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Porta, Natalia Gabriela
2019-03-27

Temas:   Virología  - Ternero  - Virus de la leucosis bovina  - Anticuerpos  - BLV  - ELISA  - PCR  - Ig Y  - Transmisión  - Leche

Descripción: En este trabajo se estudió el efecto del uso de anticuerpos de yema de huevo (IgY) anti BLV específicos como suplemento en la leche de consumo de terneros durante todo el período de cría, monitoreando a los animales desde el nacimiento hasta los 9 meses de vida. El objetivo central fue obtener evidencia que el consumo de leche pueda ser una vía de transmisión del virus y si así fuera, proponer una alternativa para interferir con el desafío natural de infección por BLV por consumo de leche. Como objetivo complementario, se realizaron infecciones experimentales en ovinos en las que se determinó la dosis mínima infectiva tanto de virus asociado a células FLKBLV como de virus libre en sobrenadante celular de FLK-BLV. También se analizó la capacidad neutralizante de los anticuerpos presentes en suero de un animal infectado con BLV. Cabe destacar que previamente al uso de animales se intentó poner a punto un ensayo in vitro. Se realizó la caracterización del rodeo donde se desarrolló la experiencia con terneros. Se observó una prevalencia individual de anticuerpos del 96% en las muestras de sangre, y de un 90% en las muestras de leche. Los títulos de anticuerpos en sangre fueron significativamente más altos que los encontrados en leche. Se detectó la presencia de provirus en el 82% de las muestras de sangre y 59% de las muestras individuales de leche. La carga proviral en leche fue significativamente menor que en sangre. En la leche de tanque del ordeñe diario, se encontraron anticuerpos con un título de 1:32 en todas las muestras, mientras que en las muestras de leches individuales el rango de títulos de anticuerpos variaba entre <1:16 y >1:64. Al comparar las leches individuales con un título de 1:32 con las leches de tanque que poseen el mismo título, se pudo observar que el 90% de las leches de tanque evidencian cargas provirales detectables, mientras que solo el 60% de esas leches individuales evidencian carga proviral detectable. Se detectaron anticuerpos anti BLV en el 95,5% de los terneros recién nacidos, lo que demostraría un correcto calostrado de los animales, de los cuales el 13% de los terneros nacieron infectados (detección de provirus en sangre). En el bioensayo de ovinos, se observó que fueron necesarias 5.000 células FLK-BLV por inoculo para generar la infección en los dos corderos inoculados, mientras que el virus libre en sobrenadante celular FLK-BLV resultó infectivo hasta la dilución 1/1.000. El suero bovino positivo a BLV impidió la infección en los corderos inoculados con el virus libre de células, mientras que todos los ovinos se infectaron cuando se inocularon con virus libre de células en presencia de suero bovino negativo a BLV. Se produjo la cantidad necesaria de un preparado de polvo de huevo con anticuerpos específicos anti BLV para el ensayo controlado de eficacia a campo. La preparación fue caracterizada por ELISA y por infección experimental en corderos. Todos los corderos resultaron infectados cuando fueron inoculados con virus libre de células FLK-BLV previamente incubado con la preparación de IgY concentrada anti BLV y con la preparación de polvo de huevo anti BLV, no demostrando la capacidad de las IgY anti BLV de neutralizar el virus presente en el sobrenadante de células FLK-BLV. Si bien el ensayo in vivo fue una alternativa para el ensayo in vitro con el objeto de analizar la capacidad neutralizante de los anticuerpos IgYs, y aunque no se obtuvieron los resultados esperados, su realización ha resultado beneficiosa para el grupo de trabajo, como una herramienta nueva y válida para realizar distintos estudios. Este polvo fue suministrado a los terneros en cada toma de leche durante la cría. Paralelamente en un grupo control, no se les ofreció ningún suplemento en las tomas diarias de leche. En los primeros días de vida de los terneros se observó tanto en el grupo control como en el grupo tratado, anticuerpos en el 93% de las muestras. Estos valores concuerdan con lo previamente reportado para infecciones en terneros recién nacidos. Los siguientes muestreos se realizaron hasta completar el seguimiento a los 9 meses de los terneros en donde se observó una prevalencia del 6.6% en el grupo tratado y del 7.7% en el grupo control. Este trabajo de tesis aportó datos sobre la epidemiologia natural de la infección, que deberían ser utilizados para el diseño y prosecución de una estrategia de control. En un contexto de infección natural francamente endémica, la estrategia de uso de anticuerpos como complemento en la toma diaria de leche podría ser valiosa para la reducción de la dinámica en la edad temprana.
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Tipo de documento: tesis doctoral  |  Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 113 h.

