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Palabras contadas: virologia: 6
Dibárbora, Marina
2016-03-28

Descripción: La infección por Influenza A virus (IAV) es considerada una de las principales causas de enfermedad respiratoria en cerdos. Además, su carácter zoonótico representa un riesgo para la salud pública. En Argentina, si bien existían reportes de presencia de anticuerpos, el primer aislamiento de IAV en cerdos fue en el año 2008, de un subtipo H3N2 completamente humano. Luego, asociado a la pandemia humana del año 2009, se aisló un subtipo H1N1 pandémico (H1N1pdm09) y se reportaron múltiples cuadros clínicos relacionados a este virus. Es por ello que el objetivo general de este trabajo fue caracterizar las cepas de IAV circulantes en cerdos en Argentina y la forma de presentación de dicha infección. Se realizaron estudios clínicos, patológicos, serológicos y virológicos en nueve granjas intensivas porcinas. Los resultados demostraron una presentación clínico-epidemiológica endémica en 8 granjas en animales de entre 21 y 50 días. Desde el punto de vista anatomopatológico, el diagnóstico más frecuente fue la bronconeumonía supurativa con bronquiolitis necrotizante. Los estudios serológicos evidenciaron dos patrones. En uno de ellos se observó una caída de los anticuerpos calostrales entre los 21 y 49 días y un posterior aumento marcado en el porcentaje de animales seropositivos (20 a 80%), lo cual se asoció con una circulación activa del virus. En cambio, en el otro patrón, observado en dos granjas, se detectó un bajo porcentaje de animales seropositivos en reproductores, menos del 50%, y en la línea de producción, el mayor porcentaje de cerdos positivos fue del 20%, lo cual es sugerente de una infección endémica con baja circulación del virus. Los resultados de los ensayos de Inhibición de la Hemoaglutinación detectaron anticuerpos contra H1pdm09, ?H1 y H3 en todas las granjas y en el 75% de los animales presencia de anticuerpos contra más de un subtipo. Se detectó, mediante rRT-PCR, IAV en 7 granjas, la mayoría entre los 21 y 50 días de vida, y se obtuvieron 5 aislamientos, 4 fueron caracterizados como subtipo H1N1pmd09 y uno como subtipo H3N2. Se realizaron además, estudios clínicos y virológicos en 12 granjas intensivas que reportaron cuadros compatibles con infección por IAV. La inspección clínica determinó, en 8 granjas, el cuadro clínico endémico y en 4 granjas se observó la forma epidémica. La edad de presentación de los signos clínicos fue variable, siendo los animales de postdestete los más afectados (30 a 40 días). Todas las granjas evaluadas fueron positivas por rRT-PCR y la edad de detección del virus coincidió con la edad de presentación de los signos clínicos. Se obtuvieron un total de 13 aislamientos de IAV, H1N1pdm09 (7), H1N2 ?2 (3) y H3N2 cluster II (3). Se evaluó la circulación de IAV en pequeños productores y productores familiares. Se tomaron muestras de 57 establecimientos de distintas regiones del país. Los estudios serológicos detectaron la presencia de anticuerpos contra H1pdm09 en más del 60% de los establecimientos y en el 40% de los animales, mientras que menos del 17% de los establecimientos y del 2% de los animales fueron positivos para el subtipo H3. Se realizó el diagnóstico y la caracterización de IAV a partir de muestras enviadas al Laboratorio de Aves y Porcinos, CICVyA, INTA. Se recibieron muestras de 51 establecimientos, de 10 provincias y se obtuvieron 27 aislamientos. El 70% de los subtipos aislados fueron caracterizados como H1N1pdm09. También se obtuvieron aislamientos de los subtipos ?2 H1N2; ?2 H1N1; ?1 H1N1 y H3N2. El análisis filogenético del total de los aislamientos (N=45), mostró un predominio en la circulación del subtipo H1N1pdm09. Solamente 5 aislamientos se caracterizaron como subtipo H3N2 cluster II, 8 aislamientos como ?2 H1N2, un único aislamiento como subtipo ?2 H1N1 y el restante como subtipo ?1 H1N2. Todos ellos poseen gen M pandémico y genes externos de IAV humanos estacionales. Se identificaron 9 introducciones de IAV de humanos a cerdos, 7 relacionadas con la pandemia H1N1 del año 2009 y 2 con IAV humanos estacionales H3 y H1, circulantes más de una década