Descripción: Las macroalgas constituyen un sustrato favorable para el asentamiento de epibiontes y forman matrices tridimensionales que facilitan la supervivencia de macroinvertebrados en ambientes de elevao estrés. En esta tesis se abordaron cuatro líneas de trabajo tendientes a dilucidar las interacciones producidas entre las macroalgas bentónicas y los invertebrados marinos. Se estudió la composición y biogeografía de briozoos epibionts de macroalgas a lo largo de 29 grados de latitud a partir de muestras depositadas en el herbario del Museo Argentino de Ciencias Naturales. Aunque los patrones hallados están influenciados por la distribución desigual del esfuerzo de muestreo, puede concluirse que la biodiversidad de los briozoos y macroalgas es mayor en la Patagonia austral que en el litoral bonaerense y rionegrino. Se describe una nueva especie de briozoo antártico (Osthimosia chaotica) y se identifican otras dos nuevas especies, aún no descriptas. También se amplía la distribución geográfica para cuatro taxones. Se analizó el recambio taxonómico y las variaciones en la estructura del ensamble de macroinvertebrados asociado a coralináceas intermareales o diferentes escalas espaciales. Los resultados muestran que los cambios observados entre provincias son los más marcados, reflejado im reemplazo casi completo entre biotas de aguas templado-cálidas y templado-frías en el Atlántica Sudoccidental. Se estudió la distribución de colonias del briozoo Antarctothoa bougainvillei sobre la rodofita Hymenena laciniata en ambientes someros de Bahía San Sebastián (Tierra del Fuego). Las ancéstrulas se asentaron principalmente en las áreas centralede los frondes, orientándose hacia las partes jóvenes del alga. Las colonias recubren una baja proporción de tejidos reproductivos algales sugiriendo que, en caso de existir, su efecto negativo sobre el alga sería mínimo.

Descripción: Durante la evolución de las plantas vasculares, la fotosíntesis C4 ha surgido más de 60veces. La mayoría de los estudios que analizaron la evolución y las ventajas ecofisiológicas delsindrome C4 se han realizado en gramíneas. Sin embargo, en dicotiledóneas, la fotosíntesis C4ha surgido en linajes morfológicamente más diversos. Así, las conclusiones sobre la evoluciónde la fotosíntesis basadas en la familia Poaceae, no necesariamente pueden ser aplicadas adicotiledóneas. En la familia Amaranthaceae se estima que la vía C4 podría haber surgidocinco veces de manera independiente, con al menos tres orígenes dentro de la subfamilia Gomphrenoideae. De esta manera, la presente tesis se propone comparar la distribuciónclimática entre especies C3 y C4 de la subfamilia Gomphrenoideae en un contexto filogenético. Para ello, se evaluó el rango de cada especie comparando los extremos superior e inferior detres variables macro-climáticas entre especies C3 y C4. Se utilizó el método “Phylogenetic Generalized Least Squares”y se testeó si la evolución de la fotosíntesis C4 se correlacionacon una especialización de nicho donde ambos extremos de las variables climáticas cambiande posición, o si se correlaciona con una expansión de nicho donde sólo uno de los extremosvaría. Los resultados mostraron que las especies C4 alcanzan regiones más secas y frías quesus parientes C3 más cercanos. No obstante, la expansión hacia climas más fríos sólo incluyóáreas con bajas temperaturas durante el invierno. No se encontraron evidencias de un cambiode nicho hacia regiones más cálidas. Durante la compilación de datos realizada en la primer etapa de esta tesis, surgió lanecesidad de clarificar el estado taxonómico de numerosos nombres. Por consiguiente, en unasegunda parte se realizó una detallada b´usqueda bibliográfica y compilación de ejemplarestipo para las especies del género Gomphrena. A partir de la observación de ejemplares deherbario, se identificaron los caracteres diagnósticos y se confeccionó una clave dicotómicapara las especies de Gomphrena del Cono Sur.

Descripción: Fil: Galassi, Nora Virginia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: El giro dentado del hipocampo es una de las áreas del cerebro adulto capaz de generar neuronas durante toda la vida. Al momento de comenzar la presente tesis se desconocía completamente el fenómeno por el cual una célula progenitora neural (NPC) se transforma en una neurona integrada en el circuito local. Se planteó entonces el objetivo de investigar de qué manera un proceso de desarrollo neuronal se integraría en un entorno completamente funcional como el giro dentado adulto. Para caracterizar este fenómeno se marcaron las NPCs del giro dentado de ratones adultos mediante un retrovirus modificado para expresar la proteína fluorescente verde en las neuronas nuevas. Inicialmente se estudió la progenie celular a diferentes intervalos post marcado retroviral analizando la progresión temporal de marcadores neuronales, la migración, y los cambios morfológicos subyacentes. Se encontró que la determinación del destino neuronal ocurre durante los primeros días. La migración radial y el crecimiento de neuritas ocurren durante la segunda semana, momento en que se evidencia una incipiente morfología neuronal. El fenotipo neuronal maduro se alcanza durante la cuarta semana. Notablemente, la secuencia de maduración encontrada recapitula los principales eventos que ocurren durante el desarrollo perinatal, sólo que con una cinética más lenta. A partir de estas observaciones planteamos una nueva hipótesis: la velocidad de maduración de las neuronas nuevas es modulada por la actividad neuronal del circuito local. Dado que el hipocampo dorsal y ventral se especializan en diferentes funciones, se estudió la expresión de ARC (cuya inducción depende de actividad) y se encontró una mayor actividad y una maduración neuronal más rápida en el giro dentado dorsal. A su vez, se utilizó el ejercicio voluntario para incrementar la actividad del hipocampo y se observó una aceleración significativa de la maduración neuronal. Por lo tanto, concluimos que la tasa de maduración neuronal es modulada por la actividad del circuito local. Este fenómeno representa un nuevo mecanismo de plasticidad neuronal del hipocampo adulto.

Descripción: El Jilguero Dorado Sicalis flaveola pelzelni, es una subespecie sexualmente dicromática, en la cual los machos adultos presentan una coloración amarilla, y las hembras y machos juveniles presentan una coloración blanquecina con estriado en alas y regiones superiores del cuerpo; estos últimos son indistinguibles para la visión humana. Los objetivos de este trabajo fueron estudiar el posible rol de la coloración y el canto de los machos en la elección de pareja por parte de las hembras. Se estudió la coloración del plumaje tanto de hembras como en machos jóvenes y adultos por medio de espectro-fotometría de reflectancia, y posteriormente por modelos de discriminación de color. Asimismo, se analizó en profundidad el canto de la subespecie; en primer lugar, para caracterizar las vocalizaciones de los machos amarillos, y posteriormente se realizaron análisis longitudinales de las vocalizaciones entre temporadas reproductivas sucesivas, en dos grupos: 1) entre los machos de 1 año de coloración inmadura y cuando éstos ya tienen dos años y presentan su plumaje maduro amarillo, y 2) entre individuos de plumaje maduro en años sucesivos. Se halló variabilidad significativa en la coloración del plumaje en cada uno de los tres grupos (hembras, machos jóvenes y machos adultos), y señales de apareamiento selectivo entre las hembras y los machos jóvenes de plumaje inmaduro. Sin embargo, utilizando un modelo de discriminación del color, los machos jóvenes y las hembras son indistinguibles para los coespecíficos y se concluye que el apareamietno detectado estadísticamente carece de significado biológico. Los análisis de vocalizaciones revelan un repertorio de sílabas de la población muy extenso, de más de 80 sílabas, las cuales recombinan generando una gran variabilidad en el canto. Los análisis longitudinales muestran que la subespecie presenta aprendizaje abierto, aunque la mayor variación ocurre entre el primer y segundo año de vida. Un total de 305 individuos (54 hembras, 53 machos y 198 pichones), pertenecientes a 54 familias fueron genotipados exitosamente en 5 loci microsatélites. En el 51,8 % de las nidadas hubo al menos un pichón extra pareja; y el 31,8 % del total de pichones analizados resultó ser extra pareja. El valor promedio de parentesco genético entre los adultos genotipados en cada temporada, fue de (R2013 = -0,02 ± 0,008, n = 43; R2014 = -0.11 ± 0.007, n = 51, R2015= -0.015 ± 0.007, n = 38), valor esperado para individuos no relacionados. Se estimaron variables respuestas representativas del éxito reproductivo de los machos: pérdida de paternidad de al menos uno de los pichones de su nidada social; y éxito en obtener paternidad de un pichón fuera de su nidada social. Para evaluar la asociación entre las variables de éxito reproductivo de los machos y las variables de canto y color, se ajustaron Modelos Lineales Generalizados y Mixtos (GLMM). No se encontró evidencia que permita apoyar el efecto de las variables de color y canto en la pérdida o ganancia de paternidad en las nidadas extra-pareja en Jilgueros Dorados.

Descripción: El estudio de las “historias de vida” comprende el balance entre las demandas energéticasque requieren los organismos para nacer, crecer hasta la madurez, reproducirse ysobrevivir. La mayoría de los estudios sobre la historia de vida y biología reproductiva delas aves se han realizado en el Hemisferio Norte donde habitan menos del 25 % de lasespecies del planeta. El Jilguero Dorado es un Passeriforme relativamente abundante en Argentina y poco estudiado; son frecuentemente capturados como aves de jaula y losmachos de esta especie presentan maduración tardía del plumaje (MTP). Los objetivos deesta Tesis fueron determinar si existen diferencias en los caracteres de historia de vidarelativos a los nidos de machos blancos y amarillos y, además, determinar mediante unamanipulación, si los adultos disminuyen el esfuerzo reproductivo presente resguardando susupervivencia, o si aumentan el esfuerzo parental a costa de su propia supervivencia enrelación a la MTP. El estudio se llevó a cabo en un sistema de cajas nido ubicado en el IIBInTeCh, Chascomús, Pcia. de Buenos Aires, entre los años 2005 y 2010. Se encontró quelas hembras apareadas con machos amarillos resultaron ser significativamente más pesadasque aquellas apareadas con machos blancos así como el peso de sus huevos; la vida mediade los machos reproductivos amarillos de Jilguero Dorado fue de 3.2 años y la de losmachos reproductivos blancos fue 5 meses menor; las hembras manipuladas apareadas conmachos blancos disminuyeron su peso un 10% más que los controles así como fue menor laduración de sus visitas de alimentación a los pichones; los pichones pertenecientes a nidosde hembras manipuladas apareadas con machos blancos presentaron una menor tasa decrecimiento y peso asintótico al abandonar el nido. Estos resultados apoyan la existencia deun apareamiento selectivo y en este caso, las hembras de menor calidad estarían obligadas areproducirse con los machos blancos. Las respuestas encontradas en las variablesanalizadas de los machos blancos son idénticas a las de los machos amarillos en todos losaspectos analizados en este trabajo.

Descripción: En el presente trabajo se desarrolla un sistema decomputacion, a1 cual se denominó MAG88, orientado a su aplicaciónen los estudios paleomagnéticos. Este sistema fue realizado enlenguaje Pascal y funciona en computadoras de tipo personal,ocupando, una vez compilado un espacio de unos 374 Kbytes. MAG88cubre practicamente todas las funciones de analisis que serealizan durante un estudio paleomagnético, para ello se hanimplementado los algoritmos necesarios para analizar: i) datos deremanencias magnéticas de muestras obtenidas en magnetómetros dealta sensibilidad; ii) poblaciones de polos geomagnéticosvirtuales (PGV’s), polos paleomagnéticos (PP‘s), direccionesmedias de magnetización y planos de remagnetización y iii)realizar rotaciones finitas de PP’s y de contornos continentalespreviamente digitalizados. Entre las funciones de calculo másimportantes se han implementado la estadística de Fisher,determinación del plano que mejor ajusta a una población devectores unitarios, separación de componentes de magnetizaciónmediante resta vectorial, correcciones por posicion de campo yactitud estructural, cálculo de posiciones polares a partir dedirecciones de magnetización, rotación finita de vectores sobreuna esfera y cálculo de rotaciones resultantes a partir de variasrotaciones parciales. Se propone además una generalización de laestadística de Fisher para poblaciones no circulares, unparámetro de precisión para evaluar componentes magnéticasaisladas mediante resta vectorial y un procedimiento iterativopara la obtención de poblaciones hemisféricas de PGV‘s. En MAG88 se han implementado distintos procedimientosgráficos tales como la representación en pantalla de laproyección estereográfica de vectores, curvas dedesmagnetización, diagramas de Zijderveld y proyección decontornos continentales o cualquier otro rasgo geológicopreviamente digitalizado. Una característica importante que poseeéste programa, es la posibilidad de seleccionar los Vectores aemplear en los distintos procedimientos de cálculo, sobre losgráficos presentados en pantalla, con lo cual se facilitan lasoperaciones de análisis. Por, otra parte es posible controlar ungraficador para representar vectores en proyecciónestereográfica. También se ha desarrollado un editor gráfico quepermite digitalizar dibujos geométricos en pantalla. Entre los principales procedimientos auxiliares existentesse pueden mencionar un editor para la entrada y salida de datos,posibilidad de convertir archivos de MAG88 en archivos de texto yviceversa y unión de archivos. También es posible convertircualquiera de los gráficos presentados en pantalla en archivos deintercambio de datos con programas comerciales de diseño asistidopor computadora y realizar el procedimiento inverso. Dadas las características de este sistema, su aplicación seextiende a otras ramas de las Ciencias de la Tierra, por ejemploel análisis estadístico de vectores en el espacio, ladeterminación de círculos máximos y la representaciónestereográfica de vectores pueden ser empleados en Geología Estructural, Petrología, Sedimentología, Cristalografía. Larotación de contornos continentales u otros rasgos geológicospreviamente digitalizados transforma a MAG88 en una útilherramienta para los estudios geotectónicos y paleogeográficos. Con el objetivo de demostrar el uso de MAG88 y aportarnuevos datos al estudio de los sedimentos cretácicos de la Cuenca Neuquina se realizó el estudio paleomagnético de tres perfiles dela Formación Rayoso. Los sitios de muestreo paleomagnético estanubicados en las inmediaciones de Balsa Huitrín (Sitio CR) y enlos flancos del “Anticlinal del Agrio" (Sitios AG y NQ). Elestudio paleomagnético demostro que las rocas en estudio poseíancaracterísticas magnéticas complejas. Despues de su analisis sepudo determinar la existencia de dos componentes demagnetización, una de ellas, denominada Componente I, constituyeuna magnetizacion remanente secundaria con inclinacionesnegativas, adquirida con posterioridad al plegamiento del area. El polo paleomagnético (PP) calculado para dicha componente escomparable en posición con (PP's) del Cenozoico. La otracomponente o Componente Magnética II, posee direcciones coninclinaciones principalmente positivas. La componente IIseparada del sitio CR, está posiblemente afectada por unasuperposición en sus espectros con la componente I, lo cualafecta las direcciones, obteniéndose una poblacion de polosgeomagnéticos virtuales de baja calidad estadística. El PPobtenido a partir de las direcciones de la componente II de lossitios AG y NQ, luego de realizar la Corrección por estructura,es compatible en posición con la población de PP's de América del Sur, particularmente con el tramo de la curva de desplazamientopolar aparente establecida para el Cretácico inferior. Lacomparación de las polaridades determinadas para el PP de la Formación Rayoso con el registro de las anomalías magnéticas defondo oceanico permite homologarla al “Serra Geral Mixed". Estaúltima comparación definiría la existencia de por lo menos unaptiano inferior en la Formación Rayoso.

