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Tiorredoxinas cloroplastídicas


Chloroplast thioredoxins

Duek, Paula Débora

Director(a):
Wolosiuk, Ricardo Alejandro
 
Institución otorgante:
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Fecha:
2001
Tipo de documento: 
Tesis Doctoral
 
Formato:
text; pdf
Idioma:
Español
Temas:
TIORREDOXINA - INTERACCIONES ELECTROSTATICAS - INTERCAMBIO TIOL/DISULFURO - REGULACION REDOX - CLOROPLASTO
Descripción:
Las Tiorredoxinas (Trxs) son proteínas que se encuentran en todos los sistemas biológicos y poseen una secuencia muy conservada Cys—Gly-Pro—Cys cuyos tioles reducen los puentes disulfuro de una gran variedad de proteínas. En los cloroplastos de los organismos fotosíntéticos oxigénicos la reducción mediada por la Trx modula la actividad proteica ya que este proceso promueve un cambio conformacional en la enzima sustrato. En esta organela se han caracterizado dos Trxs filogenéticamente distantes: la Trx-m tendría un origen procarióticol mientras que la Trx-f presenta gran homologia con la Trx humana. La Trx-f es particularmente eficiente en la modulación in vitro de la actividad la fructosa-1,6-bisfosfatasa (cFBPasa), mientras que la Trx—m es ineficaz. La disponibilidad de las estructuras tridimensionales de las Trxs de diferentes organismos, su pequeño tamaño, gran solubilidad y termoestabilidad hacen de esta proteína un modelo interesante para el estudio de sus características conformacionales. Uno de los objetivos de este trabajo de tesis fue caracterizar estructural y funcionalmente a la Trx— m, y compararla con la Trx de Escherichia coli. La Trx bacteriana se tomó como referencia ya que ha sido ampliamente estudiada y presenta además un alto porcentaje de identidad con la Trx—m.Por otra parte, si bien todas las Trxs comparten el mecanismo catalítico (el intercambio tiol-disulfuro) interaccionan con diferentes proteínas. Las interacciones no covalentes previas a la formación del disulfuro mixto serían las que determinan la especificidad de la Trx por los diferentes sustratos. En este sentido, se analizó la contribución de las interacciones electrostáticas en el reconocimiento Trx-m . cFBPasa. Para realizar estos estudios se aisló la secuencia codificante de la Trx—m de Brassica napus (colza), se sobreexpresó en un sistema heterólogo y se purificó la proteína recombinante. Los aspectos estructurales y funcionales se analizaron mediante mutagénesis sitio-dirigida. A pesar de la gran homología estructural que tienen la Trx—m y la Trx de E. coli, casi todos los estudios realizados mostraron que poseen diferencias fisicoquímicas y funcionales. La Trx—m fue menos eficiente que la Trx de E. coli en la reducción e isomerización de puentes disulfuro. Por otra parte, si bien las Trxs son muy termoestables la Trx—m es aún más estable que la Trx bacteriana. La mutante W17F Trx-m, que conserva los dos triptofanos próximos a las cisteínas catalíticas, permitió establecer que a pesar de que la Trx-m y la Trx bacteriana mantienen la geometría del sitio activol el entorno de estos triptofanos es distinto. Tanto la Trx—m salvaje como la mutante W17F tienen un rendimiento cuántico menor que la proteína bacteriana y la dependencia de la fluorescencia intrínseca con el pH también es distinta. Por otra parte, la mutante Wl7F permitió identificar que el triptofano l7 en la Trx-m es el residuo que más contribuye a la emisión de la fluorescencia intrínseca de la proreína oxidada y contribuye también al espectro de dicroismo circular en el UV lejano. La importancia del triptofano 17 en el núcleo aromático de la proteína se determinó con el reemplazo por un residuo alifático y pequeño (WWA). Esta mutante modificó no sólo las propiedades estructurales (fluorescencia intrínseca y dicroismo circular en el UV lejano) sino también la estabilidad frente a perturbantes físicos y químicos. y la capacidad reductora (insulina y cFBPasa). La prolina en la posición 35 está estrictamente conservada en las Trxs-m y ausente en todas las otras. El reemplazo de esta prolina aumentó la sensibilidad de la molécula a perturbantes químicos y fisicos. La incorporación de una carga positiva en esa posición (P35K) favoreció la interacción con la cFBPasa, mientras que una carga negativa la empeoró (P35E). Estos resultados son congruentes con la densidad de cargas negativas que rodea a las cisteínas de la cFBPasa sujetas a la regulación redox y al contenido de cargas positivas que rodea el sitio activo de la Trx—f,el modulador más eficiente. Por otra parte. altas concentraciones salinas condujeron a todas la Trxs a valores similares de activación. Como conclusión, la cFBPasa discriminaría a las distintas Trxs por interacciones electrostáticas de largo alcance, que determinarían la diferente eficiencia de las Trxs en la modulación de la actividad de esta enzima. Sin embargo, las interacciones electrostáticas no influirían en la interacción entre la Trx y la malato deshidrogenasa, ya que todas las mutantes en la Pro35 resultaron menos eficientes en la acrivación que la Trx-m salvaje El conjunto de estos resultados no sólo establece la participación de las interacciones electrostáticas sino también revela la contribución de otros factores en la formación del complejo no covalente (Trx-m)reducida/(proteína sustrato)oxidada.
Identificador:
http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3389_Duek
Identificador único:
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/h/2328
Derechos:
info:eu-repo/semantics/openAccess
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/
Licencia de uso:
Licencia Creative Commons

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Cita bibliográfica:

Duek, Paula Débora  (2001).     Tiorredoxinas cloroplastídicas.  (Tesis Doctoral).    Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.    [consultado:  ] Disponible en el Repositorio Digital Institucional de la Universidad de Buenos Aires:  <http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3389_Duek>