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Director(a):
Tellez Iñon, María Teresa
 
Institución otorgante:
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Fecha:
1988
Tipo de documento: 
info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 
Formato:
application/pdf
Idioma:
spa
Descripción:
En este trabajo de Tesis se describen y caracterizan algunas de las enzimas directamente involucradas en el metabolismo del AMPc del protozoario parásito Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la Enfermedad de Chagas. Diversos autores han postulado que el AMP cíclico regula la diferenciación del parásito. Si bien no se conoce su blanco de acción intracelular, se demostró que los niveles endógenos del AMP cíclico aumentan durante la metaciclogénesis. Los resultados presentados indican la existencia de una quinasa de proteinas dependiente de AMPc en el parásito, que probablemente sea la mediadora de muchos de los efectos del nucleótido. Extractos citosólicos de la forma epimastigote de T. cruzi cromatografiados en una columna de DEAE-celulosa mostraron dos picos con actividad de quinasa de proteínas que eluyeron a 0,15 y 0,32 M NaCl, respectivamente. El segundo pico, PKII, también presentó capacidad de unir AMPc en forma específica y se activó por concentraciones nanomolares del nucleótido. La actividad de quinasa de proteinas dependiente de AMPC (PKII) se purificó por filtración en geles, por cromatografía de afinidad en histona-Sepharosa y en AMPc-agarosa y por cromatografía en una columna mixta de Sephadex G-25-Carboximetil Sephadex C-50. La enzima pudo disociarse parcialmente en dos componentes diferentes: catalítico y regulatorio. El componente catalítico presentó un radio de Stokes (2,2 nm) menor que el de la subunidad catalítica de corazón bovino (2,8 nm). En experimentos de reconstitución, la actividad del componente catalítico de T. cruzi se inhibió por la subunidad regulatoria de corazón. A su vez, el componente regulatorio fue capaz de inhibir la actividad fosfotransferasa del componente catalítico homólogo y de la subunidad catalítica de corazón. Estas inhibiciones se revirtieron con la adición de AMPc. La preparación de holoenzima se fosforiló en ausencia de un sustrato exógeno aceptor de fosfatos y se analizó en electroforesis en condiciones disociantes. Se observó una única banda fosforilada de 56 K. La misma preparación se transfirió a nitrocelulosa y se incubó con anticuerpos policlonales contra la subunidad regulatoria tipo II de eucariotes superiores (Western blot). El antisuero reconoció una única banda de 56 K. Se puede concluir que la quinasa dependiente de AMPc del parásito es similar a una quinasa tipo II de mamíferos en base a las siguientes características: elución con alta sal de una DEAE-celulosa, tamaño de la subunidad regulatoria, capacidad de autofosforilarse de la misma y el reconocimiento por sueros policlonales especificos contra RII. En la segunda parte de este trabajo se estudió la fosfodiesterasa de nucleótidos cíclicos (PDE) obtenida de extractos citosólicos del parásito. La enzima soluble (80%) se purificó por DEAE-celulosa y por cromatografía de afinidad en calmodulina-Sepharosa. La PDE que eluyó en un único pico de la DEAE-celulosa hidrolizó AMPc y GMPc con alta afinidad. La enzima se activó en presencia de la calmodulina homóloga, de cerebro bovino y de N. crassa, logréndose el 50% de estimulación máxima con 0,3 μg/ml del activador. En un gráfico de dobles recíprocas, la enzima presentó dos componentes cinéticos, uno de alta y otro de baja afinidad por el sustrato AMPc (Km 2,5 y 100 μM). La calmodulina aumentó la Vmáx de ambos componentes sin modificar la afinidad de la enzima por el sustrato. La activación requirió concentraciones micromolares de Ca²+ y se bloqueó por EGTA y por drogas neurolépticas como la clorpromazina, la flufenazina y el compuesto 48/80. Paralelamente se purificó la calmodulina del parásito por DEAE-celulosa, filtración en geles y cromatografía de afinidad en CAPP-Sepharosao en Phenyl-Sepharosa. En electroforesis en condiciones disociantes, la calmodulina mostró una sola banda polipeptídica con un peso molecular aparente de 16 K. La calmodulina purificada fue capaz de activar la PDE dependiente del activador de cerebro bovino en forma similar a la homóloga. La calmodulina, probablemente regule el movimiento flagelar porque el tratamiento in vivo de epimastigotes de T. crusi con drogas fenotiazínicas detuvo el movimiento del parásito y modificó su forma. Este efecto, altamente citotóxico de las drogas, es potencialmente importante y podría utilizarse para una futura acción terapéutica cuyo blanco sería la calmodulina o las enzimas dependientes del activador. Se puede concluir que en T. cruzi se han conservado las enzimas implicadas en el metabolismo del AMPc que poseen características similares a las de los eucariotes superiores.
Identificador:
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2115_UlloadelaSerna
Derechos:
info:eu-repo/semantics/openAccess
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/
Licencia de uso:
Licencia Creative Commons


Cita bibliográfica:

Ulloa de la Serna, Rita María  (1988).     Regulación de fosfodiesterasa y quinasas de proteínas en Trypanosoma cruzi.  (info:eu-repo/semantics/doctoralThesis).    Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.    [consultado:  ] Disponible en el Repositorio Digital Institucional de la Universidad de Buenos Aires:  <http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2115_UlloadelaSerna>