Descripción: Se realizó un estudio geológico y geofísico, en distintas áreas de la llanura Pampeana, sobre sedimentos cuaternarios con paleosuelos intercalados en ellos. Se eligieron perfiles con paleosuelos de diferentes edades, desarrollados tanto sobre sedimentos loéssicos (Formación Buenos Aires y Formación La Postrera) como sobre sedimentos fluviales (Formación Luján); con el objetivo de evaluar y relacionar los cambios acaecidos en los minerales magnéticos como consecuencia de las variaciones climáticas ocurridas durante el desarrollo del suelo. Las localidades donde se llevaron a cabo las investigaciones son: Luján y San Antonio de Areco (al norte de la provincia de Buenos Aires), Olavarría (en el centro de la provincia) y en la Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Se determinaron los parámetros magnéticos no direccionales en todas las secuencias. De la evaluación de las investigaciones efectuados surge que los procesos pedogenéticos afectan el material parental, produciendo en los horizontes edafizados variaciones en la concentración de minerales ferromagnéticos. En primer lugar, el comportamiento magnético más conspicuo detectado en los niveles estrictamente relacionados con procesos pedogenéticos; es que se produce un empobrecimiento de los minerales ferrimagnéticos detríticos (magnetita y / o titanomagnetitas) reflejado en la disminución de los valores de los parámetros extensivo. Una particular conducta observada, es la formación de neominerales de dos tipos: antiferromagnéticos y ferrimagnéticos. La neoformación de minerales ferrimagnéticos son nanopartículas de magnetita y/o maghemita(estado de dominio magnético superparamagnético, SP). En algunos perfiles se detectó solo la presencia de estas partículas y en otros se pudo determinar el tamaño de grano de las mismas, el cual es aproximadamente de 0,01 μm. Estos minerales se producirían durante los períodos relativamente más húmedos. Se corroboró la ulterior génesis de minerales de alta coercitividad (hematita y / o goethita). La presencia de los minerales antiferromagnéticos fue detectada por el aumento de los valores de coercitividad, de la forma de los ciclos de histéresis y del análisis de las curvas de IRM. La presencia de estos minerales estaría indicando un clima relativamente más cálido y húmedo con una marcada estación seca. Se propone una correlación entre las unidades estudiadas y las fluctuaciones paleoclimáticas conocidas para el Pleistoceno- Holoceno.

Descripción: Fil: Milanese, Florencia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: El presente es el primer estudio paleomagnético realizado en sucesiones marinas del Jurásico de la Argentina y el Hemisferio Sur. Se establecieron 7 criterios ("C") para valorar la calidad de los estudios magnetoestratigráficos, aplicables a secciones más antiguas que el Jurásico Medio a Temprano: 1) Precisión cronológica de los métodos de datación que no debería superar el rango de una biozona de amonites (1,1- 1,4 m.a.); 2) Métodos de control cronoestratigráfico de detalle; 3) Evidencias de confiabilidad de las magnetizaciones aisladas; 4) Direcciones de polaridad antípodas; 5) Estudios y/o pruebas paleomagnéticas de campo; 6) Estudios de secciones sin rotaciones tectónicas y sin hiatos importantes; 7) Posibilidad de correlacionar la sucesión de polaridades obtenida con otras de la misma edad y coincidencia de sus posiciones polares. A través del paleomagnetismo, se determinó que cuerpos andesíticos en sucesiones del Hettangiano-Sinemuriano en la región del río Atuel, corresponden a filones capas prácticamente coetáneos con el cierre del sistema magnético de la sucesión sedimentaria. Se estableció que para evitar errores en la determinación de las direcciones magnéticas y por lo tanto en el cálculo de los PPs, es importante considerar todas las correcciones de campo posibles para mover los vectores magnéticos a la posición que habrían presentado en el momento de la adquisición de la remanencia. Por ejemplo, en el caso de las magnetizaciones de origen detrítico aisladas en sedimentos muy finos, es común que la compactación hubiera afectado la inclinación magnética original. En el arroyo Malo, la corrección de decompactación determinada en el Fm. Puesto Araya alcanza los 6,5°, en tanto que en el perfil del arroyo Las Chilcas la corrección media es de 5°. Se elaboró una escala magnetoestratigráfica local para el Hettangiano-Sinemuriano y Pliensbaquiano Temprano, sobre la base de perfiles ubicados en las zonas del ría Atuel, sin evidencias de superposición temporal. Por otra parte, sobre la base de la correlación y compilación de las polaridades magnéticas registradas en las biozonas representadas en perfiles ubicados en el norte, centro y sur de la Cuenca Neuquina, se elaboró una escala magnetoestratigráfica compuesta que comprende el resto del Pliensbaquiano hasta el Toarciano Medio. La máxima confiabilidad en las correlaciones magnetoestratigráficas fueron establecidas en el Pliensbaquiano Temprano y Tardío. La escala magnetoestratigráfica determinada en este estudio para el Hettangiano-Toarciano comprende 14 zonas de polaridad reversa (A1- 14r) y 13 de polaridad normal (A1- 13n), registradas en 17 biozonas de amonites, que se correlacionan con 54 reversiones de polaridad representadas en 16 biozonas de amonites, en la escala internacional considerada. Con esots datos magnetosestratigráficos, fue posible en este estudio, ajustar la correlación entre las Zonas de amonites Estadard de Europa y las Pacífico Suroriental. Sobre esta base, se propusieron algunas modificaciones en la escala magnetoestratigráfica internacional, i.e. en el Hettangiano, Sinemuriano y Toarciano Temprano. A través de la escala magnetoestratigráfica compuesta resultante fue posible además. determinar en tramos sin registros paleontológicos la presencia de niveles cronológicamente equivalentes a biozonas. Se obtuvieron dos PPs para el Jurásico Inferior de América del Sur, uno ("RA") ubicado en Long= 235,3° E, Lat= 56,2° S y A95= 4°correspondiente al Hettangiano-Sinemuriano, y otro ("CN") ubicado en Long= 91,0°E, Lat= 80,6°S y A95= 2,7° correspondiente al Pliensbaquiano-Toarciano. Ambos polos pasan diversas pruebas de campo y se les asigna Q=7. Se propone que entre el Hettangiano Tardío (200 Ma) y el Pliensbaquiano Temprano (190 Ma), el continente tuve un desplazamiento de gran magnitud y velocidad (~ 15cm/año), lo cual descartaría la hipótesis de un período cuasi estático Pérmico-Jurásico propuesta por otros autores. Se postula que durante el Hettangiano-Sinemuriano (200 Ma), América del Sur se habría encontrado en latitudes altas, con la localidad de Rajapalo-Chacay Melehue ubicada entre los 50° y 54° S; en el Pliensbaquiano-Toarciano Medio (190- 184 Ma), habría estado más al norte, con RP-CM ubicada a los 25° S y, en el Toarciano Tardío hasta por lo menos Bathoniano (184- 170 Ma) el continente habría estado nuevamente en latitudes más altas, con RP-CM ubicada entre los 37° y 41° S. Estos desplazamientos son consistentes con datos biogeográficos de faunas de bivalvos de América del Sur. Se determinó un muy buen ajuste entre las CDPA de América del Sur y Eurasia, con una notable coincidencia en la presencia, forma y edad de un cusp a 190 Ma, que sugieren similares direcciones, velocidades y edades de desplazamiento para ambas placas continentales. Sobre esta base, los desplazamientos paleolatitudinales observados en América del Sur durante el Jurásico Temprano habría ocurrido en todo el conjunto de la Pangea. Se propone en este estudio que el mecanismo que habría originado tales movimientos fue un desplazamiento polar verdadero más que de tectónica de placas. De este modo, en el Hettangiano-Sinemuriano (200 Ma), la Pangea se habría ubicado en su posición más austral, y posteriormente se habría desplazado a alta velocidad hacia el norte, hasta el Pliensbaquiano Temprano. Luego del Toarciano Medio-Tardío, la Pangea se desplazará nuevamente hacia el sur, hasta fines del Jurásico Medio. Datos biogeográficos de las faunas de amonites del Hemisferio Norte son consistentes con los desplazamientos propuestos sobre la base del paleomagnetismo. En consecuencia, se propone la utilización de los PPs de América del Sur junto con los de Eurasia correspondientes al Jurásico Temprano a Medio, para construir una CDPA sintética al como referencia, para valorar magnitudes y direcciones de desplazamientos en otros continentes.

Descripción: El campo de investigación de los sistemas nanoscópicos magnéticos ha despertado interéscreciente en las últimas dos décadas. No son ajenas a este fenómeno las aplicacionestecnológicas de los mismos en distintas áreas. En esta tesis hemos estudiado las propiedades magnéticas y, esencialmente, de magnetotransportede dos tipos de sistemas bien diferenciados: multicapas de Fe/Cu con Cr yaleaciones granulares de Co en Ag. Aún cuando ambos tipos de sistemas están compuestospor metales nobles y metales de transición magnéticos, en el primer caso los metalesestán depositados en capas continuas y presentan magnetorresistencia inversa, mientrasque en el otro forman aleaciones granulares cuyas características de transporte dependende la presencia y valor del campo magnético aplicado durante el crecimiento. Para ambos tipos de sistemas hemos obtenido teóricamente la conductividad dentrodel marco de la ecuación semiclásica de Boltzmann logrando una modelización adecuadaque da cuenta de los resultados experimentales. Hemos puesto de manifiesto la importanciade las bandas electrónicas para explicar las particularidades experimentales de cadauno de los sistemas, tales como la evolución en función del campo magnético de la GMRcn las multicapas de Fe/Cu con Cr y la coalescencia de los gránulos de Co, puesta de manifiestoa través de las propiedades de magnetotransporte, en el segundo sistema. Para lasaleaciones granulares de Co en Ag hemos mostrado experimentalmente, haciendo medicionesde magnetización, de resonancia ferromagnética y de transporte eléctrico, queel comportamiento de aleaciones homogéneas es distinto al de las aleaciones granularescrecidas en multicapas.

Descripción: Los estudios paleomagnéticos imponen actualmente la necesidad de contar con magnetómetros que permitan la medición del magnetismo remanente (M.R.) de muestras de rocas de las mas variadas caracteristicas litológicas y magnéticas. Al comienzo de la decada actual, tales instrumentos no eran fabricados por las empresas comerciales; es por ello que el Laboratorio de Paleomagnetismo de la Universidad de Buenos Aires (U.B.A.) encara el diseño y construcción de un magnetómetro rotativo de bajo número de revoluciones, (≈ 8 rev./s) y de alta sensibilidad,(magnetómetro U.B..A. 8 Hz). El magnetómetro U.B.A. 8 Hz fué puesto en servicio en 1973 y demostró, a lo largo de 6 años de uso, ser un instrumento robusto y sencillo de operar. Presenta además las siguientes caracteristicas técnicas, avaladas por la medición de mas de 6000 muestras: i)sensibilidad máxima 2x10 -9 uem.cm-3 ii) alcance maximo 0,8 uem.cm-3 ; iii) acepta muestras cubicas de 3cm de lado o cílíndricas de 2,5h cm de diametro y altura variable (máximo 3 cm); iv) permite la medición alternada de muestras friables magnéticamente fuertesy débiles sin riesgo de contaminación; v) permite la medición de muestras sin consolidar como son los fangos provenientes de los fondos de lagos y océanos y vi) permite la medición de muestras que contengan acido clorhídrico en sus poros sin riesgo de causar deterioros en el equipo. Los estudios paleomagnéticos realizados con rocas de la Argentina, Brasil y Angola en los cuales el magnetómetro U.B.A. 8 Hz sirvió de apoyo, coayuvaron a definir la evolución del Supercontinente Gondwana,el origen del Atlántico Sur, la correlación de rocas de edad Paleozoica temprana y tardía, la evolución magmática de los Andes y la variación paleosecular del campo magnético terrestre en tiempos históricos recientes. En la parte final de éste trabajo se hace una revisión del estado actual del conocimiento en el tema: la evolución del Supercontinente Gondwana desde el Precámbrico tardío. La curva de desplazamiento polar aparente comün para América del Sur y Africa durante el Paleozoico tardio y Mesozoico se tomó como base para lograr la reconstrucción del Gondwana. La posición de los polos paleomagnéticos de los continentes gondwánicos asignadosal Precámbríco tardío y Paleozoíco temprano son coherentes con tal reconstrucción y sugieren que el Gondwana existió desde hace por lo menos 1000 m.a.. El rápido desplazamiento de este Supercontinente respecto al polo, es coherente con la distribución de los numerosos depositos glaciaríos de edad Precámbríca tardía y Ordovicica tardía del Africa, lo cual sugiere que su ubicación y origen estan relacionados con tal proceso. Las ramificaciones que se observan en la curva de desplazamiento polar aparente del Supercontinente Gondwana desde el Mesozoíco tardío, son utilizadas para definir la cronología de los episodios que condujeron a la formación de los actuales Océanos Australes.