atrás. Los estudios de cartografía antigénica demostraron que, a pesar de la similitud a nivel genético en los virus detectados en el país, las diferencias antigénicas son marcadas. La infección por IAV se encuentra ampliamente diseminada en cerdos de nuestro país. En la mayoría de las granjas evaluadas se observó la presentación endémica (subclínica). Estos resultados alertan sobre la posible generación de virus reasortantes y la presencia de un porcentaje variable de animales sin anticuerpos contra IAV que permitirían la persistencia de la infección. La totalidad de los subtipos de IAV circulantes en cerdos en Argentina corresponde a introducciones de virus de origen humano, en algunos casos relacionados con cepas circulantes más de una década atrás. Esto resalta la importancia del hombre en la epidemiología de IAV en cerdos en nuestro país y supone un riesgo para la población humana por la posibilidad de reintroducciones. La información generada en este estudio muestra que los subtipos circulantes en el país no se corresponden con los reportados en Norteamérica y Eurasia. Este hecho, sumado a la alta variación antigénica observada y a la rápida evolución de IAV, alerta sobre la necesidad de desarrollo de inmunógenos locales y ensayos diagnósticos que permitan el correcto control de IAV en las explotaciones porcinas de nuestro país.
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Tipo de documento: tesis doctoral  |  Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 105 h.

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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Barrionuevo, Florencia Mariel
2019-03-21

Descripción: La fiebre aftosa (FA) es una enfermedad viral infectocontagiosa de curso agudo que se caracteriza por producir lesiones vesiculares en tejidos de la mucosa oronasal (incluyendo lengua, encías y paladar), ubres, espacios interdigitales y rodetes coronarios de las pezuñas de los animales infectados. Su agente etiológico, el virus de la fiebre aftosa (VFA), es un virus perteneciente a la familia Picornaviridae que afecta a animales biungulados, incluyendo por tanto a bovinos, porcinos, caprinos y ovinos domésticos, junto con numerosas especies silvestres que pueden actuar como reservorios bajo determinadas condiciones ecológicas. La virulencia, el amplio rango de huéspedes, la diversidad de variantes y la alta capacidad infecciosa y de contagio del VFA, explican su presencia y re-emergencia en diversas partes del mundo y la convierten en un problema sanitario de escala global. La enfermedad genera enormes pérdidas económicas a la industria ganadera debido al cierre obligado de los mercados externos y a pérdidas considerables en el mercado interno, asociadas a la disminución de la producción, al sacrificio y al bloqueo del movimiento de animales. En trabajos previos de nuestro grupo de investigación, se evidenciaron respuestas inmunes de anticuerpos tanto a nivel sistémico como en mucosas, observables luego de la infección con VFA, así como de la vacunación sistémica en bovinos, siendo su ocurrencia, por lo tanto, independiente de la ruta inicial de contacto con el antígeno viral. Dentro de este panorama, la contribución relativa a la inmunidad protectora de los diferentes mecanismos inmunes potencialmente implicados en la respuesta generada, es difícil de discernir. La presente tesis doctoral plantea como hipótesis de trabajo que los anticuerpos sistémicos, administrados mediante la inmunización pasiva de terneros seronegativos para VFA, son capaces de evitar la diseminación del virus luego de la infección por vía aerógena y en ausencia de otros mecanismos inmunes. Para esto, inicialmente se realizaron una serie de experimentos donde se ajustaron las condiciones para la inmunización pasiva contra el VFA en terneros. En estos procedimientos se utilizaron plasmas de bovinos vacunados con formulaciones tetravalentes comerciales anti-aftosa de serie. Los mismos fueron reunidos en una sola fracción y diferentes volúmenes de esta preparación fueron transferidos a terneros seronegativos. Una vez realizado el procedimiento, se midieron diversos parámetros de inmunidad humoral específicos contra el VFA, entre las 