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Institución otorgante:
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Fecha:
2002
Tipo de documento: 
Tesis Doctoral
 
Formato:
text; pdf
Idioma:
Español
Temas:
Biología / Parasitología - Biología / Biología Molecular y Celular
Descripción:
En nuestro laboratorio se clonaron dos CRKs (CDK1 Related Kinases) de T. cruzi, TzCRK1 y TzCRK3 (Gómez y col., 1998) y se identificaron, por doble híbrido, proteínas que se asocian a TzCRK1 con similitud a una familia de ciclinas (Gómez y col., 2001). En el presente trabajo de tesis se caracterizaron y clonaron proteínas candidatas a participar en el control del ciclo celular de T. cruzi. Se secuenciaron en su totalidad los fragmentos de los genes obtenidos por doble híbrido y se los denominó TzCYC4, TzCYC5 y TzCYC6. Además se clonaron los genes completos y se secuenciaron. La secuencia predicha para las tres proteinas mostró similtud con ciclinas denominadas PHO, presentes en S. cerevisiae. TzCYC5 posee una región rica en histidinas próxima al amino terminal. Se determinó que los tres genes son de copia única mediante Southern blot y por rastreo de una biblioteca genómica. La expresión de los tres genes mostró variaciones particulares en distintos estadios de T. cruzi. TzCYC6 complementó una cepa mutante de S. cerevisiae, deficiente en las ciclinas de G1, demostrando que es una ciclina funcional. Se determinó el patrón de expresión de TzCRK3 en estadíos de T. cruzi. El ARNm de TzCRK3 es más abundante en el estadío amastigotes que en epimastigotes o tripomastigotes. Se obtuvo un suero específico contra TzCRK3, inmunizando conejos con la proteína recombinante expresada en bacterias. Ensayos de Western blot mostraron, en epimastigotes la presencia de una proteína del peso molecular esperado, 35 kDa. En amastigotes y tripomastigotes, se observaron bandas específicas de menor movilidad. Se estableció que la proteina identificada en epimastigotes se asocia a p13ˢͧͨ¹-agarosa, proteína con alta afinidad por CDK1. TzCRK3 endógena mostró actividad quinasa de histona H1 y fue inhibida por inhibidores de CDKs: flavopiridol, roscovitina y olomoucina. Flavopiridol inhibió el crecimiento de epimastigotes en cultivo, aunque no en forma total. La actividad quinasa de la TzCRK3 de dichos epimastigotes se inhibió en forma dosis dependiente. La actividad de quinasa de histona H1 asociada a p13ˢͧͨ¹ mostró las mismas variaciones estadío especificas y similar sensibilidad a los CK1s que TzCRK3. En los cultivos con flavopiridol el IC50 no mostró diferencias significativas con el de TzCRK3. La actividad de TzCRK3 en epimastigotes sincronizados mostró un pico en G2/M mientras que la actividad asociada a p13ˢͧͨ¹ aumentó al mismo tiempo pero no disminuyó hasta M. La expresión de TzCRK3 fue constante. Los patrones de actividad y expresión de TzCRK3 son tipicos de una CDK. Esta evidencia indica que TzCRK3 está involucrada en el control del ciclo celular de T. cruzi, controlando el pasaje de G2/M, aunque no se puede excluir la presencia de otra CDK. Se identificó un EST con alta similitud de secuencia con Lmmp12ͨᴷˢ¹, el gen homólogo a p13ˢͧͨ¹ en Leishmania mexicana. Se clonó el gen completo y se determinó que es copia única. La secuencia esperada de la proteína muestra una alta identidad de secuencia con la familia de proteinas CKS. Su expresión mostró variaciones estadío especificas. La proteina recombinante se expresó en bacterias, en fusión a histidinas, se la purificó y se inmunizaron conejos para obtener un anti suero.
Identificador:
http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3486_Santori
Identificador único:
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/h/4159
Derechos:
info:eu-repo/semantics/openAccess
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/
Licencia de uso:
Licencia Creative Commons

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Cita bibliográfica:

Santori, María Isabel  (2002).     Clonado y caracterización de proteínas relacionadas al control del ciclo celular del parásito Trypanosoma cruzi.  (Tesis Doctoral).    Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.    [consultado:  ] Disponible en el Repositorio Digital Institucional de la Universidad de Buenos Aires:  <http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3486_Santori>