser humano y finalmente, para poder cuantificar estadísticamente los progresos, los éxitos y los fracasos en los tratamientos. En Medicina Humana se describen varios índices para evaluar a la OA desarrollados por organizaciones como el International Knee Documentation Comittee (IKDC) y la International Cartilage Repair Society (ICRS). Estos índices incluyen evaluaciones subjetivas, con participación del paciente, objetivas, realizadas por exámenes clínicos y complementarios, e índices que incluyen ambos tipos de evaluaciones.En Medicina Veterinaria, la colaboración del paciente en la anamnesis es nula y la del responsable del animal puede ser incompleta o poco confiable. Por lo tanto, la elaboración de índices está basada fundamentalmente en las observaciones realizadas por el médico veterinario. Nuestro grupo de trabajo desarrollo un índice clínico para evaluar la articulación tarso astragalina que incluye el índice de la AAEP modificado, las maniobras de palpación presión y flexión forzada, la observación del perfil articular y del grado de hidrartrosis y las características físicas del líquido sinovial.En el análisis tradicional del líquido sinovial se ha utilizado la medición de enzimas (AST, LDH, FA), proteínas totales, urea y el recuento de leucocitos. A partir del descubrimiento de nuevos biomarcadores (BMs) y de sus efectores en la cascada inflamatoria, se han comenzado a estudiar su aplicación en el diagnóstico precoz de la OA, el desarrollo de nuevos tratamientos y el seguimiento de los mismos. Un BM es un indicador molecular, directo o indirecto, de recambio anormal del tejido articular, que corresponde a un componente normal o a un subproducto de los procesos metabólicos del tejido articular. Dentro de los BM indirectos se incluyen las citoquinas y las MMPs. Las citoquinas son proteínas de comunicación celular, secretadas por las células de la inmunidad innata y adaptativa en respuesta a la presencia de distintos antígenos. Estas citoquinas median los procesos fisiológicos de las células inmunitarias y del tejido óseo y cartilaginoso y estimulan distintas respuestas defensivas e inflamatorias, tanto a nivel local (articular) como sistémico. En las afecciones articulares, se consideran de importancia al factor de necrosis tumoral ? (TNF-?), las interleuquinas 1 ? (IL-1 ?), 4 (IL-4) y 6 (IL-6), presentes en el líquido sinovial pero en niveles diferentes en los animales sanos y en aquellos que presentan signos clínicos de OA Las MMPs que tienen valor diagnóstico en la OA son, fundamentalmente, la MMPs 2 y 9, las cuales son gelatinasas, zinc y calcio dependientes, que participan en el recambio fisiológico y patológico de la MEC del cartílago, degradándola en los procesos de OA. Cuando existe un recambio óseo fisiológico, la liberación por parte de condrocitos, células sinoviales y fibroblastos de TNF-? e IL-1 ?, produce una respuesta de los osteoblastos que aumenta su producción de MMPs dentro de un rango de normalidad. La expresión de estas enzimas está altamente controlada por inhibidores tisulares de metaloproteasas (TIMs) Esta tesis plantea como hipótesis general que, en los equinos, las modificaciones de los marcadores biológicos del líquido sinovial, en las fases iniciales o tempranas de la OA, anteceden a la presentación de signos clínicos manifiestos y radiológicos. Además, es factible observar modificaciones bioquímicas en los periodos de remisión de la enfermedad. Sus objetivos son: ? Analizar el valor diagnóstico de los biomarcadores moleculares del líquido sinovial como predictores tempranos de la manifestación clínica de la osteoartritis y en el seguimiento de su evolución. ? Determinar si existe una interrelación temporal entre el diagnóstico clínico y el análisis bioquímico del líquido sinovial, en equinos con y sin signos clínicos de OA.? Establecer un índice clínico que permita el diagnóstico y seguimiento de la evolución de la enfermedad en sus distintas fases.? Evaluar si existe una relación entre la presencia o ausencia de signos clínicos y los cambios bioquímicos tempranos en el líquido sinovial.Para establecer valores de índice clínico poblacional, se trabajo con 123 equinos de salto y SPC tomados al azar de edades comprendidas entre 1 y 28 años. De este grupo inicial, se tomaron tres grupos de animales en función de su categoría etaria, para obtener valores de referencia de citoquinas y MMPs con el objetivo de caracterizar el perfil de estos biomarcadores en el líquido sinovial de equinos normales de distintas edades y en equinos con signos clínicos de OA. Los grupos fueron: i) potrillos sanos entre 