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Barrionuevo, Florencia Mariel
2019-03-21

Descripción: La fiebre aftosa (FA) es una enfermedad viral infectocontagiosa de curso agudo que se caracteriza por producir lesiones vesiculares en tejidos de la mucosa oronasal (incluyendo lengua, encías y paladar), ubres, espacios interdigitales y rodetes coronarios de las pezuñas de los animales infectados. Su agente etiológico, el virus de la fiebre aftosa (VFA), es un virus perteneciente a la familia Picornaviridae que afecta a animales biungulados, incluyendo por tanto a bovinos, porcinos, caprinos y ovinos domésticos, junto con numerosas especies silvestres que pueden actuar como reservorios bajo determinadas condiciones ecológicas. La virulencia, el amplio rango de huéspedes, la diversidad de variantes y la alta capacidad infecciosa y de contagio del VFA, explican su presencia y re-emergencia en diversas partes del mundo y la convierten en un problema sanitario de escala global. La enfermedad genera enormes pérdidas económicas a la industria ganadera debido al cierre obligado de los mercados externos y a pérdidas considerables en el mercado interno, asociadas a la disminución de la producción, al sacrificio y al bloqueo del movimiento de animales. En trabajos previos de nuestro grupo de investigación, se evidenciaron respuestas inmunes de anticuerpos tanto a nivel sistémico como en mucosas, observables luego de la infección con VFA, así como de la vacunación sistémica en bovinos, siendo su ocurrencia, por lo tanto, independiente de la ruta inicial de contacto con el antígeno viral. Dentro de este panorama, la contribución relativa a la inmunidad protectora de los diferentes mecanismos inmunes potencialmente implicados en la respuesta generada, es difícil de discernir. La presente tesis doctoral plantea como hipótesis de trabajo que los anticuerpos sistémicos, administrados mediante la inmunización pasiva de terneros seronegativos para VFA, son capaces de evitar la diseminación del virus luego de la infección por vía aerógena y en ausencia de otros mecanismos inmunes. Para esto, inicialmente se realizaron una serie de experimentos donde se ajustaron las condiciones para la inmunización pasiva contra el VFA en terneros. En estos procedimientos se utilizaron plasmas de bovinos vacunados con formulaciones tetravalentes comerciales anti-aftosa de serie. Los mismos fueron reunidos en una sola fracción y diferentes volúmenes de esta preparación fueron transferidos a terneros seronegativos. Una vez realizado el procedimiento, se midieron diversos parámetros de inmunidad humoral específicos contra el VFA, entre las 0 h y los 30 días post-transferencia. A partir de estos resultados, se determinó el volumen de plasma requerido para llevar a cabo la inmunización pasiva, así como los protocolos de administración y los tiempos adecuados para realizar las infecciones posteriores en los animales pasivamente inmunizados. Para el segundo experimento, se utilizaron vacunas monovalentes de la cepa O1/Campos de alta carga antigénica, con las que se inmunizaron bovinos seronegativos (n=8). Se obtuvo plasma de cuatro de estos animales a los 7 días post-vacunación (dpv) y a los 26 dpv en los cuatro restantes. Así se conformaron dos pooles de plasma inmunes (7 y 26 dpv) que diferían tanto en la composición isotípica de las inmunoglobulinas, así como en los títulos de anticuerpos totales y neutralizantes anti-VFA. En el caso del pool de plasma de 7 dpv el isotipo predominante detectado fue la IgM y el título de anticuerpos neutralizantes fue 1,6; mientras que para el pool de 26 dpv, se detectaron ambos subtipos de IgG (1 y 2) y niveles menores de IgM, con un título de anticuerpos neutralizantes de 2,7. Los animales pasivamente inmunizados se infectaron por vía oronasal y estos resultados se compararon con los obtenidos en animales vacunados e infectados a los mismos tiempos post-vacunación (7 y 26 dpv). Nuestros resultados demostraron que los anticuerpos circulantes previenen la generalización de la fiebre aftosa solo en el caso de los animales pasivamente inmunizados con plasma de 26 dpv, ya que los animales que recibieron el plasma de 7 dpv mostraron signos clínicos de la enfermedad luego de la infección aerógena. Esto indicaría que, en ausencia de otros mecanismos inmunitarios adaptativos preexistentes, los anticuerpos circulantes en sangre efectivamente son capaces de evitar el desarrollo de la enfermedad, aunque existe un umbral de título de anticuerpos por debajo del cual se desencadena la enfermedad luego de la infección oronasal. Para el caso de los animales vacunados, se obtuvo una protección total de los mismos, tanto en los infectados a los 7 como a los 26 dpv. Esto ocurrió aun cuando el animal vacunado 7 días antes de la infección presentaba, al momento del desafío, niveles de anticuerpos sistémicos neutralizantes similares a los de los animales inmunizados pasivamente con plasma de 7 dpv y que mostraron signos clínicos de fiebre aftosa post-infección. El estudio de las respuestas de anticuerpos post-infección, tanto a nivel sistémico como en mucosas respiratorias, indicó que la vacunación promovió la generación de una respuesta de anticuerpos rápida tras la exposición al virus, presentando la misma un perfil de respuesta de tipo secundaria. En ambos casos, los infectados a los 7 dpv o a los 26 dpv, mostraron rápidos cambios de los isotipos predominantes de las inmunoglobulinas VFA-específicas, así como un aumento de los títulos de anticuerpos y de la avidez en los sueros obtenidos post-infección. Interesantemente, estas observaciones se verificaron tanto a nivel sistémico como local, en linfonódulos drenantes del tracto respiratorio. En conjunto estos resultados indican que los anticuerpos circulantes pueden ser suficientes para evitar la generalización de la enfermedad en bovinos infectados por la vía oronasal, aun en ausencia de otros mecanismos activos de inmunidad específica. A su vez, la caracterización de las respuestas de anticuerpos posteriores al desafío, tanto a nivel sistémico como local, reveló que la inmunización sistémica con vacunas convencionales anti-aftosa promovió rápidamente un aumento del título de anticuerpos, así como de la avidez de los sueros inmunes y la modificación en los isotipos en las inmunoglobulinas predominantes, todos cambios asociables a respuestas anamnésicas contra el virus. Se resalta el carácter protector de que estos procesos frente al establecimiento de la enfermedad, y el hecho que los mismos se verificaron en tiempos muy cercanos a la vacunación (7 dpv) y aun cuando la infección aerógena se realizó en presencia de títulos bajos de anticuerpos neutralizantes.
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Tipo de documento: tesis doctoral  |  Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 140 h.