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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Lomónaco, Marina
2018-04-19

Tipo de documento: tesis doctoral  |  Formato: unknown  (tamaño kb)  Pag. 86 h.

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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Dibárbora, Marina
2016-03-28

Descripción: La infección por Influenza A virus (IAV) es considerada una de las principales causas de enfermedad respiratoria en cerdos. Además, su carácter zoonótico representa un riesgo para la salud pública. En Argentina, si bien existían reportes de presencia de anticuerpos, el primer aislamiento de IAV en cerdos fue en el año 2008, de un subtipo H3N2 completamente humano. Luego, asociado a la pandemia humana del año 2009, se aisló un subtipo H1N1 pandémico (H1N1pdm09) y se reportaron múltiples cuadros clínicos relacionados a este virus. Es por ello que el objetivo general de este trabajo fue caracterizar las cepas de IAV circulantes en cerdos en Argentina y la forma de presentación de dicha infección. Se realizaron estudios clínicos, patológicos, serológicos y virológicos en nueve granjas intensivas porcinas. Los resultados demostraron una presentación clínico-epidemiológica endémica en 8 granjas en animales de entre 21 y 50 días. Desde el punto de vista anatomopatológico, el diagnóstico más frecuente fue la bronconeumonía supurativa con bronquiolitis necrotizante. Los estudios serológicos evidenciaron dos patrones. En uno de ellos se observó una caída de los anticuerpos calostrales entre los 21 y 49 días y un posterior aumento marcado en el porcentaje de animales seropositivos (20 a 80%), lo cual se asoció con una circulación activa del virus. En cambio, en el otro patrón, observado en dos granjas, se detectó un bajo porcentaje de animales seropositivos en reproductores, menos del 50%, y en la línea de producción, el mayor porcentaje de cerdos positivos fue del 20%, lo cual es sugerente de una infección endémica con baja circulación del virus. Los resultados de los ensayos de Inhibición de la Hemoaglutinación detectaron anticuerpos contra H1pdm09, ?H1 y H3 en todas las granjas y en el 75% de los animales presencia de anticuerpos contra más de un subtipo. Se detectó, mediante rRT-PCR, IAV en 7 granjas, la mayoría entre los 21 y 50 días de vida, y se obtuvieron 5 aislamientos, 4 fueron caracterizados como subtipo H1N1pmd09 y uno como subtipo H3N2. Se realizaron además, estudios clínicos y virológicos en 12 granjas intensivas que reportaron cuadros compatibles con infección por IAV. La inspección clínica determinó, en 8 granjas, el cuadro clínico endémico y en 4 granjas se observó la forma epidémica. La edad de presentación de los signos clínicos fue variable, siendo los animales de postdestete los más afectados (30 a 40 días). Todas las granjas evaluadas fueron positivas por rRT-PCR y la edad de detección del virus coincidió con la edad de presentación de los signos clínicos. Se