0 h y los 30 días post-transferencia. A partir de estos resultados, se determinó el volumen de plasma requerido para llevar a cabo la inmunización pasiva, así como los protocolos de administración y los tiempos adecuados para realizar las infecciones posteriores en los animales pasivamente inmunizados. Para el segundo experimento, se utilizaron vacunas monovalentes de la cepa O1/Campos de alta carga antigénica, con las que se inmunizaron bovinos seronegativos (n=8). Se obtuvo plasma de cuatro de estos animales a los 7 días post-vacunación (dpv) y a los 26 dpv en los cuatro restantes. Así se conformaron dos pooles de plasma inmunes (7 y 26 dpv) que diferían tanto en la composición isotípica de las inmunoglobulinas, así como en los títulos de anticuerpos totales y neutralizantes anti-VFA. En el caso del pool de plasma de 7 dpv el isotipo predominante detectado fue la IgM y el título de anticuerpos neutralizantes fue 1,6; mientras que para el pool de 26 dpv, se detectaron ambos subtipos de IgG (1 y 2) y niveles menores de IgM, con un título de anticuerpos neutralizantes de 2,7. Los animales pasivamente inmunizados se infectaron por vía oronasal y estos resultados se compararon con los obtenidos en animales vacunados e infectados a los mismos tiempos post-vacunación (7 y 26 dpv). Nuestros resultados demostraron que los anticuerpos circulantes previenen la generalización de la fiebre aftosa solo en el caso de los animales pasivamente inmunizados con plasma de 26 dpv, ya que los animales que recibieron el plasma de 7 dpv mostraron signos clínicos de la enfermedad luego de la infección aerógena. Esto indicaría que, en ausencia de otros mecanismos inmunitarios adaptativos preexistentes, los anticuerpos circulantes en sangre efectivamente son capaces de evitar el desarrollo de la enfermedad, aunque existe un umbral de título de anticuerpos por debajo del cual se desencadena la enfermedad luego de la infección oronasal. Para el caso de los animales vacunados, se obtuvo una protección total de los mismos, tanto en los infectados a los 7 como a los 26 dpv. Esto ocurrió aun cuando el animal vacunado 7 días antes de la infección presentaba, al momento del desafío, niveles de anticuerpos sistémicos neutralizantes similares a los de los animales inmunizados pasivamente con plasma de 7 dpv y que mostraron signos clínicos de fiebre aftosa post-infección. El estudio de las respuestas de anticuerpos post-infección, tanto a nivel sistémico como en mucosas respiratorias, indicó que la vacunación promovió la generación de una respuesta de anticuerpos rápida tras la exposición al virus, presentando la misma un perfil de respuesta de tipo secundaria. En ambos casos, los infectados a los 7 dpv o a los 26 dpv, mostraron rápidos cambios de los isotipos predominantes de las inmunoglobulinas VFA-específicas, así como un aumento de los títulos de anticuerpos y de la avidez en los sueros obtenidos post-infección. Interesantemente, estas observaciones se verificaron tanto a nivel sistémico como local, en linfonódulos drenantes del tracto respiratorio. En conjunto estos resultados indican que los anticuerpos circulantes pueden ser suficientes para evitar la generalización de la enfermedad en bovinos infectados por la vía oronasal, aun en ausencia de otros mecanismos activos de inmunidad específica. A su vez, la caracterización de las respuestas de anticuerpos posteriores al desafío, tanto a nivel sistémico como local, reveló que la inmunización sistémica con vacunas convencionales anti-aftosa promovió rápidamente un aumento del título de anticuerpos, así como de la avidez de los sueros inmunes y la modificación en los isotipos en las inmunoglobulinas predominantes, todos cambios asociables a respuestas anamnésicas contra el virus. Se resalta el carácter protector de que estos procesos frente al establecimiento de la enfermedad, y el hecho que los mismos se verificaron en tiempos muy cercanos a la vacunación (7 dpv) y aun cuando la infección aerógena se realizó en presencia de títulos bajos de anticuerpos neutralizantes.
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Tipo de documento: tesis doctoral  |  Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 140 h.