1 y 2 años (n=21), ii) adultos con edad entre 3 y 14 años (n=84) sanos y con grados variables de enfermedad articular y iii) Adultos mayores a 15 años normales pero con problemas articulares por envejecimiento (n=18). A todos se le efectuó un examen clínico general y particular enfocado en los tarsos (articulación tibio astragalina) de ambos miembros posteriores, y se les extrajo líquido sinovial de ambos tarsos.En el líquido sinovial, se determinaron IL-1 ?, IL-4 IL-6, TNF-?, MMPs 2 y 9, Proteína C reativa (PCR), proteínas totales, albúminas y urea. A fin de cuantificar el examen clínico de la articulación, se desarrolló el siguiente índice clínico: A) Grado de Claudicación: 0. No perceptible. 1. Difícil de observar y no siempre aparente (dolor a la flexión forzada). 2. Difícil de observar al paso o al trote en línea recta pero aparente en ciertas circunstancias de mayor esfuerzo (trabajo en círculo). 3. Observable al trote bajo toda circunstancia - Sensibilidad a la palpación presión (de menor a mayor): 0 (-), 1 (+), 2 (++) y 3 (+++). - Flexión Forzada: 0 (-), 1 (+), 2 (++) y 3 (+++). B) Análisis macroscópico del líquido sinovial - Apreciación visual del volumen: 0. No hay 0,5. Escaso (- de 2 ml) 1. Intermedio (de 2 a 10 ml) 1,5. Abundante (+ de 10 ml) - Color: 0. Claro.0,4. Blanquecino transparente. 0,8. Amarillo fuerte.1,2. Sanguinolento.1,6. Rojizo hemorrágico.2. Sangre. - Turbidez: si (1) / no (0) - Formación de ?hilo? (estiramiento): 0,4: 5 cm. 0,8: 3 cm.1,2: 1 cm. 1,6: CoagulaC) Grado de alteración del perfil articular 1. Normal.2. Aumento del líquido extraído.3. Hidrartrosis leve. 4. Hidrartrosis severa con o sin fibrosis de la cápsula. 5. Inflamación articular (aumento de tamaño, dolor y calor).Al puntaje del índice clínico propuesto le corresponde un mínimo de 2,3 puntos (sin manifestación clínica) y un máximo de 20,1 puntos, considerado de máxima severidad.A los efectos de evaluar el valor de los diferentes niveles de BMs en relación al índice clínico, se trabajó con los valores de referencia de citoquinas y MMPs en líquido sinovial establecidos previamente en nuestro laboratorio Los resultados de la medición de las citoquinas (pg/ml) y MMPs (% de un control interno) se dividieron en 3 categorías etarias, potrillos, adultos y mayores de 15 años, debido a que los resultados de los animales jóvenes (IL-1 ?: 120.96 ± 42.49 ª; IL-4; 6.10 ± 1.43 d, g; IL-6: 115.14 ± 52.49; TNF-?: 41.42 ± 13.64 ª; MMP-2: 140.47 ± 61.98 ª; MMP-9: 55.45 ± 58.17 ª, e) y mayores (IL-1 ?: 57.12 ± 8.38; IL-4: 10.83 ± 4.20c; IL-6: 134.21 ± 45.24; TNF-?: 86.35 ± 43.25e; MMP-2: 49.13 ± 18.50; MMP-9: 8.28 ± 7.63) presentaban un comportamiento diferencial con el grupo de adultos y los adultos, entre ellos. En el grupo de animales adultos, en la mayoría de las variables estudiadas se observó una distribución claramente definida en grupos bajo (IL-1 ?: 37.37 ± 12.25 b; IL-4: 2.94 ± 0.93 ª, d; IL-6: 62.68 ± 25.16; TNF-?: 30.61 ± 6.39; MMP-2: 63.23± 25.61; MMP-9: 0.34 ± 0.15), medio (IL-1 ?: 61.75 ± 7.02; IL-4: 7.41 ± 0.71 d, g; IL-6: 148.66±28.86; TNF-?: 46.45 ± 10.94; MMP-2: 128.27±24.80 f; MMP-9: 11.19 ± 3.96) y alto (IL-1 ?: 171.56± 132.68; IL-4: 14.61 ± 5.37 g; IL-6: 363.73± 123.06 e; TNF-?: 108.71 ± 50.39 e; MMP-2: 354.29± 174.88 e; MMP-9: 85.95 ± 47.97 e). Sin embargo, en el caso del TNF-? y la IL-1 ? la distribución en tres grupos no fue tan marcada no encontrándose diferencia significativa entre los valores medios del grupo bajo y medio (a P < .001 vs. Adultos mayores; b P < .05 vs. Alto; c P < .01 vs. Alto; d P < .001 vs. Alto; e P < .001 vs. los otros grupos, f P < .05 vs. Adultos mayores; g P < .01 vs Adultos mayores). Respecto a la IL-1 ? se observó que los potrillos sanos presentaban un valor más elevado que el resto de los otros grupos. El valor medio del grupo de potrillos fue superado, aunque no significativamente (p>0.005), por el grupo de adultos con valores elevados.Finalmente, utilizando el índice clínico propuesto en 123 animales y en asociación con los resultados de los niveles de citoquinas y MMPs en el líquido sinovial se clasifico a la población en los siguientes rangos o categorías:Grupo 1: Potrillos Equinos jóvenes entre uno y dos años, los cuales no presentaban alteraciones clínicas articulares, ni variaciones de los biomarcadores debido a OCD.Grupo 2: Basal. Equinos adultos con índice clínico no superior a 4. Animales clínicamente sanos, sin alteraciones en los BMs articulares inflamatorios o con leves alteraciones de los mismos. Grupo 3: Equinos adultos con índice clínico 4-6 con leve sintomatología clínica de OA.3a forma