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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Jolly, Ana
2016-12-05

Descripción: La paratuberculosis es una enfermedad granulomatosa, progresiva y crónica de los rumiantes causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map). Si bien su presentación es endémica a nivel mundial, su prevalencia está subestimada por las limitantes asociadas al diagnóstico. Presenta importancia en Salud Pública y fuerte impacto económico. Esto sumado a la carencia de medidas eficaces para su prevención, hacen de la paratuberculosis una enfermedad con muchos temas vacantes en materia de investigación. Si bien Map es un patógeno intracelular, la presencia de anticuerpos específicos en la luz intestinal al momento de la infección podría modular la respuesta del huésped. El objetivo de esta tesis fue evaluar el efecto de la opsonización de Map con anticuerpos anti-lipoaraninomanano (LAM, antígeno inmunodominante de superficie de Map) sobre la respuesta a la infección de macrófagos bovinos (in vitro) y de segmentos intestinales en terneros (in vivo). En ambos modelos, se emplearon anticuerpos séricos de bovinos sanos (n=2), con paratuberculosis natural (n=3) o inmunizados con LAM (n=3) para pretratar Map. En los experimentos in vitro, las variables estudiadas fueron el nivel de apoptosis y de secreción de TNF? e IL-10. Encontramos que la presencia de anticuerpos específicos incrementó significativamente la apoptosis de los macrófagos infectados. Por ejemplo, obtuvimos valores de 24,2 ± 2,9 % y de 22,4 ± 0,9 % al preincubar Map con anticuerpos de bovinos inmunizados con LAM o infectados, mientras que el porcentaje de apoptosis en presencia de anticuerpos de bovinos sanos fue de 17,2 ± 2,6 %. Este efecto estuvo acompañado por un incremento significativo del nivel de secreción de TNF? en ambos casos. Para el modelo in vivo, se realizó la infección quirúrgica de segmentos intestinales de 3 terneros con: Map en PBS, o preincubada con anticuerpos. Se evaluó el aspecto microscópico de los cortes tisulares, la presencia bacteriana y los niveles relativos de expresión de TNF? e IL-10, a las 3,5 horas post-infección. Como principal resultado encontramos una diferencia significativa en el nivel de recuperación bacteriana a partir de los segmentos infectados con los diferentes anticuerpos. Cuando la infección se produjo en presencia de anticuerpos específicos hubo una reducción significativa de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) recuperadas, tanto con los obtenidos de bovinos inmunizados con LAM como de infectados (2,6 ± 1,3 x 104 y 0,4 ± 0,3 x 104, respectivamente, vs. 5,4 ± 1,1 x 104 UFC/g tejido, para los segmentos inoculados en presencia de anticuerpos de bovinos sanos).En conjunto, los resultados de esta tesis indican que los anticuerpos específicos modulan los efectos de la infección por Map, tanto in vitro como in vivo, en los modelos bovinos estudiados. Asimismo, postulan por primera vez la capacidad de los anticuerpos de modular la apoptosis de macrófagos. A modo de reflexión final, es posible hipotetizar que la presencia local de altos niveles de anticuerpos específicos al momento de la infección natural por Map podría afectar la supervivencia bacteriana en el intestino, en parte por su contribución para el desarrollo de un microambiente pro-inflamatorio, con predominio de TNF? y por el incremento de los niveles de apoptosis de los macrófagos infectados. Estos efectos tendrían un impacto positivo sobre la respuesta inmune en desarrollo y sobre el control de la infección. Es necesario continuar nuestras investigaciones a fin de establecer la relevancia de la inmunidad mediada por anticuerpos en la prevención de la paratuberculosis bovina.
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Tipo de documento: tesis doctoral  |  Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 171 h.