Descripción: En esta tesis se analiza la aproximación numérica de problemas singularmente perturbados de reacción–difusión, con y sin convección. En primer lugar, consideramos la aproximación por elementos finitos bilineales utilizando mallas adaptadas a priori para problemas modelos. En este caso, obtenemos resultados de superconvergencia, es decir, la diferencia entre la solución dada por el método de elementos finitos y la interpolada de Lagrange de la solución exacta es de mayor orden que el error numérico, en una norma apropiada. Las estimaciones obtenidas son casi óptimas respecto al orden en función del número de nodos N, y con constantes que dependen débilmente del parámetro de perturbación ε. Es decir, salvo factores logarítmicos, las constantes son independientes de ε y el orden es el mismo que se obtiene utilizando mallas uniformes en problemas con soluciones suaves. Como consecuencia de estos resultados, obtenemos estimaciones casi óptimas del error en norma L2, mejorando de estamanera resultados conocidos anteriormente. Para problemas más generales, para obtener mallas adaptadas adecuadamente es necesario usar estimadores a posteriori. En la última parte de esta tesis, construimos y analizamos este tipo de estimador de error para un problema de convección-reacción-difusión y presentamos unmétodo de refinamiento anisotrópico basado en este estimador de error a posteriori.

Descripción: El desarrollo perinatal representa un período crítico en la vida de un individuocaracterizado por una sensibilidad extrema a experiencias e interacciones con el medioambiente que originan efectos duraderos, y muchas veces permanentes, sobre la estructuray función del cerebro. La calidad del período embrionario como la calidad del ambiente yexperiencias postnatales tempranas tienen una enorme influencia sobre el desarrolloemocional y cognitivo con consecuencias que se extienden durante toda la vida. Una de las causas más difundidas entre la población mundial y con consecuenciasmás deletéreas sobre el desarrollo y la plasticidad neuronal es la que proviene de ladesnutrición o la malnutrición. Esta provoca, según su severidad, desde problemas yretardos en el aprendizaje hasta retrasos mentales con profundas consecuencias en lasociabilidad del sujeto a lo largo de toda su vida. Los modelos en roedores han demostrado ser útiles ya que se observaronalteraciones neuroanatómicas comparables y deficiencias similares en las capacidades deaprendizaje y memoria(1). Estas evidencias convergentes sugieren una relación causalentre malnutrición proteica y alteraciones neurofisiológicas. Sin embargo, y pese a los avances realizados al respecto en los últimos años,diversos interrogantes permanecen aún sin respuesta. Algunas de estas cuestiones abiertasse refieren a cuales son las alteraciones conductuales y cognitivas afectadas por lamalnutrición en la etapa perinatal, si las deficiencias observadas presentan dimorfismosexual, cuáles son los mecanismos moleculares que median los efectos permanentes de lamalnutrición en etapas tempranas de la vida y si los efectos observados son transmitidos alas siguientes generaciones que no hayan sido sometidas a esta adversidad perinatal. En este trabajo de tesis nos centramos en el establecimiento de un modelo demalnutrición proteica perinatal en ratones, estudiando el efecto sobre el comportamiento delas crías a diferentes edades, con el fin de dilucidar si las diferencias encontradas en labibliografía se debían a la edad a la que se realizaron los estudios. Además se trabajó concrías machos y hembras con el objeto de identificar posibles efectos diferenciales de ladieta de acuerdo al sexo. Nuestra evaluación inicial del desarrollo morfológico y neurológico de las críasreveló un claro retraso en el grupo cuyas madres sufrieron una reducción del 55% en elcontenido proteico de la dieta. Estas últimas sufrieron una alteración en su comportamientotanto en lo referido al cuidado dedicado a las crías como en la presencia de uncomportamiento de tipo ansioso. Este comportamiento de tipo ansioso también fue observado en las crías mediantelos test de laberinto elevado en cruz y de campo abierto, junto con una menor motivaciónexploratoria revelada por el test de escape de la jaula. En relación a las capacidades cognitivas de las crías se encontró un defecto en lamemoria declarativa de largo término y la memoria espacial de corto término solamente enmachos. En hembras se evidenció además un mayor componente de comportamiento tipodepresivo, que no fue observado en machos. Con el fin de develar las bases moleculares de los defectos observados, realizamosun análisis de la expresión de génica y de los niveles de modificaciones epigenéticas, adiferentes edades en ambos sexos. Encontrando una disminución en la cantidad demensajero de la neurotrofina BDNF y una acetilación diferencial global de las histonas 3 y 4. Este hallazgo resulta interesante debido a que está ampliamente documentado que BDNF es fundamental para el desarrollo del sistema nervioso y cumple diversos roles enprocesos de aprendizaje y memoria. Además se ha visto que su expresión se encontrabadisminuida en ratones que sufrieron de un estrés perinatal (como períodos de separaciónmaterna), y en modelos de enfermedades neurológicas y psiquiátricas. Por otro lado, laexpresión de este gen es finamente regulada a través de diversas modificacionesepigenéticas por lo que es sensible a factores ambientales. En nuestro modelo, laacetilación anormal observada en ratones malnutridos perinatalmente podría producir undesbalance general en la expresión de diversos genes que podría llevar a una menorexpresión de BDNF. Ambas alteraciones moleculares observadas podrían formar parte delos mecanismos moleculares causantes de las deficiencias cognitivas y conductualesobservados. Finalmente, los diferentes niveles de acetilación observados, posibilitarían laherencia de las diferencias observadas a una generación sucesiva que nunca fue expuesta aeste tipo de malnutrición. Un estudio preliminar realizado a partir de la descendencia deratones que sufrieron de una malnutrición hipoproteica perinatal, mostró una tendenciahacia un retraso en el desarrollo de estas crías y a una alteración en la conductamotivacional, tal como se había visto en sus progenitores. En resumen, los resultados aquí presentados demostraron que una malnutriciónmaterna durante una etapa perinatal afecta la maduración del sistema nervioso, provocandocambios que perduran a lo largo de la vida, más allá del tiempo de exposición a la dietadeficiente. Estos cambios se pueden observar a nivel molecular y en un amplio rango decomportamientos. Cabe destacar también que el trabajo de la presente tesis permitióestablecer dicho modelo de estrés perinatal, el cual servirá de base para futuros estudios enel laboratorio y que podrá utilizarse para generar y responder numerosas preguntas.

Descripción: El pasaje de plantines de Eucalyptus de invernaderos comerciales a campo representa una etapa crítica donde la tolerancia a condiciones ambientales adversas impacta sobre el futuro potencial de la plantación forestal. Inocular bacterias beneficiosas (PGPB) es una estrategia para favorecer la tolerancia al estrés abiótico, pero su uso en forestales es escaso debido a las dificultades que presenta su aplicación. Un recurso cada vez más empleado en forestación es utilizar polímeros hidrofílicos superabsorbentes (SAPs) para mitigar el déficit hídrico durante el despegue. Esta tesis desarrolla como herramienta biotecnológica la inoculación de bacterias en el entorno radicular de plantines de eucalipto utilizando como vehículo un SAP fabricado por nuestro laboratorio. Para ello se seleccionaron cepas bacterianas promisorias; se realizaron ensayos de tolerancia a estrés abiótico a diferentes escalas con las cepas seleccionadas y se realizó una caracterización hidráulica de los plantines. Los resultados mostraron que la inoculación con dos Pseudomonas promueve el crecimiento de los eucaliptos en condiciones óptimas y mejora la recuperación del área foliar, la regulación estomática y el contenido de agua luego de un período de sequía. Los efectos benéficos no solo fueron consistentes entre los distintos ensayos sino que se logró observar sinergismo al inocular simultáneamente ambas cepas seleccionadas. Los ensayos de reobtención del inóculo mostraron que las bacterias permanecen viables durante el período crítico de implantación y que la matriz del SAP es funcional para la potencial aplicación de PGPB a campo.

Descripción: El carpincho es un recurso natural que no esta sometido a planes de manejo sustentable en Argentina. Actualmente, este roedor es catalogado como “Especie Potencialmente Vulnerable” y, aunque seencuentra protegido en ocho Parques Nacionales y no figura en los Apéndices I o II de CITES, la intensaexplotación de este caviomorfo en los últimos 20 años haría suponer que se debería encontrar bajo algunaforma de amenaza de extinción o en proceso de regresión numérica. El enfoque general de esta Tesis haestado dirigido fundamentalmente a contribuir al desarrollo de una estrategia de manejo sustentable delcarpinchoen Este trabajose desarrollóen el Criaderode Carpinchos,ubicado en la EEA. Delta del Paraná —INTA (Otamendi, Partido de Campana, Provinda de Buenos Aires, Argentina). Laevaluación de los sistemas de manejo desarrollados en el Criadero puso de manifiesto que el Módulo 3 (corrales de 30 x 10 m, divididos en sectores de reproducción y parideras) fue el mejor para la fasereproductiva, incorporando la práctica de “Destete temporario”. Con este manejo disminuyeron losconflictos sociales entre las hembras, por tener más espacio para que los subordinados huyan y no sellegue a la agresión, y por mantenerse la identidad grupal; hubo una menor mortandad al destete dado quese realiza con crías mayores disminuyendo la duración del período entre partos. Se calculó una eficienciareproductiva de 6,5 crías destetadas vivas / año X madre, de esta manera se alcanzan los parámetrosreproductivos necesarios para utilizar el potencial productivo del carpincho en cautiverio. En cuanto a laalimentación, se pone de relieve el gran potencial zootécnico de esta especie para su crianza en cautiverio,siendo las respuestas observadas superiores a los valores encontrados en la literatura mundial paracarpinchos en vida silvestre. Se evaluaron las implicancias biológicas de la selección del alimento por esteherbívoro monogástrico, concluyéndose que habría una macro-selección del lugar de pastoreo, previo alrefuerzo dado por el valor nutritivo del alimento finalmente consumido. La primer reacción ante unalimento es de macro-reacción ante la forma (arquitectura) vegetal. La segunda reacción es de calidadintrínseca del alimento, determinada por la relación Fibra:Proteina y la concentración de Vitamina C. Poreso los carpinchos distinguen entre parches de pastoreo, y dentro de ellos seleccionan las especiesvegetales por la calidad nutritiva de cada una. Los mecanismos de reconocimiento posteriores a laingestión del alimento se fundamentan en sus resultados metabólicos, que estan relacionadosestrechamente con las características anatómicas y fisiológicas del animal; y a la vez, se vinculan con lamaximización de la ingesta de energía digestible y la metabolización eficiente de los otros nutrientes. Laexperiencia previa influida sobre las preferencias y los patrones de alimentación diaria. En el caso delcarpincho, la economía del nitrógeno parece ser la mayor restricción en la selección de la dieta. Asociado aello, aparecen mecanismos comportamentales de economia de nitrógeno: la cecotrofia. Hemos concluidoque la cecotrofia en el carpincho es facultativa, produciéndose en respuesta a un bajo aporte dictado deproteínas. Asimismo, se evaluó la distribución geográfica presente de poblaciones silvestres de este roedor,ofreciendo una interpretación biogeográfica y productiva, evaluando los factores que pudieran influirsobre su distribución actual, así como sobre la permanencia de las poblaciones actuales y futuras, y lapotencialidad de distintas zonas de nuestro pais para implementar distintos sistemas de manejoproductivos sustentables, de nuestros resultados no puede señalarse a la caza comercial controlada y a lacría en cautiverio como estrategias antagónicas e incompatibles. Así, proponemos un modelo integradopara el manejo sustentable del carpincho en la Argentina, donde convivan las alternativas actuales deproducción y un sistema de fiscalización centrado en los intereses regionales, con la finalidad de dar unpaso al frente en el mantenimiento de las poblaciones naturales de este roedor, aún no amenazado a escalaglobal, pero cuya sobreexplotación podría conducir a un agotamiento del recurso, conllevando su tantenida extinción.

Descripción: Fil: Pellegrotti, Jesica Vanesa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: En la actualidad, la manipulación robótica diestra y autónoma en ambientes desconocidos aún nos eluye. Niños de pocos años pueden levantar y manipular objetos no familiares con mayor destreza que los robots actuales. En consecuencia, los investigadores en robótica coinciden cada vez más que ideas de la biología pueden resultar beneficiosas en el diseño de mejores modelos para los robots. En este trabajo de tesis se presentan un modelo de control y algoritmos para cada una de las fases de manipulación, que están fuertemente inspirados en estudios neurofisiológicos sobre manipulación diestra humana. El control de las fuerzas de presa y carga en cada fase es dirigido por señales que simulan las respuestas aferentes humanas durante un proceso de manipulación. El objetivo del modelo es manipular objetos desconocidos con estabilidad de la presa y comportamiento similar al humano. Se utilizaron elementos finitos para simular computacionalmente dos dedos opuestos que toman objetos desconocidos, y un dedo presionando objetos. Los dos componentes esenciales del modelo de control propuesto fueron simulados y testeados exitosamente: la estimación del coeficiente de fricción entre el objeto y los dedos, y la detección del deslizamiento incipiente.