no activa con disminución de IL-4 3b forma activa con aumento de varios BMs.Grupo 4: Equinos adultos con índice clínico 6-10 con sintomatología de OA con/sindeformaciones articulares.4a forma no activa con leve aumento general de BMs 4b forma activa con aumento de MMP 2, expresión de MMP9 y elevada la IL-6 y otros BMs.Grupo 5: Gerontes. Equinos adultos mayores de 15 años. Síntomas crónicos de OA por envejecimiento, con aumento de algunos BM y disminución de otros, característicos del proceso de envejecimiento. Una vez comprobada la respuesta de las diferentes citoquinas y MMPs en cuadros de OA en sus distintos estadios agudo, en período de remisión y crónico se efectuó la correlación de esos resultados con el índice clínico para validarlo y poder utilizarlo sistemáticamente en el diagnóstico clínico de la OA, al menos en las localizaciones tarsianas (r2= 0.65 para MMP 2 y r2= 0.82 para MMP ).Aparentemente, la modificación o elevación de las citoquinas y MMPs es un signo precoz que antecede a la alteración del índice clínico. Por otra parte en las diferentes categorías clínicas se observaron diferentes combinaciones siendo el descenso de la IL-4 un signo incipiente de alteración en el entorno articular. Por ejemplo, en los animales del grupo 4b, se observo un perfil característico, presente en un 30 % de los animales, caracterizado por IL-4 e IL-6 elevadas acompañadas de MMP 2 elevada. En el grupo basal y grupo 3b con citoquinas elevadas en un 25 % se presentó la asociación de IL-1 ? e IL-6 elevada pero con IL-4 normal o disminuida y MMP 2 normal. Y en los índices superiores más de 13 fue muy habitual encontrar la expresión de la MMP 9, ausente en el grupo Basal y valores de MMP 2 elevados. El seguimiento de un paciente con OA implica contar con técnicas semiológicas estandarizadas que desarrollen un examen fijo, repetible y con resultados validados por medio de métodos complementarios correlacionados, como ser artroscopías, análisis de biomarcadores, entre otros. Para lograr este objetivo, se debe contar con un índice que contemple la mayor parte de las observaciones anamnésicas y clínicas posibles.En esta experiencia, hemos implementado un índice utilizando una combinación de índices clínicos que recibieron un valor numérico cuya suma resultó en un puntaje máximo de 20,1 y un corte mínimo de 2,3, considerándose este valor el correspondiente al índice clínico de un animal sin alteraciones clínicas. Aparentemente, el índice clínico aumentado será el resultado de la alteración mecánica que la enfermedad articular produce. La evolución del índice clínico en la OA en general es un proceso paulatino, a excepción de lo que ocurre en los casos de artritis aguda, este va aumentando a medida que la función fisiológica del cartílago articular y el hueso subcondral se va alterando con el tiempo de permanencia de la enfermedad activa. Y los periodos de remisión a medida que avanza la OA son cada vez son de más corta duración.En el caso de los gerontes, se observaron índices clínicos superiores a 7, sin signos aparentes de OA, solo de envejecimiento, y en estos casos los valores en el índice clínico fueron muy difíciles de retrotraer no obstante observar descenso en los BMs.Los BMs indirectos del metabolismo del cartílago, estudiados en esta experiencia, han sido las IL-1 ?, IL-4, IL-6, el TNF-? y las MMPs 2 y 9. La IL-1 y el TNF-? son liberados por la membrana sinovial y los condrocitos ante una sinovitis, producto del trauma articular. Ambas citoquinas se liberan en exceso y aumentan la tasa de degradación de proteoglicanos, disminuyen su síntesis o actúan en forma conjunta en ambos procesos. Esto se logra, en parte por la liberación de MMPs y prostaglandina E2. La IL-6 puede ser producida por fibroblastos sinoviales y condrocitos articulares, inducida por la síntesis de IL-1 ? y TNF-?. A su vez, la IL-6 estimula a nivel hepático la síntesis de proteínas de fase aguda como la PCR. En los grupos clínicos de mayor grado, la IL-4 vuelve a aumentar a los niveles basales e incluso en algunos casos aumentar al doble del basal, pero en forma asociada con niveles elevados de IL-6. Por otra parte, pareciera observarse que los niveles elevados de biomarcadores se presentan más asiduamente en la categoría de mayor índice clínico y que, generalmente, comprenden a animales de mayor edad con alteraciones de mayor cronicidad.Los resultados preliminares obtenidos por nuestro grupo de trabajo mostraron la ausencia de BMs en animales sanos o en períodos de remisión y su presencia en animales con OA activa. Sin embargo, nosotros hemos aportado el conocimiento