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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Cardillo, Natalia Marina
2012-03

Descripción: La Toxocariosis es una de las enfermedades parasitarias de mayor prevalencia en caninos y felinos a nivel mundial. Toxocara cati es un nematode que parasita el aparato digestivo de los felinos. Producen huevos que son eliminados con la materia fecal de sus hospedadores, contaminando el ambiente. El huevo larvado se desarrolla en el medio y es la forma infectante para otros felinos, hospedadores paraténicos y el hombre. Existe escasa evidencia sobre el comportamiento biológico e inmunológico de los hospedadores frente a la infección por T. cati, pero se sabe que las larvas tienen capacidad migratoria por los tejidos y en el ser humano producen, entre los más reconocidos: el Síndrome de Larva Migrans Visceral; Toxocariosis ocular y Toxocariosis Encubierta. El ratón es un hospedador paraténico natural de T. cati y las larvas tisulares son infectantes para felinos cazadores. Como modelo de experimentación, el ratón presenta similitudes con el humano tanto en la ruta migratoria como en la patogénesis de la enfermedad. Los antígenos de excreción-secreción (ES) liberados por las larvas parásitas durante el proceso migratorio juegan un papel relevante en el diagnóstico de la Toxocariosis humana, cuya utilización evidencia la presencia de inmunoglobulinas específicas de la infección. Se realizó un estudio experimental en ratones, con tres pruebas independientes y diferentes dosis de huevos larvados de Toxocara cati, obtenidos de materia fecal de felinos naturalmente infectados. Se estudió el patrón migratorio y las características de las lesiones producidas durante la etapa aguda y crónica de infección. La respuesta inmunológica se determinó por detección de inmunoglobulinas especificas M y G. Las larvas migraron al hígado, pulmón y cerebro en la fase aguda y se concentraron en los músculos del ratón en la etapa crónica. Se observaron lesiones macroscópicas en la superficie del cerebro y en el pulmón, en la etapa aguda, y microscópicamente, lesiones inflamatorias en el hígado, pulmón cerebro y músculo en ambas etapas. No se observó la formación de granulomas parasitarios o signos de encapsulamiento de larvas en ningún momento de la infección. Se observaron diferencias significativas en el comportamiento de las curvas de Inmunoglobulinas M y G, entre el grupo infectado y el grupo control y entre las fechas p.i., pudiendo diferenciarse la infección aguda y crónica. La evidencia de bandas de bajo peso molecular (31 y 52 Kda.) en el Western Blot de los sueros positivos a la técnica de ELISA, son indicativas de una respuesta especifica a Toxocara spp. y difirieron entre inmunoglobulinas entre las fases aguda y crónica. Las bandas de IgM se observaron con mayor intensidad que las IgG en la etapa aguda, estas últimas presentes en todos los días p.i. Los resultados de este estudio demuestran la infectividad de los huevos de T. cati que son eliminados al ambiente con la materia fecal del gato. El comportamiento migratorio de las larvas de T. cati en el ratón y la tendencia a concentrarse en la musculatura esquelética, refuerzan la importancia del ratón como hospedador paraténico y reservorio en el ciclo del parásito en la naturaleza. La presencia de lesiones inflamatorias en los tejidos, en ausencia de formación de granulomas parasitarios podría sugerir una menor virulencia de esta especie con igual patogenicidad que T. canis. Este aspecto podría traducirse en una menor restricción inmunológica de las larvas.El comportamiento inmunológico del ratón frente a las larvas migrantes de T. cati mostró una tendencia explicativa de las etapas aguda y crónica de la migración e indicó una respuesta específica frente a esta especie en las bandas de bajo peso molecular observadas en el Western Blot de los sueros positivos. Los resultados del presente estudio integral de la infección de T. cati en el modelo animal murino, aportan nuevos conocimientos sobre el comportamiento de las larvas durante el proceso migratorio y sobre la respuesta inmunopatológica del ratón frente a la infección; demuestran el potencial del antígeno obtenido de larvas de huevos presentes en materia fecal y posibles herramientas para el diagnóstico de Toxocariosis en el humano.
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Tipo de documento: tesis doctoral  |  Formato: unknown  (tamaño kb)  Pag. 216 h.