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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Porta, Natalia Gabriela
2019-03-27

Temas:   Virología  - Ternero  - Virus de la leucosis bovina  - Anticuerpos  - BLV  - ELISA  - PCR  - Ig Y  - Transmisión  - Leche

Descripción: En este trabajo se estudió el efecto del uso de anticuerpos de yema de huevo (IgY) anti BLV específicos como suplemento en la leche de consumo de terneros durante todo el período de cría, monitoreando a los animales desde el nacimiento hasta los 9 meses de vida. El objetivo central fue obtener evidencia que el consumo de leche pueda ser una vía de transmisión del virus y si así fuera, proponer una alternativa para interferir con el desafío natural de infección por BLV por consumo de leche. Como objetivo complementario, se realizaron infecciones experimentales en ovinos en las que se determinó la dosis mínima infectiva tanto de virus asociado a células FLKBLV como de virus libre en sobrenadante celular de FLK-BLV. También se analizó la capacidad neutralizante de los anticuerpos presentes en suero de un animal infectado con BLV. Cabe destacar que previamente al uso de animales se intentó poner a punto un ensayo in vitro. Se realizó la caracterización del rodeo donde se desarrolló la experiencia con terneros. Se observó una prevalencia individual de anticuerpos del 96% en las muestras de sangre, y de un 90% en las muestras de leche. Los títulos de anticuerpos en sangre fueron significativamente más altos que los encontrados en leche. Se detectó la presencia de provirus en el 82% de las muestras de sangre y 59% de las muestras individuales de leche. La carga proviral en leche fue significativamente menor que en sangre. En la leche de tanque del ordeñe diario, se encontraron anticuerpos con un título de 1:32 en todas las muestras, mientras que en las muestras de leches individuales el rango de títulos de anticuerpos variaba entre <1:16 y >1:64. Al comparar las leches individuales con un título de 1:32 con las leches de tanque que poseen el mismo título, se pudo observar que el 90% de las leches de tanque evidencian cargas provirales detectables, mientras que solo el 60% de esas leches individuales evidencian carga proviral detectable. Se detectaron anticuerpos anti BLV en el 95,5% de los terneros recién nacidos, lo que demostraría un correcto calostrado de los animales, de los cuales el 13% de los terneros nacieron infectados (detección de provirus en sangre). En el bioensayo de ovinos, se observó que fueron necesarias 5.000 células FLK-BLV por inoculo para generar la infección en los dos corderos inoculados, mientras que el virus libre en sobrenadante celular FLK-BLV resultó infectivo hasta la dilución 1/1.000. El suero bovino positivo a BLV impidió la infección en los corderos inoculados con el virus libre de células, mientras que todos los ovinos se infectaron cuando se inocularon con virus libre de células en presencia de suero bovino negativo a BLV. Se produjo la cantidad necesaria de un preparado de polvo de huevo con anticuerpos específicos anti BLV para el ensayo controlado de eficacia a campo. La preparación fue caracterizada por ELISA y por infección experimental en corderos. Todos los corderos resultaron infectados cuando fueron inoculados con virus libre de células FLK-BLV previamente incubado con la preparación de IgY concentrada anti BLV y con la preparación de polvo de huevo anti BLV, no demostrando la capacidad de las IgY anti BLV de neutralizar el virus presente en el sobrenadante de células FLK-BLV. Si bien el ensayo in vivo fue una alternativa para el ensayo in vitro con el objeto de analizar la capacidad neutralizante de los anticuerpos IgYs, y aunque no se obtuvieron los resultados esperados, su realización ha resultado beneficiosa para el grupo de trabajo, como una herramienta nueva y válida para realizar distintos estudios. Este polvo fue suministrado a los terneros en cada toma de leche durante la cría. Paralelamente en un grupo control, no se les ofreció ningún suplemento en las tomas diarias de leche. En los primeros días de vida de los terneros se observó tanto en el grupo control como en el grupo tratado, anticuerpos en el 93% de las muestras. Estos valores concuerdan con lo previamente reportado para infecciones en terneros recién nacidos. Los siguientes muestreos se realizaron hasta completar el seguimiento a los 9 meses de los terneros en donde se observó una prevalencia del 6.6% en el grupo tratado y del 7.7% en el grupo control. Este trabajo de tesis aportó datos sobre la epidemiologia natural de la infección, que deberían ser utilizados para el diseño y prosecución de una estrategia de control. En un contexto de infección natural francamente endémica, la estrategia de uso de anticuerpos como complemento en la toma diaria de leche podría ser valiosa para la reducción de la dinámica en la edad temprana.