que en animales con ausencia de síntomas clínicos es dable encontrar BMs elevados como indicador precoz de futuras OA.El TNF-? es el principal mediador de la respuesta aguda que desencadena el proceso osteoartrítico. El aumento del TNF-? se produce en los primeros momentos del proceso inflamatorio, por lo que es muy probable no encontrarlo en niveles elevados en el líquido sinovial. En nuestra experiencia, el TNF-? se encontró en poca cantidad de caballos tanto clínicamente sanos como en fase no activa de la OA. Por lo tanto, su valor radica en encontrarlo presente en niveles elevados para confirmar el proceso inflamatorio agudo. Pero a la inversa, su ausencia no tiene valor diagnóstico para determinar la no existencia de la enfermedad. En este punto también es importante mencionar la relación existente entre TNF-? e IL-1 ? ya que la liberación del TNF-? produce un aumento en la liberación de IL-1 ? y ésta tiene mayor capacidad de activación de los tipos celulares antes descriptos para la liberación de MMPs. La IL-1 ? se presentó elevada en los animales que se encontraban en fase activa de la OA como puede observarse en la sub clasificación ?b? de las distintas categorías del índice clínico presentado en esta tesis. A su vez se debe considerar que para reducir la liberación de MMPs, habría que inhibir también la IL-6 porque se plantea un efecto redundante en el cual ante la ausencia de una, la otra llevaría a cabo las acciones, por lo tanto si se inhibe solamente una de las dos, la actividad enzimática no se vería reducida. En equinos clínicamente sanos, pero con elevación de IL-6, dado que es una citoquina proinflamatoria se podría considerar que estos animales estaban en período de remisión o que ya existía una destrucción del cartílago articular. Las MMPs 2 y 9 se encuentran aumentadas en proceso patológicos osteoarticulares, superando las concentraciones de TIMs. Sin embargo, la MMP 2 no presenta valores tan elevados como la MMP 9 en estos cuadros y puede considerarse que presenta una acción homeostática al remover el cartílago anormal o envejecido. Por otro lado, la MMP 9 o bien no se puede detectar en condiciones normales o se encuentra en valores basales muy bajos, aumentando notablemente en cuadros de OA, artritis sépticas de evolución lenta y artritis reumatoidea en el ser humano. Por lo tanto, según el perfil de MMPs presentes, se puede inferir que se está ante un cuadro de remodelación normal mediada por la MMP 2 o ante una intensa degradación del cartílago con expresión aumentada de la MMP 9.En nuestros trabajos hemos observado valores bajos de MMP 2 y ausencia de MMP 9 en animales clínicamente sanos. En animales con OA en período activo, la MMP 2 aumentó significativamente (p<0.001) sobre los valores de referencia en equinos sanos. La MMP 9 aumentó levemente en equinos en fase de remisión no activa y en valores superiores en fase crónica de la enfermedad.En conclusión, los equinos que presentaron sintomatología clínica compatible con OA, tuvieron alteraciones en los valores de citoquinas, MMPs y perfiles proteómicos en líquido sinovial, mientras aquellos libres de síntomas, presentaron valores compatibles con articulaciones normales. Sin embargo, animales sin síntomas clínicos evidentes o subclínicos presentaron alteraciones en el perfil de citoquinas y MMPs como un signo precoz de alteración del medio intraarticular o como indicador del estadío de remisión clínica. El índice clínico presentó alta correlación con las modificaciones bioquímicas agudas, crónicas o recidivantes en equinos con OA o en equinos sin presencia de la enfermedad. Por lo tanto, este índice puede ser utilizado en el diagnóstico clínico de OA ya que los BMs sinoviales validan su evolución tanto positiva como negativa. De la misma manera, los BMs estudiados en esta experiencia pueden ser utilizados como métodos complementarios precoces en la detección, seguimiento y evolución terapéutica de OA
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Abstract:
Degenerative joint disease or osteoarthritis (OA) is the most frequent disease in the horse and it is considered, internationally, as responsible for 60% of the sport horse lameness problems.In sports in which the horse life is prolonged, in addition to the changes of age chronic forms of the disease due to the failure of the cartilage joint to withstand cyclical sport trauma are frequently observed. In young animals, the repeated injuries can lead to the removal of the horse from competition, even at relatively early ages. This repeated trauma, product of the sports competition, produces synovitis and capsulitis, damage to collateral ligaments, intra articular fractures and subchondral bone lesions. These processes lead to the clinical manifestations of OA, either acute or chronic with recurrent relapses characteristic of this disease.OA can be defined as a progressive, degenerative disease that is characterized by a loss of cartilage joint, subchondral bone eburnification and inflammation of the synovial membrane and synovial fluid increased. The resulting inflammatory processes produce proinflammatory cytokines that activate matrix metalloproteinases (MMPs) which in turn feedback the process by destruction of cartilage extracellular matrix (CEM).The diagnosis of OA is based on the clinical semiology and complementary methods. In the clinical diagnosis is of fundamental importance the standardized description of the symptoms of a disease, as well as signs of their evolution or progression in time to unify the criteria of diagnosis among professionals, to determine the type and severity of the disease, to define guidelines for the inclusion of patients in research trials, to characterize the animal models used in the research of diseases affecting human beings and finally, for statistically quantify the progress, successes and failures in the treatments. Several scores for evaluating OA developed by organizations such as the International Knee Documentation Committee (IKDC) and the International Cartilage Repair Society (ICRS) are described in human medicine. These scores include subjective assessments, with participation of the patient, objective, carried out by clinical and complementary examinations, and scores that include both types of evaluations. In veterinary medicine, the collaboration of the patient in the anamnesis is null and that obtained from the person in charge of the animal can be incomplete or unreliable. Therefore the preparation of scores is fundamentally based on the observations made by the veterinarian. Our working group developed a clinical score for evaluating the tarsus astragalin joint comprising the AAEP modified score, manoeuvres of palpation pressure and forced flexions, observation of the profile joint and the degree of hydrarthrosis and physical characteristics of synovial fluid.The traditional analysis of synovial fluid included evaluation of enzymes (AST, LDH, FA), total protein, urea and the white blood cell count. Following the discovery of new biomarkers (BMs) and its effectors in the inflammatory cascade, their application in early diagnosis of OA, the development of new treatments and the monitoring thereof, have begun to be studied. A BM is a direct or indirect molecular indicator of abnormal joint tissue replacement, which corresponds to a normal component or a byproduct of the metabolic processes of the articular tissues. The indirect BMs include cytokines and MMPs. Cytokines are proteins of cellular communication, secreted by the cells of the innate and adaptive immune system in response to the presence of different antigens. These cytokines mediate the physiological processes of immune cells and bone and cartilaginous tissues and stimulate different defensive and inflammatory responses, both at the local level (joint) or systemic. In articular diseases, tumour necrosis factor ? (TNF-?), interleukins 1 ? (IL-1 ?), 4 (IL-4) and 6 (IL-6), present in the synovial fluid, but at different levels in healthy animals and those who have clinical signs of OA, are considered of importance.The MMPs that have diagnostic value in OA are, fundamentally, the MMPs 2 and 9 which are proteases, zinc and calcium dependent, involved in physiological and pathological replacement of the MEC, degrading it in an OA processes. When there is a physiological bone turnover, the TNF-? and IL-1 ? released by chondrocytes, synovial cells and fibroblasts, produces a response of osteoblasts which increases the production of MMPs within a normal range. The expression of these enzymes is highly controlled by tissue inhibitors of metalloproteases (TIMs). This thesis rises as a general hypothesis that, in horses, the modifications of the synovial fluid biological markers, in the initial or early stages of OA, precede the presentation of clinical and radiological signs. In addition, it is possible to observe biochemical changes in periods of remission of the disease. Its objectives are to: ? Analyze the diagnostic value of synovial fluid molecular biomarkers as early predictors of clinical manifestation of osteoarthritis and in the monitoring of their evolution. ? Determine if there is a temporal relationship