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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Dibárbora, Marina
2016-03-28

Descripción: La infección por Influenza A virus (IAV) es considerada una de las principales causas de enfermedad respiratoria en cerdos. Además, su carácter zoonótico representa un riesgo para la salud pública. En Argentina, si bien existían reportes de presencia de anticuerpos, el primer aislamiento de IAV en cerdos fue en el año 2008, de un subtipo H3N2 completamente humano. Luego, asociado a la pandemia humana del año 2009, se aisló un subtipo H1N1 pandémico (H1N1pdm09) y se reportaron múltiples cuadros clínicos relacionados a este virus. Es por ello que el objetivo general de este trabajo fue caracterizar las cepas de IAV circulantes en cerdos en Argentina y la forma de presentación de dicha infección. Se realizaron estudios clínicos, patológicos, serológicos y virológicos en nueve granjas intensivas porcinas. Los resultados demostraron una presentación clínico-epidemiológica endémica en 8 granjas en animales de entre 21 y 50 días. Desde el punto de vista anatomopatológico, el diagnóstico más frecuente fue la bronconeumonía supurativa con bronquiolitis necrotizante. Los estudios serológicos evidenciaron dos patrones. En uno de ellos se observó una caída de los anticuerpos calostrales entre los 21 y 49 días y un posterior aumento marcado en el porcentaje de animales seropositivos (20 a 80%), lo cual se asoció con una circulación activa del virus. En cambio, en el otro patrón, observado en dos granjas, se detectó un bajo porcentaje de animales seropositivos en reproductores, menos del 50%, y en la línea de producción, el mayor porcentaje de cerdos positivos fue del 20%, lo cual es sugerente de una infección endémica con baja circulación del virus. Los resultados de los ensayos de Inhibición de la Hemoaglutinación detectaron anticuerpos contra H1pdm09, ?H1 y H3 en todas las granjas y en el 75% de los animales presencia de anticuerpos contra más de un subtipo. Se detectó, mediante rRT-PCR, IAV en 7 granjas, la mayoría entre los 21 y 50 días de vida, y se obtuvieron 5 aislamientos, 4 fueron caracterizados como subtipo H1N1pmd09 y uno como subtipo H3N2. Se realizaron además, estudios clínicos y virológicos en 12 granjas intensivas que reportaron cuadros compatibles con infección por IAV. La inspección clínica determinó, en 8 granjas, el cuadro clínico endémico y en 4 granjas se observó la forma epidémica. La edad de presentación de los signos clínicos fue variable, siendo los animales de postdestete los más afectados (30 a 40 días). Todas las granjas evaluadas fueron positivas por rRT-PCR y la edad de detección del virus coincidió con la edad de presentación de los signos clínicos. Se obtuvieron un total de 13 aislamientos de IAV, H1N1pdm09 (7), H1N2 ?2 (3) y H3N2 cluster II (3). Se evaluó la circulación de IAV en pequeños productores y productores familiares. Se tomaron muestras de 57 establecimientos de distintas regiones del país. Los estudios serológicos detectaron la presencia de anticuerpos contra H1pdm09 en más del 60% de los establecimientos y en el 40% de los animales, mientras que menos del 17% de los establecimientos y del 2% de los animales fueron positivos para el subtipo H3. Se realizó el diagnóstico y la caracterización de IAV a partir de muestras enviadas al Laboratorio de Aves y Porcinos, CICVyA, INTA. Se recibieron muestras de 51 establecimientos, de 10 provincias y se obtuvieron 27 aislamientos. El 70% de los subtipos aislados fueron caracterizados como H1N1pdm09. También se obtuvieron aislamientos de los subtipos ?2 H1N2; ?2 H1N1; ?1 H1N1 y H3N2. El análisis filogenético del total de los aislamientos (N=45), mostró un predominio en la circulación del subtipo H1N1pdm09. Solamente 5 aislamientos se caracterizaron como subtipo H3N2 cluster II, 8 aislamientos como ?2 H1N2, un único aislamiento como subtipo ?2 H1N1 y el restante como subtipo ?1 H1N2. Todos ellos poseen gen M pandémico y genes externos de IAV humanos estacionales. Se identificaron 9 introducciones de IAV de humanos a cerdos, 7 relacionadas con la pandemia H1N1 del año 2009 y 2 con IAV humanos estacionales H3 y H1, circulantes más de una década atrás. Los estudios de cartografía antigénica demostraron que, a pesar de la similitud a nivel genético en los virus detectados en el país, las diferencias antigénicas son marcadas. La infección por IAV se encuentra ampliamente diseminada en cerdos de nuestro país. En la mayoría de las granjas evaluadas se observó la presentación endémica (subclínica). Estos resultados alertan sobre la posible generación de virus reasortantes y la presencia de un porcentaje variable de animales sin anticuerpos contra IAV que permitirían la persistencia de la infección. La totalidad de los subtipos de IAV circulantes en cerdos en Argentina corresponde a introducciones de virus de origen humano, en algunos casos relacionados con cepas circulantes más de una década atrás. Esto resalta la importancia del hombre en la epidemiología de IAV en cerdos en nuestro país y supone un riesgo para la población humana por la posibilidad de reintroducciones. La información generada en este estudio muestra que los subtipos circulantes en el país no se corresponden con los reportados en Norteamérica y Eurasia. Este hecho, sumado a la alta variación antigénica observada y a la rápida evolución de IAV, alerta sobre la necesidad de desarrollo de inmunógenos locales y ensayos diagnósticos que permitan el correcto control de IAV en las explotaciones porcinas de nuestro país.
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Tipo de documento: tesis doctoral  |  Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 105 h.