Descripción: En este trabajo hemos estudiado los mapas cuánticos y semiclásicos de sistemassometidos a perturbaciones periódicas y acoplados a un mecanismo disipativo. Enparticular analizamos dos sistemas: 1) un oscilador armónico cuántico acoplado a unbaño térmico arbitrario y perturbado periódicamente con un potencial dependientede la coordenada y 2) un spin acoplado a un campo magnético esterno e inmersoen un reservorio de osciladores y al cual se le aplicó periódicamente una rotacióninstantánea. Para el primer sistema empleamos la representación semiclásica de Wigner yconstruimos el mapa cuántico de la función de Wigner, siguiendo el procedimientode Graham y Tél, y el mapa semiclásico de los momentos. En particular estudiamos el mapa en el caso en que se aplica una perturbaciónarmónica. Se investigó el mapa semiclásico de los primeros y segundos momentos,que describen completamente al problema en el caso en que la distribución inicialdel oscilador sea una función de Gauss. Del análisis de la estabilidad del puntofijo vimos que si la intensidad de la pulsación supera cierto valor crítico el puntofijo se vuelve hiperbólico pero sus coordenadas dejan de pertenecer al espacio delos momentos. Es decir que si la pulsación es suficientemente fuerte el sistema noalcanza un equilibrio. El valor critico para el caso AC es menor que para el caso AOR. Cuando la intensidad de la perturbación toma el valor crítico la distribuciónde equilibrio resulta ser uniforme. Cuando es menor, el estado de equilibrio engeneral es diferente para los modelos AOR y AC y corresponde a una gasussianacentrada en el origen del espacio (q, p). Cuando la frecuencia de la pulsación es muybaja, o es un múltiplo de la frecuencia propia del oscilador bajo la influencia delentorno disipativo, el punto fijo no pierde su estabilidad para ningún valor de laintensidad de la pulsación. Luego analizamos el mapa cuántico, a través del propagador de la función de Wigner, en los límites de acoplamiento débil, clásico, y asintótico para una perturbacióngeneral. Vimos que si la interacción es muy débil el modelo de acoplamientono se distingue en el mapa. En el límite clásico encontramos que los mapas AOR y AC no coinciden y es el modelo AC el que describe correctamente, en este limite, alproblema clásico. En el límite asintótico los propagadores AOR y AC se distinguenúnicamente en el valor de las dispersiones. El segundo sistema, a diferencia del anterior, tiene la particularidad de ser dedimensión finita. Esto permite construir un mapa semiclásico totalmete equivalenteal mapa cuántico. Dado que, en este caso, la perturbación es una rotación, no es posible contrarrestarlos efectos del mecanismo disipativo y el sistema siempre alcanza un equilibrio. El mapa semiclásico fue analizado para los casos particulares de spin 1 y 1/2 através de las propiedades de sus coeficientes de decaimiento y puntos fijos. Ademáspara spin 1 realizamos un análisis perturbativo del mapa disipativo tomando unainteracción mezcla de AOR y AC y calculamos la corrección de primer orden enlos autovalores cuando la interacción es muy cercana a AOR o muy cercana a AC. Vimos que para temperatura alta la corrección que sufre el sistema AC es cuatroveces mayor que el AOR. Para el sistema con spin 1 la diferencia entre los acoplamientos es muy marcadaal aplicar una rotación con eje paralelo al campo externo. Tanto la dinámica comoel punto fijo del mapa AOR no se ven afectados por esta rotación. En cambio, en elcaso AC la dinámica depende del ángulo de la rotación a través de los coeficientesde decaimiento del mapa. Cuando la temperatura es muy baja o el acoplamiento esmuy débil esta diferencia se hace inapreciable. Los puntos fijos de los mapas AOR y AC son en general diferentes salvo cuando la temperatura es elevada y la frecuenciade la pulsación es muy baja o cuando la interacción es muy débil. En el caso de spin 1/2 realizamos el mismo análisis del mapa semiclásico y agregamosel estudio del mapa escalar generado al aplicar la perturbación a un invariantesemiclásico del mapa disipativo. El mapa semiclásico parece ser menos sensibleal modelo de la interacción en este caso que para spin 1. Los coeficientes de decaimientomuestran diferencias cuando la rotación aplicada no es paralela al campoexterno. En este caso la relajación de los sistemas AOR y AC depende del ángulode la rotación. Aunque la forma en que varían los coeficientes de decaimiento essimilar para ambos modelos se observa una mayor amplitud en el caso AC. En elanálisis de los puntos de equilibrio observamos que aparece alguna diferencia entrelos acoplamientos cuando se perturba al sistema en una dirección ni paralelani perpendicular al campo externo. Además, si el límite de acoplamiento débil esestricto los mapas coinciden en todos los casos. El mapa escalar si presenta un comportamientomuy diferente según la interacción. En el caso AOR el mapa alcanzaun valor constante después de un transitorio mientras que el régimen asintótico delmapa AC es oscilatorio. Además, el valor asintótico promedio del mapa, que enambos casos depende del ángulo de la rotación aplicada, es de mayor magnitud enel caso AC. En los dos sistemas estudiados encontramos que el modelo de interacción resultairrelevante solamente en el límite estricto de acoplamiento débil. Fuera de este límite, vemos que los mapas semiclásicos muestran una dinámicadiferente para los casos AOR y AC. Los puntos de equilibrio del sistema del spin sonindependientes del modelo en el límite clásico si la frecuencia de la pulsación es muybaja. Bajo estas condiciones, la única señal del tipo de interacción que encontramosen el propagador del sistema del oscilador es un corrimiento de la frecuencia naturalque afecta a las dispersiones. En el mapa escalar estudiado en el caso de spin 1/2siempre encontramos un comportamiento diferente para AOR y AC, ya que en éstevemos reflejada la simetría de cada modelo. En los casos en que los acoplamiemtos se distinguen, el AC muestra una dependenciamás importante con los parámetros del problema. Ya sea con la intensidadde la pulsación o, en el caso de spin 1 ante una perturbación en la interacción. La diferencia fundamental entre los dos modelos de acoplamiento radica en laaparición de una simetría en el sistema no pulsado bajo el marco AOR. Para elsistema con spin, en el marco AOR, el sistema recupera la simetría de rotación propiadel spin acoplado al campo magnético externo y libre del mecanismo disipativo. Conel oscilador sucede algo equivalente. La simetría recuperada en este caso es la deloscilador armónico, que también se traduce en el hecho de que el mapa semiclásico delos primeros momentos adecuadamente adimensionalizados resulta ser proporcionala una matriz de rotación. En el caso del oscilador, el sistema posee un análogo clásico. Más aún, estaclase de mapa cuántico es muchas veces construído con el objeto de comparar lassituaciones clásica y cuántica. Por lo tanto, dado que el límite clásico en el marco ACreproduce el sistema clásico, éste parece ser el modelo adecuado para introducir ladisipación cuántica. En el caso del spin, el sistema representa situaciones de origenpuramente cuántico y entonces no encontramos un argumento tan claro como paraadoptar uno u otro modelo. Sin embargo la recuperación de la simetría del sistemalibre es un aspecto a tener en cuenta en cada aplicación concreta, es decir, la simetríadel problema real que se quiere describir a través de este formalismo puede indicarcuál de los dos acoplamientos es el más apropiado.

Descripción: Fil: López, Micaela Valeria. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Las células granulares en desarrollo en el giro dentado adulto (nCGs) atraviesan unperiodo crítico de exacerbada excitabilidad y plasticidad sináptica antes de alcanzar lamadurez. Se desconoce el impacto que estas nuevas unidades de procesamiento tienenen el circuito preexistente del giro dentado. En este trabajo combinamos la utilización deoptogenética, electrofisiología en rodajas y quemogenética in vivo para activar nCGs dediferentes edades y analizar el reclutamiento de sus redes postsinápticas. Observamosque nCGs inmaduras (4 semanas de edad) reclutan eficientemente blancos distales en elárea CA3 pero fallan en activar interneuronas proximales responsables de la inhibiciónfeedback. A medida que atraviesan el proceso de maduración, las nCGs comienzan aactivar circuitos de retroalimentación GABAérgica controlando el disparo de CGs vecinas,un mecanismo que podría promover la codificación dispersa de inputs. Dicho controlinhibitorio impacta sólo débilmente en poblaciones de nCGs jóvenes. Simulacionescomputacionales revelan que este retraso en el acoplamiento de las nCGs a los circuitosde retroalimentación negativa podría tener un rol crucial con el objetivo de lograr unarepresentación dispersa de inputs nuevos en el giro dentado.

Descripción: El mapeo por asociación es una herramienta poderosa que permite la identificación de loci cuya contribución explica parte de la variación fenotípica observada. En general, los marcadores utilizados en estos estudios son los Polimorfismos de Nucleótido Simple (SNPs, Single Nucleotide Polymorphisms) y los indels (eventos de inserción, insertion/deletion). Los objetivos de este trabajo comprendieron el estudio de la diversidad nucleotídica y el alcance del desequilibrio de ligamiento (DL) en girasol cultivado, y el diseño de una estrategia de mapeo por asociación para la resistencia a la Podredumbre Húmeda del Capítulo (PHC), causada por Sclerotinia sclerotiorum. La frecuencia de SNPs (1/61) y la diversidad nucleotídica (θ=0,0067) se determinaron sobre un panel de 31 genes y 19 líneas endocriadas de girasol. La frecuencia de SNPs en conjunto con un alcance del DL hasta 100 kb (r2~0,1) permitieron diseñar un estudio de asociación a través de la estrategia de genotipificación de genes candidatos. Un total de 30 genes candidatos fueron seleccionados a partir de: (1) el análisis de los perfiles transcripcionales de un genotipo de Brassica napus resistente a S. sclerotiorum, (2) una colección de transcriptos de expresión diferencial de una línea de girasol moderadamente resistente desafiada con S. sclerotiorum y (3) genes descriptos en literatura como partícipes en los procesos de defensa frente a PHC. La elección, caracterización y genotipificación de genes candidatos implicó la generación de herramientas para la selección de los mismos y la optimización de técnicas de genotipificación de SNPs a gran escala. La detección de moléculas heterodúplex mediante: (1) corte con la enzima endonucleasa CEL1 (CEL1CH) y (2) cromatografía líquida de alto rendimiento en condiciones de desnaturalización parcial (dHPLC), demostraron ser técnicas robustas y versátiles para aumentar el número de loci e individuos a incluir en los estudios de mapeo por asociación. Un total de 16 genes se genotipificaron exitosamente en la población de mapeo por asociación constituida por 134 accesos del Banco Activo de Girasol de la Estación Experimental Agropecuaria (EEA) INTA Manfredi. El análisis estadístico de asociación incluyó el uso de modelos lineales mixtos que corrigieron los problemas de estructuración y las relaciones de parentesco entre los individuos de la población de mapeo. Un alelo del gen RhoBP_B exhibió una asociación estadísticamente significativa con una menor incidencia de PHC (pp<0,05). Los resultados obtenidos demuestran que es posible encontrar alelos útiles implicados en caracteres complejos a través de los estudios de mapeo por asociación en girasol.

Descripción: El brotado pre-cosecha (BPC)es uno de los principales problemasagronómicos del sorgo granífero (Sorghum bicolor) en Argentina. En estetrabajo se construyó un mapa de ligamiento analizando la segregación de 112 marcadores moleculares (RFLPs, RAPDs y AFLPs) en una población F2 de 93 individuos generada por cruzamiento entre una línea resistente y unasusceptible al BPC. Los marcadores se distribuyeron en 14 grupos deligamiento, cubriendo 950 cM. Por medio del mapeo por intervalos, selocalizaron 2 regiones genómicas (QTLs) con importantes efectos sobre el BPC. Los QTLs detectados presentaron comportamientos atribuibles al degenes mayores ya que explicaron conjuntamente el 83% de la variaciónfenotípica (R²),mientras que cada uno en forma individual, presentó valoresde R² de 53%, con valores de LOD de 8,77 y 4,39 respectivamente. Ladiferencia entre la suma de los R² individuales y el R² conjunto se explicó porla presencia de efectos epistaticos. Esto resultados fueron corroborados porel análisis de la varianza de un factor, en el cual los 2 marcadoresflanqueantes de la mas probable posición de cada QTL, mostraron valoressignificativos para la prueba de F. Los marcadores localizadosestrechamente ligados a los QTLs son potencialmente utilizables enmejoramiento vegetal.

Descripción: La hormona luteinizante (LH) regula las funciones de las células de Leydig, principalmente la esteroidogénesis, a través de un mecanismo que incluye la activación de PKA y ERK1/2. Las MAPK fosfatasas (MKPs, MAP Kinase Phosphatase) desfosforilan específicamente a las MAPKs (MAP Kinase) y, consecuentemente, regulan procesos fisiológicos dependientes de MAPK. En este trabajo se demostró que, en células de Leydig MA-10, la activación del receptor de LH con gonadotrofina coriónica humana (hCG) o el aumento de AMPc intracelular provocan la acumulación de MKP-2 y su translocación al núcleo. La acumulación es consecuencia de la activación transcripcional y de la estabilización de la proteína por modificaciones posttraduccionales. El bloqueo de la expresión de MKP-2 mediante un shARN – desarrollado en el marco de este trabajo– aumentó la fosforilación de ERK1/2 inducida por AMPc, particularmente a tiempos prolongados de estimulación. El bloqueo de la expresión de MKP-2 también aumentó la actividad del promotor y los niveles del ARNm correspondiente al gen CYP11A1, que codifica para una enzima esteroidogénica y se induce por LH/hCG vía ERK1/2. Se concluye que LH/hCG regula estrictamente la expresión de MKP-2 para controlar la fase terminal de actividad de ERK1/2 y “apagar” la expresión de genes inducidos por LH vía ERK1/2.

Descripción: Fil: Viaggi, Mabel Esther. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: La leucemia mieloide crónica (LMC) se caracteriza por el rearreglo BCR-ABL1 sin embargo no se conocen losfactores genéticosque pueden influir en el desarrollo de la enfermedad y en la respuesta al tratamiento. El objetivo de este trabajo fue evaluar diversos polimorfismos genéticos a fin de identificar nuevos marcadores de susceptibilidad y de respuesta farmacogenética en LMC. Se evaluaron 23 polimorfismos en los genes CYP1A1, CYP1B1, ABCB1, ABCC3, hOCT1, NQO2, GSTP1,GSTM1, GSTT1 y TP53en 141 pacientes con LMC bajo tratamiento con inhibidores de tirosina kinasas (ITKs). Se demostró que la combinación de los genotipos GSTP1-GG con GSTM1-nulo oGSTT1-nulo son factores de riesgo para la enfermedad y que el polimorfismo en TP53 es un factor protector. Por otro lado, se encontróque los polimorfismos en los genes NQO2, ABCB1y el haplotipo de NQO2, se asociaron con mal pronóstico ycon falta de respuesta a los ITKs.Además, los pacientes con 2 o más copias de GSTM1 mostraron peor respuesta al tratamiento.Por último, se determinó unscore genético estableciendo que los portadores de 3-4genotipos de riesgo de los genes CYP1B1, TP53, NQ02 y GSTP1 tienen significativamente menor sobrevida libre de eventos. A su vez, los portadores de 1-2genotipos de riesgo de los genesABCB1y GSTP1 tienen mayor riesgo de fallar al tratamiento.En conclusión, los resultados obtenidos sugieren que los polimorfismos evaluados son co-factores de susceptibilidad al desarrollo de LMC y además son biomarcadores con valor pronóstico y predictivo de la eficacia del tratamiento con ITKs.