obtuvieron un total de 13 aislamientos de IAV, H1N1pdm09 (7), H1N2 ?2 (3) y H3N2 cluster II (3). Se evaluó la circulación de IAV en pequeños productores y productores familiares. Se tomaron muestras de 57 establecimientos de distintas regiones del país. Los estudios serológicos detectaron la presencia de anticuerpos contra H1pdm09 en más del 60% de los establecimientos y en el 40% de los animales, mientras que menos del 17% de los establecimientos y del 2% de los animales fueron positivos para el subtipo H3. Se realizó el diagnóstico y la caracterización de IAV a partir de muestras enviadas al Laboratorio de Aves y Porcinos, CICVyA, INTA. Se recibieron muestras de 51 establecimientos, de 10 provincias y se obtuvieron 27 aislamientos. El 70% de los subtipos aislados fueron caracterizados como H1N1pdm09. También se obtuvieron aislamientos de los subtipos ?2 H1N2; ?2 H1N1; ?1 H1N1 y H3N2. El análisis filogenético del total de los aislamientos (N=45), mostró un predominio en la circulación del subtipo H1N1pdm09. Solamente 5 aislamientos se caracterizaron como subtipo H3N2 cluster II, 8 aislamientos como ?2 H1N2, un único aislamiento como subtipo ?2 H1N1 y el restante como subtipo ?1 H1N2. Todos ellos poseen gen M pandémico y genes externos de IAV humanos estacionales. Se identificaron 9 introducciones de IAV de humanos a cerdos, 7 relacionadas con la pandemia H1N1 del año 2009 y 2 con IAV humanos estacionales H3 y H1, circulantes más de una década atrás. Los estudios de cartografía antigénica demostraron que, a pesar de la similitud a nivel genético en los virus detectados en el país, las diferencias antigénicas son marcadas. La infección por IAV se encuentra ampliamente diseminada en cerdos de nuestro país. En la mayoría de las granjas evaluadas se observó la presentación endémica (subclínica). Estos resultados alertan sobre la posible generación de virus reasortantes y la presencia de un porcentaje variable de animales sin anticuerpos contra IAV que permitirían la persistencia de la infección. La totalidad de los subtipos de IAV circulantes en cerdos en Argentina corresponde a introducciones de virus de origen humano, en algunos casos relacionados con cepas circulantes más de una década atrás. Esto resalta la importancia del hombre en la epidemiología de IAV en cerdos en nuestro país y supone un riesgo para la población humana por la posibilidad de reintroducciones. La información generada en este estudio muestra que los subtipos circulantes en el país no se corresponden con los reportados en Norteamérica y Eurasia. Este hecho, sumado a la alta variación antigénica observada y a la rápida evolución de IAV, alerta sobre la necesidad de desarrollo de inmunógenos locales y ensayos diagnósticos que permitan el correcto control de IAV en las explotaciones porcinas de nuestro país.
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Tipo de documento: tesis doctoral  |  Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 105 h.