between clinical diagnosis and synovial fluid biochemical analysis, in horses with and without clinical signs of OA. ? Establish a clinical score that allows the diagnosis and monitoring of the evolution of the disease in its various phases.? To assess whether there is a relationship between the presence or absence of clinical signs and early biochemical changes in the synovial fluid. To establish population clinical score values, 123 show jumping and Thoroughbred horses, aged between 1 and 28 years taken randomly were evaluated.From this initial group, three groups of animals were differentiated, according to their age category, to obtain reference values of cytokines and MMPs in order to characterize the profile of these biomarkers in the synovial fluid of healthy horses of different ages and horses with clinical signs of OA.The groups were: i) healthy foals between 1 and 2 years (n = 21), ii) healthy adults and with varied degrees of OA, aged between 3 and 14 years (n = 84) and iii) healthy adults over 15 years but with articular problems due to aging (n = 18). A general clinical examination and a particular one focused on the tarsal joint of both hind limbs were made, and synovial fluid was sampled from both tarsi. From these samples, IL-1 ?, IL-4, IL-6, TNF-?, MMPs 2 and 9, reactive protein C (RPC), total protein, albumin, and urea were determined. In order to quantify the clinical examination of the joint, the following clinical score was developed:A) Score of lameness:0. No detectable.1. Difficult to observe and not always apparent (forced flexion pain).2. Difficult to observe on walking or trotting in straight line but apparent in certain circumstances of greater effort (work in circle). 3. Always observable on trotting.- Sensitivity to palpation pressure (minor to major): 0 (-), 1 (+), 2 (++) and 3 (+++).- Forced flexion: 0 (-), 1 (+), 2 (++) and 3 (+++). B) Macroscopic analysis of synovial fluid- Visual appreciation of volume: 0. No fluid0.5. Scarce (- 2 ml) 1. Intermediate (from 2 to 10 ml)1.5. Abundant (+ 10 ml) - Colour: 0. Transparent. 0.4. Transparent whitish. 0.8. Strong yellow. 1.2. Blood stained. 1.6. Reddish bleeding. 2. Blood.-Turbidity: yes (1) / no (0)- Formation of 'thread' (stretch): 0.4: 5 cm.0.8: 3 cm. 1.2: 1 cm.1.6: ClotC) Score of profile joint damage 1. Normal.2. Increase of fluid. 3. Slight hydrarthrosis. 4. Severe hydrarthrosis with or without capsule fibrosis. 5. Joint inflammation (increased size, pain, and heat).The proposed clinical score corresponds to a minimum of 2.3 points (no clinical manifestation) and a maximum of 20.1 points, considered of maximum severity.To assess the value of different levels of BMs in relation to the clinical score, we worked with the cytokines and MMPs reference values in synovial fluid previously set in our laboratory. Results from the measurement of cytokines (pg/ml) and MMPs (% of an internal control) were divided into 3 age categories, foals, adults and adults older than 15 years because results of the young animals (IL-1 ?: 120.96 ± 42.49 ª; IL-4; 6.10 ± 1.43 d, g; IL-6: 115.14 ± 52.49; TNF-?: 41.42 ± 13.64 ª; MMP-2: 140.47 ± 61.98 ª; MMP-9: 55.45 ± 58.17 ª, e) and adults older than 15 years (IL-1 ?: 57.12 ± 8.38; IL-4: 10.83 ± 4.20c; IL-6: 134.21 ± 45.24; TNF-?: 86.35 ± 43.25e; MMP-2: 49.13 ± 18.50; MMP-9: 8.28 ± 7.63) had a differential performance between them and the group of adults and adults, among them. In the adult animals group, a clearly defined group distribution was observed in most of the variables studied in groups low (IL-1 ?: 37.37 ± 12.25 b; IL-4: 2.94 ± 0.93 ª, d; IL-6: 62.68 ± 25.16; TNF-?: 30.61 ± 6.39; MMP-2: 63.23± 25.61; MMP-9: 0.34 ± 0.15), medium (IL-1 ?: 61.75 ± 7.02; IL-4: 7.41 ± 0.71 d, g; IL-6: 148.66±28.86; TNF-?: 46.45 ± 10.94; MMP-2: 128.27±24.80 f;MMP-9: 11.19 ± 3.96) and high (IL-1 ?: 171.56± 132.68; IL-4: 14.61 ± 5.37 g; IL-6: 363.73± 123.06 e; TNF-?: 108.71 ± 50.39 e; MMP-2: 354.29± 174.88 e; MMP-9: 85.95 ± 47.97 e). However, the distribution of TNF-? and IL-1 ? in the three groups was not so marked, founding no significant differences between the average values of the low and medium group (a P < .001 vs. older adults; b P < .05 vs. High; c P < .01 vs. High; d P < .001 vs. High; e P < .001 vs. the other groups, f P < .05 vs. older adults; g P < .01 vs. older adults).IL-1 ? of healthy foals had a higher value that the rest of the other groups. The IL-1 ? average value of the foals group was overcome, albeit not significantly (p > 0.005), by the adults group with high values. Finally, using the proposed clinical score in 123 