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Tipo de documento: tesis doctoral  |  Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 113 h.

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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Miño, Orlando Samuel
2017-08-23

Descripción: Las diarreas neonatales representan uno de los síndromes clínicos más relevantes y frecuentes en potrillos menores de 6 meses de edad. Rotavirus grupo A (RVA) es el principal agente viral asociado a diarreas en potrillos, a nivel mundial. Sin embargo, en aproximadamente el 50% de los casos de diarrea no se puede establecer su etiología. Por estos motivos, los objetivos de este trabajo fueron, profundizar el conocimiento de la epidemiología molecular y, de las características evolutivas y estructurales de RVA equino, y estudiar la presencia de otros agentes virales como posibles causantes de diarreas en potrillos de nuestro país.nEl estudio de RVA equino comenzó con la determinación de la sensibilidad y especificidad de tres metodos de diagnóstico. En segundo lugar, se estudió la epidemiología molecular de los RVA circulantes en equinos durante el período 2009 ? 2014. Las variantes G3P y G14P fueron las cepas detectadas con una prevalencia cíclica y alternada entre los años bajo estudio. Con todas las cepas disponibles se realizó un estudio evolutivo, determinándose la monofilia de los RVA equinos de Argentina. Se identificó el genotipo E12 -correspondiente al gen codificante de la enterotoxina viral NSP4- como un indicador geográfico que permitió trazar la evolución de los RVA equino de Sudamérica, desde la primera fundación de Buenos Aires en 1536. El resultado obtenido permite plantear la hipótesis de una infección inter especie que dio origen a una cepa emergente resultado de la reasociación de genes entre las cepas de RVA de animales autóctonos (guanacos) y las cepas de RVA de los animales introducidos (equinos y bovinos). Se detectó el fenómeno de transferencia y fijación del genotipo E12 autóctono en las cepas de RVA circulantes en equinos y bovinos de Sudamérica. El estudio de RVA equino incluyó también un análisis estructural que permitió explicar el ligamiento genético observado entre las variantes de las proteínas estructurales VP7 y VP6. Finalmente, mediante la tecnología de ?next generation sequencing?, se estudió el viroma de la materia fecal de potrillos con diarrea. Así se determinó la presencia de otros agentes virales, potenciales causantes de diarrea.En conclusión, este trabajo profundizó aspectos relacionados con el diagnóstico de RVA equino, aportando datos novedosos respecto a los procesos evolutivos, filodinámicos y estructurales que podrían extrapolarse a otros virus de genoma segmentado. Asimismo, se describió por primera vez el viroma de materia fecal de potrillos con diarrea, sugiriendo otros posibles agentes causales. Nuestros resultados enfatizan la importancia de realizar una vigilancia epidemiológica continua de las diarreas en potrillos, profundizar en la identificación y caracterización de los agentes virales asociados, con el fin último de realizar el diseño racional de nuevas herramientas de prevención y control.
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Tipo de documento: tesis doctoral  |  Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 157 p.

