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Interacción entre geometría y dinámica en la modulación de señales intracelulares de calcio


Interaction of geometry and dynamics on the modulation of intracellular calcium signals

Piegari, Estefanía

Director(a):
Ponce Dawson, Silvina
 
Institución otorgante:
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Fecha:
2016-03-30
Tipo de documento: 
Tesis Doctoral
 
Formato:
text; pdf
Idioma:
Español
Temas:
Biología / Biología Molecular y Celular - Física / Microscopía - SEÑALES INTRACELULARES DE CALCIO - RECEPTORES DE IP3 - DINAMICA ESPACIO-TEMPORAL - MICROSCOPIA CONFOCAL - FLUCTUACIONES DE LA FLUORESCENCIA
Descripción:
Las señales de Ca²⁺ son ubicuas y juegan un rol importante en numerosos procesos fisiológicos como la fertilización o la muerte celular. Su versatilidad se basa en la variedad de comportamientos espacio-temporales que puede mostrar la concentración de calcio intracelular y en que distintos comportamientos pueden inducir respuestas diferentes. La liberación de Ca²⁺ desde el retículo endoplasmático (RE) hacia el citosol a través de receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (RIP3s) es una componente clave dentro de los mecanismos de señalización por Ca²⁺. Los RIP3s necesitan unir IP3 y Ca²⁺ para abrirse por lo que la liberación de Ca²⁺ a través de un único RIP3 puede inducir la apertura de otros canales vecinos, mecanismo que se conoce como liberación de calcio inducida por calcio o CICR por las siglas en inglés. Los RIP3s aparentemente se organizan en cúmulos sobre la membrana del RE (clusters). Si el CICR se encuentra limitado a un cluster, las señales pueden permanecer localizadas (puffs). En caso contrario, pueden convertirse en ondas que se propagan entre clusters. Los puffs son los ladrillos de construcción de esas señales más globales que se propagan por toda la célula. Por este motivo, existe un gran interés en la determinación de las propiedades de los puffs, especialmente en vista de la actual controversia sobre la distribución espacial de los RIP3s activables. Las señales de calcio, por otro lado, pueden remodelarse a través de varios mecanismos, entre ellos, el atrapado del Ca²⁺ por parte de buffers. Éstos no sólo disminuyen la concentración de Ca²⁺ libre sino que modifican su distribución espacio-temporal de distintos modos dependiendo de su cinética. Los puffs de Ca²⁺ se han observado en células intactas con técnicas ópticas mostrando que son intrínsecamente estocásticos. La obtención de una imagen correcta de la dinámica de los eventos entonces implica ser capaz de detectar todo el rango de tama~ nos de puffs. Éstos se observan usando indicadores de Ca²⁺ de una longitud de onda visible y buffers exógenos lentos (por ej; EGTA) para disrumpir el CICR entre clusters. Los indicadores de única longitud de onda aumentan su uorescencia al ligar calcio. De esta manera, generan imágenes que dependen fuertemente de su cinética, transporte y propiedades fotofísicas. Por este motivo, es de particular importancia determinar los artefactos que generan las condiciones del experimento. La propia existencia de los puffs depende de que los RIP3s están organizados en cúmulos. Una distribución uniforme de receptores debería dar lugar típicamente a señales propagantes tipo ondas. Los ovocitos de Xenopus laevis son un sistema experimental ventajoso para estudiar estas señales. Durante la fertilización se evoca una onda de Ca²⁺ que se propaga por toda la célula. La fertilización ocurre en el huevo maduro. Se ha observado que, al madurar el ovocito, su RE se configura y la distribución de los RIP3s parece ser más uniforme. Esto tiene un correlato en las características de las señales evocadas en los ovocitos maduros. En esta Tesis se combinaron experimentos, un análisis teórico y simulaciones numéricas para evaluar de qué modo la geometría de la distribución de canales se combina con alguno de los otros aspectos que in uyen sobre la distribución de calcio libre para determinar las características de las señales. El primer aporte fue introducir un método que permite establecer clases equivalentes de experimentos de obtención de imágenes realizados en condiciones diferentes, donde la clase está determinada por la relación señal-ruido que predice el método. Éste también puede utilizarse para estimar el tamaño de las señales más pequeñas que pueden observarse de manera confiable con cada arreglo y para generar imágenes de uorescencia numéricamente con ruido realista. Esta Tesis también contribuyó a estudiar si la presencia del indicador o del EGTA en distintas condiciones experimentales altera la dinámica intracelular de Ca²⁺, en particular, analizar si son capaces de detectar puffs de Ca²⁺ con similar precisión y de qué modo las distintas configuraciones experimentales afectan las propiedades de los puffs observados y la dinámica del Ca²⁺ subyacente. Se pudo determinar que aunque el indicador o el EGTA no alteran la dinámica intracluster del Ca²⁺, el conjunto de eventos observables del experimento es diferente dependiendo del grado de acoplamiento entre clusters. El estudio, por otro lado, permitió inferir que los puffs con mayor liberación de Ca²⁺ provienen de cúmulos donde los RIP3s están muy cerca unos de otros. Para estudiar en más detalle la disrupción del CICR entre clusters vecinos que inducen los buffers lentos, se realizaron experimentos utilizando simultáneamente dos indicadores de calcio de distinta cinética. Utilizando el método introducido pudimos confirmar nuestra conclusión previa sobre cómo se modifica el conjunto de eventos que se evoca en presencia de buffers lentos. Por otro lado, determinamos que la presencia de buffers rápidos da lugar a liberaciones de Ca²⁺ más prolongadas tal vez debido a que reducen el efecto inhibidor del Ca²⁺ sobre los RIP3s. En relación a la razón por la que los buffers lentos disrumpen el acoplamiento entre clusters pudimos concluir que su presencia disminuye el Ca²⁺ basal, aunque no tanto como para explicar la disrupción. El análisis de la diferente distribución espacio-temporal de los buffers lentos y rápidos parecería indicar la presencia de RIP3s en el espacio entre clusters que podrían ser "silenciados" por los buffers lentos evitando así la propagación de las señales entre cúmulos. Finalmente, en la Tesis se han mostrado también resultados preliminares de señales de calcio que se observan en células maduradas, cuyos cambios pueden explicarse en términos de una distribución espacial distinta de RIP3s.
Identificador:
http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5977_Piegari
Identificador único:
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/h/2730
Derechos:
info:eu-repo/semantics/openAccess
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/
Licencia de uso:
Licencia Creative Commons

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Cita bibliográfica:

Piegari, Estefanía  (2016-03-30).     Interacción entre geometría y dinámica en la modulación de señales intracelulares de calcio.  (Tesis Doctoral).    Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.    [consultado:  ] Disponible en el Repositorio Digital Institucional de la Universidad de Buenos Aires:  <http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5977_Piegari>