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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Kotsias, Fiorella
2010-04-20

Descripción: El herpesvirus bovino 1 es un alfaherpesvirus que infecta al ganado bovino produciendo cuadros clínicos respiratorios, genitales y/o reproductivos. Es un virus neurotrópico que establece latencia en ganglios sensoriales, y la reexcreción viral luego de la reactivación de la infección latente es responsable de la perpetuación del agente en los rodeos. En nuestro país la seroprevalencia puede alcanzar el 80% y la vacunación es la estrategia utilizada para el control de la enfermedad. En nuestro laboratorio se desarrolló, a partir de la cepa BoHV-1.1 Los Angeles (LA), un virus recombinante mediante el reemplazo alélico del gen que codifica para la glicoproteina E por el gen lac z, denominada BoHV-1?gE?gal, para su utilización como vacuna marcadora. La caracterización genómica de la cepa BoHV-1?gE?gal verificó la ausencia de cambios en las regiones flanqueantes al gen gE y permitió identificar específicamente los sitios donde ocurrió el intercambio alélico. El estudio de RFLP mostró que esta cepa posee un patrón diferente al esperado, indicando modificaciones en ciertos sitios de restricción. El estudio del comportamiento in vitro mostró que esta cepa es menos eficiente en la producción de partículas virales infectivas así como en la dispersión viral respecto a la cepa parental BoHV-1 LA y a otras cepas gE-, tanto en el mecanismo de pasaje célula a célula como en el de liberación de partículas virales infectivas al medio extracelular. El virus BoHV-1?gE?gal se encuentra atenuado en su virulencia en el hospedador natural, y esta atenuación es mayor que la descripta para otras cepas gE-, ya que si bien induce una respuesta inmune humoral sérica y de mucosas, no se excreta ni produce enfermedad clínica luego de la infección intranasal, así como tampoco establece una infección latente ni se reactiva experimentalmente. La experiencia de infección viral con BoHV-1 y la metodología desarrollada en este trabajo aplicada al análisis de muestras provenientes de animales infectados constituyen una valiosa herramienta para el estudio de la patogenia de virus genéticamente modificados, virus recombinantes y aislamientos de campo. Por otro lado, resulta una contribución al conocimiento de la cepa parental BoHV-1 LA que se utiliza en las experiencias de desafío viral. Los resultados de este trabajo de Tesis, conjuntamente con los antecedentes de inmunogenicidad, protección frente al desafío viral e inocuidad de la cepa BoHV-1?gE?gal, sumado a la creciente tendencia mundial en el uso de vacunas marcadoras vivas en el control de la enfermedad causada por BoHV-1, indican que la cepa BoHV-1?gE?gal podría incorporarse como inmunógeno vivo en los esquemas de vacunación de futuros planes de control y erradicación de BoHV-1 en nuestro país sin riesgos de producir enfermedad, latencia o diseminarse a otros animales, reduciendo la incidencia de enfermedad respiratoria bovina.
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Tipo de documento: tesis doctoral  |  Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 171 h.

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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