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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Quintana, María Eugenia
2019-03-25

Descripción: El Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB) representa un importante desafío a nivel productivo debido a su carácter endémico a nivel mundial. La infección por el VDVB es altamente prevalente en la Argentina y provoca pérdidas económicas para la industria lechera y ganadera, asociadas mayormente a problemas reproductivos. La enfermedad provocada por el VDVB se presenta con una variada signología que puede ir desde un curso subclínico a cuadros agudos hemorrágicos cuyo desenlace suele ser fatal. A esto se suma el efecto inmunosupresor del VDVB que predispone a infecciones bacterianas y parasitarias que pueden comprometer la vida del animal. El VDVB pertenece a la familia Flaviviridae, género Pestivirus y está representado por 3 genotipos: VDVB-1, VDVB-2 y VDVB-3 o ?Virus HoBi-like?. A su vez, este agente puede ser clasificado según su biotipo en citopático (CP) y no citopático (NCP). Una característica fundamental del VDVB es su capacidad de generar infecciones persistentes. El nacimiento de animales persistentemente infectados (PI) tiene lugar cuando las hembras preñadas se infectan con una cepa NCP del VDVB entre los días 30 y 150 de gestación. Estos individuos no son capaces de montar una respuesta inmune y eliminan grandes cantidades de virus en todas las excreciones y secreciones. Actualmente se proponen dos medidas principales para el control de la enfermedad: la detección y eliminación de animales PI, y la posterior vacunación de todo el rodeo no PI. La primera medida es recibida con fuerte resistencia por parte de los productores. Por otro lado, la inmunidad que confieren las vacunas que se encuentran en el mercado requiere más de dos semanas para desarrollarse e incluso de más de una dosis, siendo dudosa su eficacia en presencia de inmunidad materna. A estos inconvenientes se suma que la mayoría de las formulaciones comerciales no brindan cobertura contra todas las cepas del virus que circulan en el campo. Para complementar el conjunto de herramientas para el control del VDVB se precisan antivirales que puedan prevenir la dispersión viral y evitar la inmunosupresión. Los antivirales podrían utilizarse en casos de brotes o como preventivo antes de ciertas maniobras como el transporte, encierro, inseminaciones, introducción de nuevos animales, etc. En este trabajo proponemos el uso de Interferones (IFNs) ya que son antivirales naturales, de sencilla producción y amplio espectro. En contraste con la respuesta inmune adaptativa, los mecanismos innatos de defensa inmune mediados por los IFNs son inmediatos, y resultan operativos incluso en las primeras etapas de desarrollo intrauterino. La administración de IFNs como agentes bioterapéuticos es una medida efectiva para el tratamiento de varias infecciones virales. Tradicionalmente, en terapias desarrolladas para humanos, se ha utilizado el IFN de tipo I (IFN-?). Este está siendo actualmente reemplazado, dada su toxicidad hematológica, por el IFN de tipo III (IFN-?). El efecto antiviral de esta última citoquina es idéntico al del IFN-? pero localizado en epitelios, principalmente en mucosas, sin efecto sobre las células sanguíneas. La familia del IFN-? se encuentra conservada en bovinos y el tratamiento con IFN-?3 ha mostrado ser eficaz en controlar la infección oronasal por el virus de la fiebre aftosa (VFA). No se ha estudiado la aplicación terapéutica ni la funcionalidad del IFN-?3 contra otros virus que afectan la producción ganadera. Este trabajo plantea las siguientes hipótesis: ?El IFN-?3 bovino posee actividad antiviral contra el VDVB?; y ?El IFN-?3 bovino recombinante es un candidato para ser utilizado como bioterapéutico en infecciones con el VDVB?. Para contrastar estas hipótesis, hemos clonado y expresado el IFN-?3 y el IFN-? bovinos en células de mamífero en cultivo y evaluamos su actividad antiviral frente a distintas cepas del VDVB tanto in vitro como in vivo para comprobar su potencial uso como bioterapéutico en bovinos. Los IFN recombinantes (IFNr) producidos en sobrenadantes de células HEK293T transfectadas fueron cuantificados en función a las unidades activas determinadas sobre un virus de referencia y utilizando un ensayo reportero de actividad basado en células de riñón bovino Madin-Darby T2 (MDBK-T2) transfectadas en forma estable con el promotor del gen Mx río arriba del ORF para la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Para establecer la sensibilidad de cepas de campo y de referencia del VDVB a los IFNr, desarrollamos una técnica de alto rendimiento aplicable a cepas CP y NPC. Se trata de un ELISA en células que permite la medición directa de la infección detectando una proteína no estructural del virus en microplacas de cultivo