Descripción: Ipomoea batatas L. Lam, es una especie de importancia agrícola, que se cultiva en más de 100 países con una producción anual de 120 millones de toneladas. Esta especie presenta una raíz engrosada denominada batata que constituye un alimento básico en muchos países subdesarrollados. En la piel y en la pulpa de la raíz engrosada puede observarse una amplia variedad de colores. Estos colores se deben a la presencia de dos clases de pigmentos: las antocianinas (flavonoides) y los carotenoides. Estos pigmentos además de jugar un rol central en la elección por parte del consumidor, presentan importantes beneficios para la salud, principalmente por actuar como antioxidantes. Muchos de ellos han sido caracterizados por sus propiedades antimutagénicos y anticancerígenos El desarrollo de marcadores moleculares asociados a estos genes de interés puede aportar una herramienta eficaz a los programas de mejoramiento, en particular hacia aquellos que están focalizados en la obtención de clones con propiedades funcionales, como el alto contenido de pigmentos. El objetivo principal de este trabajo de tesis fue desarrollar marcadores de Genes Candidatos relacionados con las síntesis de pigmentos para su localización en un mapa de ligamiento estructurado con marcadores neutros: SSR y AFLP Este trabajo contribuye al conocimiento de la estructura y secuencia de los genes de interés, la herencia del genoma y la búsqueda de regiones genómicas relacionadas con la síntesis de pigmentos. El mismo implicó el desarrollo de una población de mapeo a partir de padres segregantes para el carácter de interés, la determinación de la herencia, la localización de los marcadores neutros, el diseño de marcadores de genes candidatos de las rutas de síntesis de los principales pigmentos, el desarrollo de un mapa de ligamiento, la caracterización fenotípica de la población y la búsqueda de regiones genómicas asociadas a dicha variación.

Descripción: La hemofiliaA (HA)es una enfermedad hemorrágica hereditaria, ligada al sexo, causadapor deficiencia del factor VIIIde coagulación (FVIII). La ruta preferida para la provisión dedatos para diagnóstico molecular es la detección directa de mutaciones. Entre lasmutaciones que afectan al gen del FVIII, la inversión del intrón 22 (inv22) constituye lacausa de casi la mitad de las HA severas (SHA). Mediante análisis de Southern blotfueron estudiadas 47 familias Argentinas con SHA. En cercano acuerdo a lo reportadoseries internacionales, 19 de ellas (40%) resultaron informativas para la Inv22 y pudoproveerse diagnóstico molecular por el método directo. Dentro de éstas, 14 (79%)resultaron Inv22 tipo distal y las restantes 5 (21%), proximal. No fueron encontradassignificativas asociaciones entre la presencia o no de la Inv22 en SHA, y el origen de laenfermedad (esporádica o familiar), ni tampoco con la propensión o no a desarrollaranticuerpo inhibidor neutralizante contra el FVIII terapéutico. El camino alternativo para el diagnóstico es por vía indirecta usando polimorfismos ligados ala enfermedad. Entre los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)ubicados dentro del gen del FVIII, el marcador Xbal A del intrón 22 a pesar de proveer unaalta informatividad en los distintos ganos étnicos analizados, fue casi excluido de la rutinadiagnóstica por la lentitud y laboriosidad de su detección. Aquí se describen dos métodosrápidos, no-radioactivos, basados en PCR de larga distancia (LDPCR), para genotipificacióndel RFLP Xbal A. Los amplimeros de 6,6 y 6,9 kb incluyen el sitio polimórfico y un sitioconstante de Xbal que provee control de digestión. La especificidad del método fuedesafiada en experimentos a ciegas de muestras previamente genotipificadas por Southernblot, obteniéndose una perfecta correlación entre ambos métodos. Mediante este método, 53cromosomas X de la población Argentina general fueron genotipificados para Xbal A, lo quepermitió proyectar una informatividad de aproximadamente el 47%. Los estudios deasociaciones alélicas entre Xbal A (X) y el polimorfismo Bc/l (B) del intrón 18 del gen del FVIII, determinaron un alto, pero no-completo desequilibrio de ligamiento entre losmarcadores, proyectando una informatividad combinada (X+B) del 55%. A 737 bp rio abajo del RFLP Xbal, fue localizado y caracterizado un nuevo polimorfismobialélico, de cambio de nucleótido que afecta el sitio de reconocimiento de la enzima Mspl (CCg/aG). La genotipificación especifica del RFLP Mspl A se realiza utilizando la LD PCRespecífica para Xbal A como primera vuelta. seguida por una PCR anidada de 176 bp queincluye al sitio polimórfico y uno constante de Mspl para proveer control de digestión. Suanálisis en las poblaciones nomiales Argentina y Británica permitió estimar unaheterocigocidad de 49 y 46%, respectivamente. A pesar de su proximidad física y sudesequilibrio de ligamiento, X y M proyectan una informatividad conjunta del 62% parapoblación Argentina y 59% para la Británica. Ambos RFLPs (X y M) están incluídos en unaregión de 9,5 kb dentro del intrón 22 del gen del FVIII(int22h-1), que se encuentra repetidapor lo menos 2 veces fuera del gen del FVIII, también sobre Xq28 (int22h-2 y -3). Parainvestigar los sitios correspondientes de X y M sobre los homólogos extragénicos fuerondiseñados abordajes específicos similares a aquellos usados para los sitios intragénicos. Lossitios Mspl extragénicos (B y C) resultaron polimórficos en población Argentina y Británicaaunque con frecuencias del alelo [+] mucho menores a las intragénicas. La Inv22 es originada por un evento de entrecruzamiento recíproco intracromosómico porrecombinación homóloga entre las secuencias int22h descriptas resultando en la interrupcióninactivante del gen del FVIII en su intrón 22. Debido a (1) que los marcadores X y Mubicados dentro de int22h permiten mediante sus frecuencias alélicas diferenciar las copiasintra de las extragénicas y (2) que en el cromosoma X de varones de la población normalpodemos estimar el estado de estos marcadores antes del evento y en los hemofílicos conla Inv22 podemos analizar el estado de estos marcadores después del evento; se diseñouna estrategia para recabar datos del mecanismo molecular que origina la Inv22 comomodelo de entrecruzamiento recíproco en meiosis humanas. La aplicación del métodoplanteando nueve hipótesis de posibles intermediarios moleculares de la Inv22 asociadas ala predicción de resultados numéricos utilizando las estimaciones sobre población devarones normales y su comparación con los datos obtenidos en el grupo de afectados con la Inv22, permitió determinar que el evento molecular de recombinación meiótica está acopladoa la conversión génica del marcador Xbal, con la secuencia extragénica como dadora de lainformación. El mismo análisis sobre Mspl si bien proyecta resultados similares, no permitedeterminado con significación estadística. El aumento de la población hemofílica para laobtención de resultados más precisos además de los estudios de mapeo de puntos calientespara rupturas meióticas de doble cadena dentro de las secuencias int22h permitirá laelucidación específica del mecanismo de la Inv22 como modelo de recombinación homólogaen meiosis humanas.

Descripción: Fil: Guerrero, Ariel Heriberto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: En este trabajo se analizan procesos geológicos, geodinámicos y geomagnéticos previos a la apertura del océano Atlántico. En consonancia con este marco de análisis global se inserta un estudio paleomagnético de litologías que pertenecen a la cuenca liásica del Oeste del Chubut. Con la finalidad de valorar este estudio, se efectuó previamente un análisis estratigráfico y estructural de un sector del extremo septentrional de la Sierra de Tecka. De esta zona se recolectaron muestras para el análisis paleomagnético de dos perfiles que se encuentran separados por aproximadamente 1 km (Lat.= 43°1´, Long.= 70°44´). El estudio se completó con el análisis de otro perfil (Lat.= 43°57´, Long.= 69°51´) que se halla en la región de Pampa de Agnia. Las magnetizaciones remanentes aisladas en los tres perfiles, son pretectónicas. El polo paleomagnético (PP) obtenido (SAJ5, Lat.= 74.3° S, Long.= 131.6° E, A95= 5, N= 46, k= 16.4, R= 43.8), se alinea secuencialmente junto con otros PP jurásicos de Sudamérica, sugiriendo un movimiento recurrente de este continente. Mediante tres reconstrucciones diferentes del Gondwana Occidental (GO: Sudamérica, Africa y Madagascar) se comparó a SAJ5 con PP jurásicos de Africa, compatibilizando datos paleomagnéticos con datos geológicos. Se extendió luego el análisis al resto de los continentes gondwánicos para un lapso que se extiende desde el Carbonífero superior al Jurásico superior. Se observó, tal como lo señalaran otros autores, que para el lapso pérmico superior-triásico inferior el PP promedio del GO no concordaba con el del Gondwana Oriental ( GE: India, Australia y Antártida Oriental) si se comparaban empleando reconstrucciones aceptadas para momentos previos a la ruptura del Gondwana. Se propuso, entonces, una reconstrucción alternativa paleomagneticamente posible para ese lapso. A diferencia de otras propuestas esta reconstrucción es geológicamente plausible. Finalmente, y a partir de la comparación de los polos geomagnéticos virtuales (PGV) obtenidos de las unidades estratigráficas analizadas con otros de diferentes continentes, se efectuó un análisis que permitió sugerir que desde que vivió la última Pangea existe una vinculación del límite manto-núcleo y con la geometría de las reversiones y los comportamientos del campo magnético terrestre (CMT).

Descripción: En esta tesis se investiga la influencia de la capa límite planetaria en la marea atmosférica diaria. Se ha encontrado que hay evidencia observacional consistente de vientos troposféricos diarios de magnitud de cerca de 1 m/s, mientras que los cálculos de mareas dan valores de 10 a 20 cm/s. Esta discrepancia entre la teoría y las observaciones indica que, además de vapor de agua y ozono, hay otras fuentes troposféricas de movimientos diarios de escala continental. En esta tesis se analiza la posibilidad de excitación lineal y nolineal de ondas internas de gravedad por la capa límite planetaria. Un primer mecanismo estudiado es la excitación resonante de ondas internas de gravedad de escala planetaria por la fuerte variación diaria de la estabilidad estática en la capa límite atmosférica. Otra posible zona de generación resonante de ondas es la mesosfera, donde la marea es débilmente nolineal. Se desarrolla un modelo analítico con una tapa rígida sobre la capa límite, como una generalización de.un mecanismo de inestabilidad paramétrica ("inestabilidad trapecio") propuesto por Orlanski. La generalización se hace para ondas de escala global, en un plano f y en el plano β ecuatorial. Las ondas más inestables resultan ser ondas globales con períodos cerca de dos días y un día. Considerando la esfericidad planetaria, los peróodos de duplicación de las ondas inestables son más largos que para el caso sin rotación. Estos tiempos de duplicación son de algunos días, comparables a los tiempos de disipación. Se concluyó que, con una condición de tapa rígida, las inestabilidades son débiles pero probablemente observables. El efecto de la propagación vertical de estas resonancias se analizó usando un modelo numérico. Se construyó un modelo numérico para mareas dependiente del tiempo, a partir del modelo global espectral del Geophysical Fluid Dynamics Laboratory. Para simular la condición de radiación se introdujo una capa absorbente esponjosa en los niveles superiores del modelo, arriba de 60 km de altura. Se realizaron dos experimentos numéricos en un estado básico sin vientos medios zonales y gradientes latitudinales de temperatura. En un primer caso, se forzó el modelo con el calentamiento diario simplificado de Lindzen para vapor de agua y ozono; primero linealmente por 15 días de modelo, y después nolinealmente. En un segundo caso se incluyó en forma simplificada el calentamiento diario por la capa límite atmosférica. Comparando los dos casos lineales, se encontró que el calentamiento de la capa límite produce modificaciones a los campos tropicales de mareas del orden del 20% a todas las alturas. Esto indica que esta fuente produce una excitación significativa de modos de marea que se propagan verticalmente. En los experimentos nolineales se encontró que en la capa límite planetaria y en la mesosfera se producen algunas ondas internas de gravedad secundarias. Los períodos y números de onda coinciden con los resultados analíticos obtenidos para resonancias. Sin embargo, la amplitud de estas ondas.secundarias es extremadamente pequeña. Se concluyó que la excitación resonante de ondas de marea no es un proceso cuantitativamente importante. El segundo mecanismo estudiado en esta tesis es la generación directa de mareas por calentamiento en la capa limite atmosférica. Se realizó una estimación cuantitativa del calentamiento diario en la capa límite en base a datos realistas de rango diario de temperatura. Se expandió la amplitud diaria de temperatura en la superficie terrestre para verano e invierno en números de onda zonales. En un cálculo de marea en que se incluyó la componente del calentamiento en la capa límite que se propaga con el sol, además de los modelos simplificados de Lindzen para ozono y vapor de agua, se encontró que se obtienen vientos troposféricos diarios de magnitud 30 cm/s, en mejor acuerdo con las observaciones. Se encontró además que la contribución del calentamiento de la capa límite a las mareas tropicales en la estratósfera y mesosfera es del orden del 20% de la marea, indicando que esta fuente debe incluirse en modelos detallados de la marea diaria.