animals and associated with the results of the levels of cytokines and MMPs in the synovial fluid, the population was qualified in the following ranges or categories: Group 1: Foals young horses between one and two years, with no clinical alterations of the joints, or variations of biomarkers due to OCD. Group 2: Basal Equine adults with a clinical score no more than 4. Clinically healthy animals,without alterations in the articular inflammatory BMs or with slight alterations of them. Group 3: Adult horses with a clinical score of 4-6 with mild clinical symptoms of OA. 3a non active form with a decrease in IL-4 3b active form with several increased BMs.Group 4: Adult horses with a clinical score of 6-10 with OA symptoms and with or without changes in articular shape.4a non activate form with slight overall increase of BMS 4b is active with rising 2 MMP, MMP9 expression and high IL-6 and other BMs. Group 5: Elderly horses. Adults horses more than 15 years old. Chronic symptoms of OA by aging, with increases in some BMs and decreases in others, characteristic of the aging process.Once the response of different Cytokines and MMPs in OA cases was proved, in acute, remission or chronic stages, those results were correlated with the clinical score to validate it,and use it consistently in the clinical diagnosis of OA, at least in the tarsal locations (r2 = 0.65 for MMP-2 and r2 = 0.82 for MMP-9). Apparently, the modification or elevation of cytokines and MMPs is an early sign that precedes the alteration of clinical index. On the other hand, in the different clinical categories different combinations were observed, being the decrease of IL-4 an incipient sign of disturbance in the articular environment. For example, in the 4b group, a characteristic profile, present in 30% of the animals, was characterized by a high IL-4 and IL-6 accompanied by high MMP 2. In the basal group and group 3b, with a 25% elevation in cytokines, an association of IL-1 ? and IL-6 high but with normal or decreased IL-4 and MMP 2 normal. And at higher scores more than 13, was very common to find the expression of MMP 9, absent in the Basal group and elevated MMP 2 values. The follow-up of a patient with OA involves standardized semiologic techniques that can develop a fixed test, repeatable and with results validated by means of correlated complementary methods, such as arthroscopy, analysis of biomarkers, among others. To achieve this goal, a score that covers most of the possible anamnesic and clinical observations must be achieved.In this experience, we have implemented a score using a combination of clinical scores, which received a numerical value whose sum resulted in a maximum score of 20.1 and a minimum cut of 2.3, whereas this value correspond to the clinical score of an animal without clinical alterations. Apparently, the increased clinical score will result from the mechanical alteration that the articular disease produces. In general, the clinical score evolution of OA is a gradual process, with the exception of what happens in cases of acute arthritis, with an increase, as the physiological function of the cartilage and subchondral bone begins to be modify, as the active disease stays in time. And periods of remission as OA progresses are increasingly shorter.In the case of the elderly, were observed clinical scores higher than 7, no apparent signs of OA, only of aging, and in these cases the clinical score values were very difficult to roll back although the drop in the BMs.The indirect BMs of the cartilage metabolism, studied in this experience, were IL-1 ?, IL-4, IL-6, TNF-? and MMPs 2 and 9. IL-1 and TNF-? are released by the synovial membrane and articular chondrocytes with synovitis, product of the trauma. Both cytokines are released in excess and increase the rate of degradation of proteoglycan, decreases their synthesis or act together in both processes. This is partially accomplished by the release of MMPs and prostaglandin E2.IL-6 can be produced by articular chondrocytes and synovial fibroblasts, induced by the synthesis of IL-1 ? and TNF-?. At the same time, IL-6 stimulates at hepatic level acute phase protein synthesis, like RCP. In clinical groups of higher scores, IL-4 increase to basal levels and even in some cases increases twice the basal, but associated with elevated levels of IL-6. On the other hand, it seems that elevated levels of biomarkers occur more regularly in the category of greatest clinical score and that, generally, they include older animals with higher chronic changes. Preliminary results obtained by our working