celular, sin necesidad de cosechar las células. Utilizando este ensayo estimamos la concentración inhibitoria 50% para cada IFNr utilizando seis cepas de VDVB de diferente biotipo y genotipo, verificando que las cepas CP son más susceptibles a ambos IFNr que las NCP y, particularmente, las cepas NCP de tipo 2 resultaron más sensibles al IFN-?. La actividad de los IFNr fue evaluada luego in vivo, en un modelo murino de virulencia desarrollado en nuestro laboratorio, en el que ratones de la cepa BALB/c infectados con cepas del tipo 2 del VDVB desarrollan viremia a los 4 ó 7 días post infección (dpi), según la virulencia de la cepa. La cepa de alta virulencia suprimió además la respuesta proinflamatoria en estos animales. A juzgar por nuestros resultados, el tratamiento de los ratones infectados con la cepa 98-124 (de baja virulencia) con IFNr murinos comerciales mostró que el IFN-? fue más eficiente en prevenir la infección mientras que el IFN-? evitó la viremia. Experimentos de tratamiento combinado con dos dosis de IFN pre y post infección, combinando el uso de ambos IFNs, reveló que el tratamiento con IFN-? antes de la infección seguido luego por IFN-? fue efectivo en controlar la viremia en los ratones. Además, el tratamiento pre y post-infección con IFN-? resultaba igualmente protector. La limitación de la replicación del VDVB se verificó además por la ausencia de TNF-? sistémico. Estos resultados entonces indicaron que el IFN-? resultaba efectivo contra el VDVB in vivo, y que no era necesario combinarlo con IFN-?. Para evaluar el uso de nuestros IFNr en bovinos establecimos primero la inocuidad de los mismos sobre células sanguíneas bovinas (ex vivo) donde ambos IFNs mostraron ser seguros a las dosis de uso propuestas, a pesar de que el IFN-? causó apoptosis de células inmunes bovinas a dosis altas. La determinación de la inocuidad posológica se realizó directamente en los animales mediante el control de parámetros hematológicos durante 14 días post-inoculación, revelando la ausencia de toxicidad con las diferentes dosis de IFN?r evaluadas. A partir de estos resultados se realizó una prueba de concepto en terneros para evaluar la factibilidad de la utilización de IFN-?r frente a la infección con una cepa de baja virulencia aislada en la provincia de Buenos Aires, del genotipo 2 y biotipo NCP, ampliamente caracterizada en nuestro laboratorio. Se seleccionaron para el estudio 6 terneras libres del VDVB, que fueron infectadas con la cepa antedicha. Cuatro de ellas fueron inoculadas por vía sub-cutánea con dos dosis de IFN-?r dos días previos a la infección y dos días posteriores a la misma, mientras que las otras dos terneras recibieron tratamiento placebo (medio de dilución). Los animales infectados-no tratados desarrollaron enfermedad clínica con síntomas respiratorios entre los 2 a 4 días post-infección, detectándose también viremia y excreción viral a través de secreciones nasales. Los animales del grupo tratado con IFN-?r no desarrollaron enfermedad ni presentaron signos clínicos. En tres de ellos no de detectó viremia ni excreción viral nasal. Un individuo de este último grupo presentó viremia y excreción viral pero con valores menores a los del grupo no tratado. Hemos desarrollado un antiviral seguro y eficaz, IFN-?3 bovino recombinante, demostrando la factibilidad de su potencial utilización para la prevención y el tratamiento de las infecciones por el VDVB. Comprobamos el efecto antiviral del IFN-?r sobre cepas de campo y de referencia in vitro, como así también su inocuidad y eficacia en bovinos contra una cepa de campo Argentina del genotipo 2, biotipo NCP. Además, establecimos un modelo ratón de viremia por el VDVB, de gran utilidad para los estudios in vivo con este virus. Desarrollamos una técnica novedosa, que consiste en un ELISA en células que utiliza un anticuerpo detector contra una proteína conservada no estructural que puede ser potencialmente aplicable para medir con precisión la infectividad de cualquier cepa viral, independientemente de su capacidad de causar la muerte de células en cultivo. Este trabajo constituye la primera evidencia experimental del potencial bioterapéutico del IFN-? bovino contra el VDVB in vivo, abriendo una nueva perspectiva enfocada en el uso de antivirales biológicos económicos, biodegradables y seguros para reducir la incidencia de las infecciones virales en animales en ámbitos productivos. La aplicación de esta herramienta podría impactar indirectamente en la disminución del uso de antibióticos al decrecer la tasa de infecciones bacterianas que devienen de las infecciones virales inmunosupresoras.
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Tipo de documento: tesis doctoral  |  Formato: PDF  (tamaño kb)  Pag. 143 p.

Aporte: Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias

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