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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Marfil, María Jimena
2019-03-29

Descripción: La tuberculosis bovina, causada por Mycobacterium bovis (M. bovis), es endémica en la Argentina. Su presencia en el ganado bovino representa un riesgo para la salud humana debido a su carácter zoonótico, pudiendo además afectar a diversos mamíferos. En el hombre, M. bovis causa enfermedad con presentación pulmonar o extrapulmonar siendo la clínica indistinguible de la producida por Mycobacterium tuberculosis. Los más expuestos son los niños que consumen leche o sus derivados sin pasteurizar, los adultos relacionados con la actividad laboral pecuaria y también los cazadores. Para evitar la llegada del agente al consumidor, una de las últimas barreras de protección es la inspección bromatológica en el frigorífico para poder detectar lesiones compatibles con tuberculosis y decomisar los órganos afectados y si está generalizado la res completa. Se realiza visualmente y por palpación, pero debido a la patogenia de la tuberculosis, sólo las lesiones crónicas pueden ser evidenciadas por este monitoreo. La micobacteria puede estar presente incluso en tejidos sin lesión aparente, siendo los principales órganos afectados los linfonódulos y los pulmones, pudiéndose encontrar en otros órganos parenquimatosos como el hígado. Esto puede conducir a escapes del sistema de vigilancia permitiendo que las micobacterias lleguen a los comercios y posteriormente al consumidor. En este trabajo fueron recolectados 210 pulmones junto con los linfonódulos orrespondientes y 6 hígados bovinos, provenientes de un frigorífico y de 6 carnicerías de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires y de la provincia de Buenos Aires. Los pulmones recolectados en el frigorífico fueron inspeccionados in situ y se tomaron muestras del órgano para el trabajo en el laboratorio. Los pulmones e hígados que fueron comprados completos en carnicerías y fueron inspeccionados en el laboratorio. Se obtuvieron un total de 5 aislamientos de M. bovis en medio Stonebrink confirmados por PCR IS-6110 (aislamientos N° 134, 719, 179, 182 y 184) y además 12 aislamientos de micobacterias no tuberculosas confirmadas por la secuenciación de los genes hsp65, rpoB, 16S ARNr y secuenciación genómica de alto rendimiento para uno de ellos. Los aislamientos de M. bovis fueron caracterizados molecularmente por Spoligotyping y MIRU-VNTR. Se pudieron distinguir 3 patrones de Spoligotyping que se correspondieron con 3 patrones de MIRU-VNTR, 3 aislamientos compartieron ambos patrones y los otros 2 fueron únicos. Adicionalmente, se investigó en 3 de los aislamientos su capacidad de resistencia a drogas utilizadas en el tratamiento de la tuberculosis en humanos (rifampicina, isoniazida, etionamida, levofloxacina y estreptomicina), encontrándose que el aislamiento 184 era resistente a isoniazida y el aislamiento 134 era multirresistente (presentando resistencia a los 4 antibióticos probados y considerado ?border? para levofloxacina). Se realizó la secuenciación completa del genoma de uno de los aislamientos identificado como M. kansasii empleando una plataforma Illumina mySeq. El genoma fue anotado y se describió sus características así como también se evaluó la presencia de single nucleotide polymorphism (SNPs) en genes de virulencia y genes relacionados a la resistencia a antibióticos y codificantes de antígenos empleados para el diagnóstico de tuberculosis. Se evaluó la virulencia y transmisibilidad de los aislamientos N° 134 y 182 junto con una cepa de referencia M. bovis AN5 (considerada de virulencia intermedia), en un modelo murino. Los animales fueron inoculados intratraquealmente, con 1x105 UFC de cada una de las cepas a evaluar, y dichos animales se pusieron en contacto con ratones sin inocular en una relación 1:1. Se evaluó la virulencia en los animales inoculados, mientras que en los contactos sanos, se evaluó la transmisibilidad de las cepas. Se realizó la eutanasia de 5 animales infectados y 5 animales contactos sanos de cada grupo, en los tiempos 30, 60 y 90 días post-inoculación. Se cultivaron los pulmones y bazos de todos los animales infectados y los contactos sanos en los medios apropiados, evaluando su crecimiento semanalmente. Adicionalmente, los bazos fueron procesados para cuantificar las citoquinas IL-4, TNF ? e INF? por citometría de flujo mediante el kit comercial Cytometric bead array. El aislamiento N° 134 demostró ser virulento por producir sintomatología incompatible con la vida al día 16 posterior a la inoculación, produciendo la muerte de 9 animales, los 6 restantes fueron eutanasiados. El aislamiento N° 182 generó esplenomegalia en los ratones infectados, pero no se observó el desmejoramiento ni la muerte de los animales. Además, se pudo describir la transmisibilidad del aislamiento 182, mediante el aislamiento de la micobacteria a partir de bazo de uno de los animales ?contacto?. A partir del presente trabajo se pudo detectar la presencia de micobacterias tanto zoonóticas como ambientales en vísceras comercializadas. La virulencia, transmisibilidad y la resistencia a antibióticos de cada una de ellas fue variable, requiriéndose de estudios futuros para una mejor comprensión del impacto de estas observaciones en la dinámica de la enfermedad tanto en el ámbito veterinario como en Salud pública.
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Tipo de documento: tesis doctoral  |  Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 109 h.

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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