Descripción: Los procesos dinámicos en la atmósfera superior pueden describirseefectivamente en términos de mareas y ondas de distintos periodos. Losactuales modelos de aereas para la termósfera superior, recurren confrecuencia a bases de datos del hemisferio norte para su calibración,extrapolando sus resultados al hesisferio sur, y no tienen en cuente lasvariaciones longitudinales. Por otra parte, la presencia de las ondasplanetarias, con estructuras espaciales globales y bajas frecuencias,permitiría explicar las variaciones de corto y mediano plazo que seobservan en la ionósfera. Los objetivos principales del presente trabajoson estudiar los aspectos estacionales y longitudinales de las áreas delviento meridional termosférico y detectar e identificar la posiblepresencia de ondas planetarias, que aún no han sido observadas en latermósfera superior. Finalmente se desarrolla una propuesta teórica nuevapara explicar la posible existencia de estas ondas, recurriendo alformaliseo del GLM (Generalized Mean Lagrangian - Andrews y McIntyre,l978a, b), ya que diversos autores, a traves de las teorias clásicas, hanconsiderado su existencia como poco probable. Para alcanzar estos objetivos se implementa un método para estimarel viento meridional termosférico a partir de datos horarios desondadores ionosféricos, dado que las técnicas más sofisticadas deobservación no poseen la resolución espacial y temporal para lograrlos,en particular debido a su presencia casi nula en el hemisferio sur. Seutiliza a tal fin la altura del máximo de densidad electrónica que actúacoso tratador de la dinámica. Se recurre al Servo-Modelo de la Capa F2 de Risbeth (Rishbeth et al., 1978). Con este método se evalúa el vientomeridional termosférico en forma horaria para una red de sondadoresionosféricos ubicados en latitudes medias en ambos hemisferios, durantetodo 1984. La utilización de bases de datos diarias, con datos cada hora,para todos los días de un año, no tiene antecedentes a nivel de latermósfera. El Capítulo I introduce los conceptos de Aeronomia necesarios paracomprender los procesos físico-químicos del sistema termósfera-ionósfera. Asimismo se presenta el estado actual de las investigaciones de latermosfera superior y la ionósfera, tanto a nivel experimental comoteórico, a fin de indicar los éxitos alcanzados y dificultades que seenfrentan. En el Capitulo II se introduce, a partir del Servo-Modelo de la Capa F2, el modelo de estimación del viento meridional termosférico. Sepresentan sus características y se compara con otros modelos recientes. Se presentan los valores horarios medios mensuales de los vientos y selos compara con resultados de modelos empíricos. Se analiza sucomportamiento estacional, y se discuten los efectos de los procesoselectrodináicos inducidos en el plasma ionosférico por las fluctuacionesdel campo magnético terrestre. En el Capitulo III se presenta la Teoría Clásica de Mareas (Chapman y Lindzen, 1970), asi como los desarrollos posteriores. Seanaliza el comportamiento espectral de los vientos meridionales,comparando entre sí los resultados de las distintas estaciones. Acontinuación se presentan las mareas diurnas, semidiurnas y teridiurnasmensuales medias y se discute su comportamiento estacional, longitudinale interhemisférico, comparandolas con pronósticos de distintos modelosteóricos y empiricos. El Capitulo lV se inicia con el estudio de la variabilidad de lasmareas diurnas y semidiurnas. A partir de estas se detecta uncomportamiento de modulación de las amplitudes de mareas. Del estudio delas frecuencias de modulación, recurriendo a conceptos de no-linealidaddesarrollados reciente-ente, se detereina si las bandas de frecuenciaobtenidas en la termósfera coinciden con las observadas en las regionesinferiores de la atmósfera. Finalmente, se estudian las característicasespaciales de estas ondas, a fin de detereinar si son de orden local oglobal. La confirmación de una existencia global y simultanea confirma laexistencia de ondas de tipo planetario en esta región de la atmósfera. En el Capitulo V se hace una breve reseña de la teória de losprocesos que generan estas ondas en las distintas regiones de laatmósfera. Sin embargo diversos autores habían considerado la existenciade ondas planetarias en la termósfera superior poco probable. Se recurreal formalismo GLM para explicar la propagación de las ondas planetariasen la termósfera superior, cono una causa que permita justificar suexistencia en esta región. Se postulan tres mecanismos posibles quepuedan generar este fenómeno. Por diversos motivos se descartan los dosprimeros. Finalmente se recurre a un modelo numérico para comprobar latercera hipótesis, que postula que perturbaciones tridimensionales de losforzantes pueden generar este fenómeno. Al llevar adelante una serie deexperimentos numéricos bajo condiciones realistas de termósfera secomprueba que este efectivamente es un mecanismo válido. En el Capitulo VI se sintetizan los resultados, originalesalcanzados en el transcurso de estas investigaciones y se proponendiversas areas de desarrollo a partir de estos.

Descripción: Múltiples aplicaciones científicas y tecnológicas requieren, hoy en día, del uso de sensores confiables y altamente sensibles. En este sentido, los nanomateriales han demostrado gran potencial, debido a su gran área específica y sus propiedades físico-químicas diferenciales. En particular, en los últimos años se ha comenzado a desarrollar sensores basados en la combinación de films delgados mesoporosos y nanopartículas metálicas. Estos nanomateriales compuestos integran en un solo sistema la gran área específica, el tamaño altamente controlado de poros y la sencillez de manipulación de los films delgados mesoporosos, con las propiedades ópticas de las nanopartículas metálicas. Esta tesis propone ahondar en el desarrollo de sistemas compuestos formados por films delgados mesoporosos y nanopartículas metálicas que puedan ser utilizados en sensado por Espectroscopía Raman Aumentada por Superficie (SERS). Adicionalmente y a partir del conocimiento de las propiedades SERS en relación a las características de los sistemas, este trabajo busca extender la utilización de esta técnica espectroscópica para la obtención de información sobre las características fisicoquímicas y estructurales de los sistemas compuestos sintetizados. Para ello, en una primera parte se presentan sistemas compuestos sintetizados a partir de films delgados mesoporosos de TiO2 y nanopartículas de Au, combinados en diferentes arquitecturas, para el estudio del efecto de sus propiedades estructurales sobre el sensado por SERS. El análisis se dividió en dos ejes. Por un lado, se estudió el efecto del posicionamiento de las nanopartículas en el material y cómo esto determina las capacidades del sensado de diferentes sondas modelo. Por otro lado, se evaluó la influencia de las características del film delgado mesoporoso sobre la síntesis de nanopartículas y sus consecuencias en el sensado por SERS. Los resultados indican que las características del film (espesor, tamaño y orden de los poros) controlan la cantidad, morfología y distribución de las nanopartículas. Asimismo, se evidencia que las capacidades de sensado en términos de reproducibilidad punto a punto, sensibilidad y límites de detección pueden ser controladas a partir del diseño del nanomaterial compuesto. En la segunda parte, se presentan varias estrategias sintéticas alternativas para la construcción de sensores SERS. En particular, se evaluaron las características estructurales de sistemas formados por nanopartículas de Au y Ag de distintas morfologías combinados con films mesoporosos puros, híbridos y/o consolidados por rayos X de alta intensidad. Los resultados permitieron establecer parámetros sintéticos para aumentar la estabilidad y sensibilidad de los sensores. Finalmente, se presentan sistemas ópticamente sensibles a pH que permiten monitorear los cambios producidos por una reacción modelo. De esta manera, en base al conocimiento adquirido, fue posible sentar las bases para la construcción de sensores SERS que permiten estudiar procesos dinámicos en ambientes confinados.

Descripción: En este trabajo de tesis se presenta la funcionalización de diferentes superficies con materiales compuestos formados por polielectrolitos y surfactantes para el desarrollo de sensores. Como sistema modelo se utilizó poli(alilamina) y dodecilsulfato de sodio. El sistema ha demostrado ser mecánicamente robusto y factible de ser modificado según la función que se le desee conferir. El polielectrolito se ha derivatizado primero con un complejo redox, a fin de explorar su uso como mediador en sensores amperométricos, y posteriormente con lactosa, de manera de incorporar sitios de unión a lectinas. Por otra parte, el surfactante se ha utilizado para la dispersión de nanotubos de carbono cuyas propiedades electrocatalíticas se ejemplifican en la determinación de dopamina. A lo largo de esta tesis se estudió la inmovilización del material compuesto empleando distintas metodologías, tales como adsorción capa por capa, aplicación a partir de una suspensión o a partir de una solución en solvente orgánico, evidenciando la versatilidad de manipulación del sistema. Los resultados alcanzados utilizando el complejo polielectrolito-surfactante y los compuestos derivados de su funcionalización muestran la posibilidad de generar robustos materiales autoensamblados con interesantes propiedades respecto a los procesos de transferencia electrónica, ya sea debido a la presencia de mediadores redox o catalizadores. Otra de las interesantes características del complejo polielectrolito-surfactante es su capacidad de ser aplicado sobre una amplia variedad de superficies empleadas en la construcción de sensores, tales como grafito, oro y silicio. En esta tesis se presentan una descripción detallada del alcance de esta metodología, mostrando su gran versatilidad, lo que allana el camino hacia la construcción de una nueva clase de dispositivos moleculares.

Descripción: En este trabajo se desarrolla la síntesis, caracterización y estudio de las propiedades térmicas y estructurales de compuestos mesogénicos basados en una arquitectura híbrida trifenileno-siloxano-alcano, con el objetivo de obtener materiales que reúnan propiedades de los segmentos trifenileno, como la formación de mesofases columnares, y de los segmentos siloxano, como la baja viscosidad, la baja tendencia a cristalizar y la baja temperatura de transición vítrea. Se prepararon tres grupos de compuestos: monoméricos, oligoméricos y poliméricos. En cada uno de estos grupos la movilidad molecular se ve cada vez más restringida. Todos los compuestos estudiados presentaron mesofases columnares hexagonales, generalmente ordenadas, con temperaturas de fusión desde por debajo de temperatura ambiente hasta 78°C y de isotropización desde 52°C hasta 108°C. Salvo excepciones, no se produce la microsegregación de los distintos tipos de segmento sino que la repulsión estérica entre grupos siloxano los lleva a ubicarse en posiciones alejadas en el espacio. Esta repulsión lleva a efectos drásticos en el comportamiento térmico de isómeros con distinta geometría de sustitución sobre el núcleo aromático, y lleva a la formación de una superestructura en la mesofase de uno de los compuestos estudiados. Uno de los oligómeros sintetizados puede ser alineado mecánicamente, abriendo la posibilidad de obtener cristales líquidos columnares monodominio. Se propone un mecanismo de orientación en el que las interacciones atractivas entre centros trifenileno funcionan como enlaces entre distintos oligómeros, reforzando el comportamiento correlacionado de por sí ya presente en los cristales líquidos.

Descripción: Los materiales magnéticos, y en especial las partículas magnéticas revisten importancia por sus numerosas aplicaciones. Algunas de ellas son: el almacenamiento de datos, el diseño de sensores, el tratamiento de tumores y otros trastornos localizados, la fabricación de transductores mecano-magnéticos en la estimulación mecánica de células y tejidos, la mejora de imágenes de resonancia magnética y la elaboración de materiales autoensamblados en la industria electrónica. Otro tipo de material donde se emplean partículas magnéticas junto con otros componentes son los materiales compuestos. Estos están formados por partículas en una matriz diamagnética. Como matriz puede utilizarse un polímero conductor. Esta característica le confiere al material resultante conductividad eléctrica además de las propiedades magnéticas de las partículas. Se ha empleado frecuentemente polianilina para tal fin. Un aspecto importante es la forma de las partículas magnéticas. Una amplia mayoría de la bibliografía está orientada a la preparación de nanopartículas anisotrópicas, mientras que una proporción mucho menor se centra en la obtención de partículas con morfología de barras, cables o tubos, a pesar de que estas últimas presentan características únicas y diferentes que las distinguen de las partículas esféricas. Considerando la motivación anterior, el objetivo central de esta tesis fue la preparación de nanobarras de magnetita y ferritas mediante un método de síntesis que resultara sencillo, de bajo costo y reproducible. También se buscó modular las propiedades magnéticas de las nanobarras a través de cambios en el material que pudieran ser llevados a cabo mediante la variación racional de algunos parámetros de síntesis. Además, se propuso la preparación de materiales compuestos a partir de las nanobarras magnéticas y una matriz polimérica de polianilina, de modo de obtener un nuevo material que manifestara tanto propiedades magnéticas como una conductividad eléctrica que pudiera ser sintonizada por la modificación en características del material. En este trabajo se exploraron múltiples enfoques para lograr la preparación de las barras magnéticas. Finalmente se llevó a cabo el desarrollo y la puesta a punto de una nueva metodología que cumplió con los requerimientos planteados en los objetivos, basada en la utilización de una molécula como molde para dirigir el crecimiento de las partículas. Un resultado fundamental de esta tesis fue la obtención de barras magnéticas de distintas dimensiones a través de la sola variación de parámetros de síntesis controlables como la concentración de las especies químicas. Como consecuencia del control morfológico del material, se sintetizaron barras con distinto comportamiento magnético. Esto significa poder controlar el comportamiento magnético a partir de sencillas variaciones en la metodología de preparación.

Descripción: La calabaza (Cucurbita moschata Duchesne ex-Poiret) fue utilizada para formular un snackfortificado con hierro y Lactobacillus casei ATCC-393. Se determinó que el 55% del hierro resultóbioaccesible a nivel intestinal, y que su presencia y el almacenamiento afectaron tanto laviabilidad del probiótico, >10 7 UFC/g de calabaza durante 14 días a 8°C, como su tolerancia a ladigestión gastrointestinal in vitro (DGI). El producto fortificado obtuvo buena aceptabilidadglobal y el agregado de hierro no fue percibido. Los subproductos del proceso anterior, pulpa y cáscara de calabaza, fueron satisfactoriamenteutilizados como sustrato-soporte de Lactobacillus casei presentando un recuento viable >10 8 UFC/g. La supervivencia del probiótico luego de la estabilización y de la DGI fue >74% durante 28 días de almacenamiento a temperatura ambiente. En general, las propiedades físico-químicasy funcionales del polvo de calabaza (PC) no se vieron afectadas por la presencia del probiótico. El nuevo ingrediente a base de PC conteniendo L. casei fue testeado como suplemento dietarioen dos bebidas comerciales. Se observó un incremento de la viscosidad y un porcentaje desupervivencia >78% del probiótico después de la DGI. Además, se redujo la velocidad deinactivación del probiótico a 63°C respecto del suplemento con células libres. Las bebidas con el PC conteniendo L. casei fueron bien calificadas en cuanto a aroma, textura y aceptabilidadglobal. Por otro lado, el PC conteniendo L. casei fue testeado como ingrediente alimentarioincorporándolo a la formulación de un postre de origen no lácteo. Se obtuvo un postre con unrecuento de probióticos de 10 9 UFC/mL, mostrando además un efecto potenciador del color, lafirmeza y la capacidad de retención de agua, confirmando su potencial aplicación comoingrediente en la industria alimentaria. En conclusión, esta tesis presenta evidencia sobre la potencial utilización de tejido vegetal decalabaza, Cucurbita moschata Duchesne ex-Poiret, para la fortificación con hierro y L. casei ATCC-393, obteniendo un producto con buenas características nutricionales y organolépticas; yla utilización de los subproductos como sustrato y soporte del probiótico para la obtención deun nuevo ingrediente con mayor resistencia a factores de estrés tecnológicos y biológicos,buenas propiedades funcionales, y con alto contenido en fibra dietaria.