group showed the absence of BMs in healthy animals or in periods of remission and its presence in animals with active OA. However, we have provided the knowledge that in animals with no clinical symptoms increased BMs act as an early indicator of future OA. The TNF-? is the main mediator of the acute response that triggers the osteoarthritic process. The TNF-? increase occurs in the first moments of the inflammatory process, so it is very likely not found it in high levels in the synovial fluid. In our experience, the TNF? was found in little amount in horses both clinically healthy and in a non active phase of the OA. Therefore, its value lies in finding it present in elevated levels to confirm the acute inflammatory process. On the contrary, the absence has no diagnostic value to determine the non-existence of the disease. At this point, it is also important to mention the relationship between TNF-? and IL-1 ? since the release of TNF-? cause an increase in the release of IL-1 ?, causing a greater activation of the previously described cell types for the release of MMPs.In active OA, IL-1 ? is elevated as it can be seen in animals in the sub "b" classification of the various categories of the clinical score presented in this thesis. At the same time, to reduce the release of MMPs, IL-6 should also been inhibit, because there is a redundant effect in which in the absence of one, the other would carry out the same actions. Therefore if only one of the two it is inhibit, the enzyme activity would not be reduced.In clinically healthy horses, with high IL-6, since this pro-inflammatory cytokine, it could be considered that these animals were in a remission period or that it already existed a destruction of articular cartilage. MMPs 2 and 9 are increased in bone pathological process, surpassing the concentrations of TIMs. However, in these cases the MMP 2 presents values not as high as the MMP-9 and can be causing an homeostatic action, removing aged or abnormal cartilage. By other side, MMP 9 either it cannot be detected in normal joints or are in very low baseline, increasing significantly in cases of OA, septic slow-onset arthritis and rheumatoid arthritis in human beings. Therefore, according to this MMPs profile, it can be inferred that we are in front of a MMP-2-mediated normal remodelling processor or in front of an intense degradation the of cartilage with increased MMP 9 expression. In our work, in clinically healthy animals we observed low levels of MMP-2 and absence of MMP-9. In animals with active OA, the MMP-2 significantly increased (p < 0.001) over the reference values of healthy horses. In horses in non active remission phase, the MMP-9 increased slightly and in horses in the chronic phase of the disease, the values were higher. In conclusion, in horses who presented clinical symptoms compatible with OA, cytokines and BMs values and synovial fluid proteomic profiles were modified, while those free of symptoms, presented values compatible with normal joints. However, animals without clinical symptoms or subclinical showed alterations in the cytokines and MMPs profile of as an early sign of alteration of the intra-articular medium or as an indicator of a clinical remission stage. The clinical score presented high correlation with acute, chronic or recurrent biochemical modifications in OA horses or horses without the presence of the disease. Therefore, this score can be used in the clinical diagnosis of OA since the synovial BMs validated its evolution both positive and negative. In the same way, the BMs studied in this experience can be used as early complementary method in the detection, monitoring and therapeutic evolution of OA. Key Words: Osteoarthritis, diagnose, clinical score
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Identificador(es):
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=masteruba&cl=CL1&d=HWA_1462
Filiación Institucional:
Fil: Perrone, Gustavo Mario. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina
Institución aportante:
Facultad de Ciencias Veterinarias
Biblioteca cooperante:
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Cita bibliográfica:

Perrone, Gustavo Mario  Diagnóstico de la osteoartritis en el equino. Relación entre signos clínicos y biomarcadores proinflamatorios en el líquido sinovial  (tesis de maestría). Universidad de Buenos Aires.  Facultad de Ciencias Veterinarias. [consultado:  ] Disponible en el Repositorio Digital Institucional de la Universidad de Buenos Aires:  <http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=masteruba&cl=CL1&d=HWA_1462>