Descripción: Se ha estudiado la cinética de la oxidación catalítica del r propileno a acroleína y anhídrido carbónico, a 350°C, usando como catalizador óxido de cobre al 1,55% sobre carburo de silicio como soporte. Se usó un micro reactor diferencial y se variaron independientemente las presiones parciales de: Propileno: de 0,08 a 0,895 atm. Oxígeno: de 0,05 a 0,21 atm. Anhídrido carbónico: de 0,0 a 0,10 atm. Agua: de 0,0 a 0,12 atm. Aeroleína: de 0,0 a 0,03 atm.usando nitrógeno para completar la dierencia. Se ha comprobado que las velocidades de formación de acroleína y anhídrido carbónico dependen de la concentración de oxígeno, muy poco de la concentración de propileno y de anhídrido carbónico y son inhibidas por el agua y la acroleína. La curva de velocidades de reacción en función de la concentración del propileno parecería indicar un cambio en la composición del catalizador, y se encontró que por encima de cierta relación oxígeno: propileno se inactiva el catalizador para la formación de acroleína y aumenta la actividad para la de anhídrido carbónico. Siguiendo el método de cuadrados mínimos preconizado por Hougen y Watson se encontró que el mecanismo cinético de esta reacción ocurre entre oxígeno atómicamente adsorbido y propileno en la fase gaseosa, siendo la etapa controladora la adsorción del oxígeno. Las ecuaciones cinéticas que mejor describen el fenómeno son: Para la oxidación a acroleína:r1=37,21 pO2/(2(1+54,03 pAcrol.+4,04 pH2O)^2)y para la oxidación total:r2=4,43pO2/(2(1+12,42 pAcrol.+22,05 pH2O)^2)

Descripción: Trabajos previos sugerían la presencia en tejidos esteroidogénicos deuna proteína soluble ACTH-y AMPc-dependiente capaz de estimular lasíntesis de esteroides. En este trabajo se describe la purificación ahomogeneidad de esta proteína y su caracterización. Apartir de zona fasciculata de adrenales de ratas tratadas con ACTH,y mediante cromatografías en columnas de DEAE-celulosa, Sephadex G-100, Mono Q-HPLC y Superosa-HPLC y un procedimiento de elución deproteínas de geles de poliacrilamida, se purificó una proteína de 43 kDa (p43) capaz de estimular "in vitro" la síntesisde esteroides. El efecto de p43es dosis dependiente y es bloqueado por inhibidores de la fosfolipasa A2 (PLA2). La microsecuenciación peptídica demostró que p43 es una proteínanovel. Anticuerpos anti-péptidos sintéticos bloquearon la actividadesteroidogénica de p43, lo que demuestra que la secuencia determinadacorresponde a la proteína bioactiva. Ademas todos los anticuerposobtenidos reconocieron a la proteina desnaturalizada.p43 es una fosfoproteína con varios sitiosde fosforilación y el gradode fostorilación de la misma se halla bajo control hormonal, lo cual sugiereque la fosforilación de p43 se produce a través de mecanismos queinvolucran la activación de la proteína quinasa AMPc dependiente (PKA)mediada por ACTH. p43 puede ser fosforilada "in vitro" por PK A, lo cualrefuerza la hipótesis planteada. Se concluye que p43 es una novel fosfoproteína intermediaria en laestimulación de la sintesis de esteroides inducida por ACTH y que sumecanismo de acción posiblemente involucre, directa o indirectamente, laactivación de una PLA2.

Descripción: Fil: Leoni, Patricia R. D.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Fil: Moreno, Silvia N. J.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Fil: Radicella, Juan Pablo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Fil: Canziani, Gabriela Alicia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Elhexaclorobenceno (HCB)es un tóxico ambiental ampliamente distribuidoen la biósfera. La exposición crónica de animales de laboratorio al HCB,produce porfiria, inducción de enzimas microsomales hepáticas, disfuncionestiroideas, inmunosupresión, cambios en la función reproductiva y en elmetabolismo lipídico e inducción de tumores tiroideos y hepáticos. En este estudio, hemos demostrado que el HCB, administrado a ratashembras por intubación góstrica, induce cambios en la función demembrana celular hepática, de manera dependiente del tiempo y de ladosis. Nuestros resultados mostraron pa primera vez, que la intoxicacióncrónica con HCB, producía una internalización de los receptores de EGF (REGFs),acompañado de cambios en la actividad de quinasas de tirosina (PTKs)y de alteraciones en el contenido de fosfotirosina de numerosasproteínas endógenas de membrana y citosólicas. Estas modificacionesocurrieron desde dosis muy bajas en las que no hay alteraciones en otrosparametros indicativos de toxicidad manifiesta, como porfiria y disminución de T4 sérica. En un modelo de intoxicación aguda (24 horas post-tratamiento), el HCB aumenta las actividades de Ornitina Decarboxilasa (ODC) y Proteínaquinasa C (PKC) dependiente de calcio y fosfolípidos, y el contenido deespermina, y disminuye la actividad de PTKs de membrana. El contenido depoliaminas (putrescina, espermidina y espermina) se incrementósignificativamente a las 48 horas post-tratamiento. Nuestros resultadossugieren que el mecanismo de acción del HCB, estaría mediado por latransducción de señales de receptores de factores de crecimiento.

Descripción: Fil: Roisman, Félix Roberto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Fil: Orti, Eduardo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: La especificidad en la vía de transducción de señales de cAMP-PKA está determinada por el reconocimiento de la secuencia blanco en el sustrato y por la localización de la quinasa en compartimentos subcelulares. En Saccharomyces cerevisiae los determinantes de la especificidad de la proteína quinasa A (PKA) están menos caracterizados que en mamíferos. Analizamos el comportamiento de los sustratos y los determinantes de secuencia alrededor del sitio de fosforilación de tres proteínas sustrato: Piruvato quinasa 1 (Pyk1), Piruvato quinasa 2 (Pyk2) y Trehalasa neutra (Nth1). La proteína Nth1 es mejor sustrato que la proteína Pyk1 y ambas son fosforiladas tanto por Tpk1 como por Tpk2, dos de las isoformas de la subunidad catalítica de la PKA de levaduras. Las tres proteínas contienen uno o más motivos consenso de PKA, Arg-Arg-X-Ser, pero no todos ellos son fosforilados. Análisis de esos sitios permitieron determinar que los residuos ácidos en la posición P+1 o en el extremo N-terminal son deletéreos para la reacción catalítica, mientras que los residuos positivos presentes más allá de las posiciones P-2 y P-3 la favorecen. Un residuo hidrofóbico voluminoso en posición P+1 no resulta crítico, a diferencia de lo que ocurre con los sustratos de la PKA de mamíferos. El mejor sustrato tiene en la posición P+4 un residuo ácido, equivalente al que se encuentra en la secuencia inhibitoria de Bcy1, la subunidad regulatoria de la PKA de levaduras. Se analizó también el efecto del sustrato sobre la activación de la holoenzima y demostramos que tanto los sustratos peptídicos como las proteínas enteras sensibilizan en diferentes grados, dependiendo de sus secuencias, a la holoenzima para la activación por cAMP. Los resultados también sugieren que las proteínas enteras son mejores co-activadores que los péptidos. Se determinaron los catalitic turnover numbers de las isoformas Tpk1 y Tpk2, y ambas enzimas mostraron el mismo valor, 3 seg-1, diez veces menor que el valor determinado para las subunidades C de mamíferos. La compartimentalización de la señal del cAMP, otro punto de regulación de la especificidad, es mantenida por el agrupamiento de las enzimas de la vía de señalización en unidades discretas a través de las proteínas de anclaje de la proteína quinasa A (AKAPs), las cuales interactúan con la subunidad regulatoria de la holoenzima. Hasta el momento no habían sido identificadas proteínas de anclaje en levaduras. Definimos, utilizando abordajes in silico y bioquímicos de copurificación e identificación por espectrometría de masa, proteínas que hacen interacción con Bcy1, entre ellas: GTPase activating protein 2 (Ira2), Myosin2 (Myo2), Heat shock protein 60 (Hsp60) and Protein Tyrosine Phosphatase 1 (Ptp1). Utilizando arrays de péptidos se identificaron los residuos críticos para la interacción en las proteínas de anclaje. Los dominios definidos como claves de la interacción presentan una estructura posible de α-hélice con residuos cargados positivamente que son importantes para la interacción. Usando mutantes de deleción se definió que las proteínas estudiadas hacen interacción con la región N-terminal de Bcy1. Se verificó la interacción in vitro por ensayos de pull-down, e in vivo por inmunoprecipitación. También se demostró que Bcy1 e Ira2 localizan en la misma fracción subcelular y que péptidos derivados de Ira2 son fosforilados por las Tpks in vitro. Se analizó la relevancia fisiológica de la interacción entre Bcy1 y Hsp60 y se observó que la actividad quinasa de PKA disminuye en ausencia de la chaperona, indicando que la Hsp60 tendría una función estabilizadora sobre las Tpks y además que frente a un estrés térmico Bcy1, Tpk1 y Hsp60 aumentan su localización en la fracción mitocondrial, lo que permitiría modular el transporte de proteínas mitocondriales por fosforilación

Descripción: La permanencia de la mayoría de las neuronas durante toda la vida del organismo necesaria para mantener sus funciones, y el hecho de que estas células no se dividan luego del desarrollo sugieren que, durante la evolución, se ha ejercido una fuerte presión sobre el sistema nervioso de modo de desarrollar diversos mecanismos que lo protejan contra la muerte celular. Las dramáticas consecuencias de la neurodegeneración enfatizan la importancia de estos mecanismos que promueven la supervivencia y plasticidad neuronal. Por lo tanto, la identificación de los factores implicados en la regulación de la homeostasis y supervivencia neuronal es imprescindible para comprender el desarrollo y establecimiento de las enfermedades neurodegenerativas y para el diseño de una terapia racional para su tratamiento. La expresión temprana y extensa de p19INK4d, un miembro de la familia INK4 de inhibidores del ciclo celular, en el cerebro y su participación en la reparación del DNA y en la apoptosis sostienen la hipótesis de que esta proteína participaría en mecanismos de protección de las neuronas frente a la muerte celular. El objetivo del presente trabajo consistió en evaluar el potencial rol de p19 en este sentido, así como también su mecanismo de activación. Se utilizaron células SH-SY5Y diferenciadas con ácido trans-retinoico como modelo neuronal y cultivos primarios de neuronas hipocampales de rata. Los tratamientos con genotóxicos como el péptido β-amiloide o neocarzinostatina indujeron la expresión y fosforilación de la proteína de p19. Ambos efectos fueron dependientes de la movilización de calcio intracelular, ya que la incubación con el ionóforo de calcio A23187 o con una concentración aumentada de potasio, recapitularon la acción de los genotóxicos sobre p19. La inhibición de la actividad de CDK5 o la incubación con calpeptina, un inhibidor de la calpaína, responsable de la proteólisis de p35, subunidad regulatoria de CDK5, a p25, su forma más activa, causaron la inhibición de la fosforilación de p19 en respuesta a genotóxicos, demostrando que la quinasa CDK5 es la enzima efectora de dicha fosforilación. Se establecería un balance entre la síntesis y degradación de la proteína p19, ya que la misma parecería ser un sustrato de la calpaína, proteasa que se activa en presencia de los genotóxicos mencionados. Por otro lado, el factor de transcripción E2F1 participaría en la inducción de la expresión de p19 frente al péptido β-amiloide. Las células neuronales con sobrexpresión inducida de p19 repararon más eficientemente el DNA dañado y mostraron niveles reducidos de muerte celular en respuesta al tratamiento con el péptido β-amiloide o neocarzinostatina. Resultados opuestos se obtuvieron en células deficientes en esta proteína. La presencia de los genotóxicos también produjo la inducción del gen de p19 en neuronas de hipocampo. Estas células con niveles disminuidos de p19 presentaron una menor eficiencia en la reparación del DNA y un mayor grado de apoptosis luego del tratamiento con los genotóxicos. La presencia de p19 influenció la sensibilidad neuronal a largo plazo y confirió resistencia al estrés neurotóxico. Ensayos in vivo llevados a cabo en el hipocampo del ratón mostraron que en ausencia de p19 existía un mayor porcentaje de células dañadas luego de la inyección de neocarzinostatina. De esta forma, los resultados obtenidos en esta tesis nos permiten hablar de p19 como un factor neuroprotector, implicado no sólo en los mecanismos de reparación del DNA en respuesta al estrés genotóxico exógeno, sino también en la resistencia y en la supervivencia de las neuronas en respuesta a procesos endógenos que conducen a la neurodegeneración.

Descripción: El dealeado o disolución selectiva de aleaciones es un procesode corrosión característico de muchos sistemas metálicos,por el cual la superficie de la aleación se empobrece en su componentemenos noble. Y se recubre de una capa rica en el metalmás noble. Esta es generalmente porosa y de escasa resistenciamecánica, lo cual es comúnmente causa de fallas en servicio. El objeto de esta investigación fue el estudio del dealeadoen el sistema Cadmio-Magnésio, que presenta características quelo hacen de sumo interés para la elucidación de aspectos básicosde este fenómeno. Pese a que actualmente estas aleaciones sóloson de interés teórico, es de esperar que las conclusiones obtenidassean de utilidad para la mejor comprensión de los problemasde dealeado de aleaciones industriales, tales como latones, broncesde aluminio, cuproníqueles o aleaciones cobre-oro. El presente trabajo consistió básicamente en un estudio dela cinética y morfología de la disolución selectiva de Mg enaleaciones Cd-Mg ricas en Cd, en soluciones acuosas de NaClO4 yotros electrolitos. Se estudió el efecto de distintas variables,tales como: potencial de electrodo, temperatura, pH, composiciónde la aleación y del electrolito, además del efecto del agregadode pequeñas cantidades de un tercer aleante. Los resultados seanalizan a fin de determinar el mecanismo que gobierna el procesode dealeado en este sistema.

Descripción: Fil: Mendelzon, Daniel Hugo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Fil: Kerber, Norma Lucía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: En este trabajo, se dilucida el mecanismo de reacción de ladescomposición fotolítica del ioduro de isopropilo en fase gaseosa,en presencia de mercurio, con radiación de longitud de onda mayor fue 3.1301Å , estableciendo que es el siguiente: IiC3H7 —> I + i C3H7 (1)i C3H7 + i C3H7 -> C3H6 + C3H8 (2)i C3H7+ i C3H7 -> C6H14 (3)i C3H7+ IiC3H7 —> C3H8 + IiC3H6 (4) I (ó 12) + Hg -> I2Hg (5) Se llega a la conclusión de que tanto la reacción de descomposiciónmolecular, (6) IiC3H7 —> C3H6 + I H (6)como 1a abstracción de hidrógeno sobre carbono primario (7) seguidade la descomposicióndel radical resultante (8)i C3H7 + IiC3H7__, I C3H6+ C3H8 (7) I C3H6 —> I + C3H6 (8)no ocurren en un apreciable porcentaje. Se encuentra para delta (iC3H7- i C3H7),que es la relación delas constantes de velocidad de las reacciones (2) y (3) un valor promediode 0.576 +- 0.014, en total acuerdo con el dato informado en laliteratura, lo cual muestra fehacientemente que los ioduros de alquilopueden ser una fuente muy útil de radicales libres. Se analiza tambienel comportamiento del sistema azometano más ioduro de isopropilo bajo 1a acción de radiación de longitud de onda mayor que 3130, en presenciade mercurio, y se encuentran valores para la "combinación cruzada"de los radicales metilo e isopropilo, en acuerdo con los hallados previamente,lo cual también es una demostración del comportamiento normalde los fragmentos. Se determinó adyacentemente, el “calor de laconstante de velocidad de la reacción (9) a 300 °K. CH3 + IiC3H7 -> ICH3 + 1 C3H7 (9)que resultó ser aproximadamente:k9 = 7.42 10 7 cc mol-1 seg-1 La conclusión final que se extrae es que la fotólisis de losioduros de alquilo en fase gaseosa, en presencia de mercurio,es unaexcelente fuente de radicales alquilo, lo cual, dada la gran diversidadde estas sustancias su alta volatilidad y su fácil obtención y manipuleo,abre nuevas posibilidades al estudio de las reacciones entreradicales libres en fase gaseosa. A los efectos de conocer los antecedentes del trabajo realizado,se hace en el primer capítulo una reseña de los aportes fundamentalesrealizados hasta el presente, en materia de fuentes fotolíticasde radicales alquilo, reacciones entre radicales, reacciones de tranferenciade hidrógeno y de halógenos por parte de radicales y fotólisisde haluros de alquilo. En el segundo y tercer capitulo se describen la parte experimentaldel trabajo, y los resultados obtenidos, respectivamente y enel cuarto se realiza la discusión de dichos resultados y se sacan lasconclusiones finales.

Descripción: Fil: Billi de Catabbi, Silvia Cristina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Durante una infección por P. aeruginosa, la migración de lascélulas fagociticas desde la circulación hacia el pulmónes necesariapara la inactivación de la bacteria. Una respuesta inflamatoriaincrementada o acelerada puede, sin embargo, perjudicaral huésped y puede dejar serias secuelas en aquellos pacientesque se reacuperan de una neumonía por P. aeruginosa. Los productosde origen bacteriano con actividad quimiotáctica y quimiotaxigénicaha sido extensamente estudiados debido a su importanciacomo inductores de inflamación. A pesar que la acumulación de LPMN parece ser una de las mayores causas de la inducción de patogénesisdurante la inflamación aguda, poco es lo que se conocea cerca del efecto de los péptidos quimiotácticos bacterianos sobrelos eventos fisiopatológicos que ocurren durante una infecciónpor E. aeruginosa. En estudios previos de nuestro equipo sedemostró que B. aeruginosa y g. aureus liberan quimiotactinas encultivo, con capacidad de atraer LPMN. En este trabajo se ha demostrado que B. aeruginosa libera encultivo una mezcla de sustancias quimiotacticas para LPMN, concaracterísticas peptidicas de bajo peso molecular; la contribuciónde estas sustancias a la actividad quimiotáctica del SBCP espredominante. Las quimiotactinas activan a los LPMN para producirespecies reactivas del oxigeno. La respuesta funcional delos LPMN in vitro, frente a las quimiotactinas bacterianas fueparcialmente incrementada por la preincubación de las células con IL-l. La actividad quimiotáctica y la liberación de especiesreactivas del oxígeno por los LPMN activados con las quimiotactinasbacterianas in vitro, fueron parcialmente inhibidas por una DAINE. Los estudios in vivo permitieron demostrar que 1a migraciónde los LPMN, puede ser inducida por un aerosol de P. aeruginosa,por los quimiotácticos bacterianas o un quimiotáctico sintético. La quimiotaxis de los LPMN, en el modelo murino, fue inhibida porel tratamiento con piroxicam. La mortalidad de los ratones, enel modelo de neumonía inducido por P. aeruginosa fue disminuida,tanto por el tratamiento con piroxicam previo como por el tratamientoposterior al desafío por aerosol. Los resultados obtenidosen los experimentos in vivo e in vitro permitieron conocerparte de los mecanismos del daño de tejido pulmonar inducido por LPMN durante la infección por P. aeruginosa. También se demostróla posibilidad de regular el proceso inflamatorio inducido por P.aeruginosa, mediante el tratamiento con DAINE. Estos hallazgospermiten considerar la aplicación clinica futura de estas drogaspara controlar el daño de tejido pulmonar inducido durante laneumonía por P. aeruginosa.

Descripción:  C2H5 determinándose el valor de la constante de velocidad correspondiegte:ktransf = 90M-1 seg—1 El mecanismo lento se inicia por la fotólisis del productode reacción del proceso rápido (P1). Para dilucidar el mecanismo se determinaron los productosde la reacción del Trietil aluminio con la Benzoquinonaen benceno, obteniéndose como productos principales la Hidroquinona y la Trietil benzoquinona,luego de la hidrólisis y la oxidación suave del sistema de reacción. Se interpretó que la Hidroquinona seoriginaba a través de un mecanismo molecular, mientras que la formación de Trietil Benzoquinoha se explica por un mecanismo de radicales libres. Con el fin de comprobar la importancia de la reacción queproduce la inhibición de la polimerización se estudió la polime_rización de Metacrilato de metilo iniciada por Azobisisobutironi_trilo, también en presencia de Trietil aluminio y a 50,0°C. Aquíse observó, sorprendentemente, que a concentraciones iniciales de Trietil aluminio mayores que cuatro veces la concentración inicialde Azobisisobutironitrilo, ocurría una rápida reacción, por unmecanismo que no involucra radicales libre, dando por cada molécula de Trietil aluminio en exceso con respecto a dicha relación molar, una molécula de un oligómero de seis unidades de Metacrilatode metilo. Se alcanzó a verificar la existencia de la misma reaccción de transferencia.

Descripción: El reconocimiento de antígenos por medio de anticuerpos es un eventofundamental en la respuesta inmune adaptativa. A su vez la formación de los complejos Antígeno:Anticuerpo es extensivamente utilizada como modelo de estudio de interacciónproteína-proteína. En la presente tesis estudiamos el mecanismo de reconocimiento de unanticuerpo monoclonal específico, M1, por la proteína E7 del papilomavirus humano (HPV). E7 es la oncoproteína que constituye la principal actividad transformante del virus y además esparadigma de proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP). E7 se expresa constitutivamente entejidos de carcinoma y la aparición de anticuerpos específicos ocurre con alta frecuencia enpacientes con cáncer cervical. Llevando a cabo un mapeo epitópico determinamos que elanticuerpo M1 reconoce específicamente una región inmunodominante de la proteína de HPV- 16 denominada “bisagra”, por conectar el dominio IDP N-terminal con el dominio globular Cterminalde la misma. Experimentos cinéticos mostraron que la región reconocida por M1, lacual posee dos residuos de prolina, comprende al menos dos poblaciones separadas por una altabarrera energética (~ 22 Kcal/mol). Los estudios de Resonancia Magnética Nuclear identificaronel origen de esta barrera como un evento de isomerización cis-trans de las prolinas presentes enel epítope de reconocimiento. Se determinó que el anticuerpo M1 reconoce específicamente alepítope en su conformación minoritaria (10%), que posee sus prolinas en cis, mediante elmecanismo de selección conformacional. Por lo tanto, se requiere que el 90% de las moléculasque se encuentran en configuración trans isomericen previo a la unión con el anticuerpo. Lavelocidad de asociación del conformero cis por M1 ( kon = 6 x 107 M-1 s-1) se encuentra entre lasmás rápidas para las interacciones Antígeno:Anticuerpo, a pesar de que la reacción global esextremadamente lenta (t1/2 ~ 4 min). Esto indica que la reacción de asociación se encuentralimitada por un evento de isomerización de prolina. Utilizando mutantes puntualesdemostramos que la P41 en su conformación cis es la requerida para la unión con el anticuerpo. Luego del evento lento de pre-equilibrio y de la unión con M1, ocurre un evento de rearreglounimolecular, formándose finalmente un complejo consolidado de alta afinidad (KD 120 nM). Nuestros resultados sugieren que la presentación de este epítope viral por las célulaspresentadoras de antígeno tiene que haber estado en su configuración minoritaria cis, al generarel clon que produce el anticuerpo específico. Finalmente, mostramos la importancia de losdeterminantes estructurales presentes en regiones desordenadas en el reconocimiento entremacromoléculas. Dado que numerosas proteínas virales son multifuncionales debido a sunaturaleza IDP, los resultados presentados en esta tesis sientan la bases para el análisis delmecanismo de reconocimiento por medio de anticuerpos de epítopes virales intrínsecamentedesordenados.

Descripción: Fil: Kerner, Néstor Alberto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Se estudió en músculo de rata algunos, mecanismos que relacionan el sistema de enzimas que interviene en la fosforolisis de las uniones α(1→4) del glucógeno (sistema de la fosforilasa) con aquel responsable de la síntesis de dichas uniones (sistema de la glucógeno sintetasa). Se sabe que existen dos formas interconvertibles de fosforilasa, una activa solo en presencia de adenosina 5 monofosfato, la fosforilasa b y la otra forma, la fosforilasa a que no requiere dicho cofactor. La transformación de la fosforilasa b en a es catalizada por la fosforilasa b quinasa y la conversión inversa, por la fosforilasa a fosfatasa o PR enzima. La fosforilasa b quinasa existe también en dos formas: una "no activada", con muy poca actividad a pH 7,0 y mayor actividad a pH 8,0 y otra "actividad" casi con igual actividad a pH 7,0 y 8,0. También se sabe que la glucógeno sintetasa se presenta a su vez en dos formas, una , la glucógeno sintetasa dependiente, que es activa solo en presencia de glucosa 6 fosfato y la otra, la glucógeno sintetasa independiente que no necesita dicha hexosa fosfato para su actividad. Se comprobó, que una serie de factores, que actuan sobre la fosforilasa b quinasa actúan también pero en sentido opuesto sobre la glucógeno-sintetasa. Así el adenosina trifosfato con iones magnesio y 3´-5´adenosina monofosfato cíclico (ATP-MG++-3´5´ AMP) o el ion calcio (Ca++) o la tripsina a la vez que convierten una forma menos activa de la fosforilasa b quinasa ("no activada") en otra más activa ("activada"), transforman una forma más activa de la glucogenosintetasa ("independiente" en otra menos activa ("dependiente"). Se comprobó que la acción del ATP-Mg++ - 3´5´ AMP sobre la glucógenosintetasa era independiente de aquella producida por el Ca++. Así, preparados insensibles al Ca++ fueron snsibles al: ATP-Mg++-3´5´ AMP y viceversa. Al estudiar el efecto del Ca++ sobre la glucógeno sintetasa, se separó un factor indispensable para dicho efecto, el que sería de naturaleza proteica, ya que es sensible al calor, no dializable y atacable por enzimas proteolíticas. El peso molecular de este factor, sería de alrededor de 130.000. Este factor proteico, que actúa sobre la glucógeno-sintetasa no pudo ser separado del factor que interviene en el efecto del Ca++ sobre la fosforilasa b quinasa, obtenido por mayer ya sea por precipitación fraccionada con sulfato de amonio, cromatografía en dietilaminoetilcelulosa (DEAE) o ultrafiltración con Sephadex G 200. Tampoco se pudieron diferenciar ambos factores por tratamiento con calor o digestión con tripsina. De confirmarse la identidad de ambos factores y dado el hecho que actuaría simultáneamente y en forma opuesta sobre la fosforilasa b quinasa y la glucógeno sintetasa, podría ser este, otro elemento de regulación en la síntesis y degradación del glucógeno. También se estudiaron as propiedades diferenciales de la glucógeno sintetasa dependiente obtenida con ATP-Mg++-3´5´ AMP,de aquella obtenida con Ca++. Mientras la primera es reconvertible a la forma independiente por acción del mercaptoetanol y iones magnesio, la obtenida con Ca++, no lo es. Por otra parte, esta última es más sensible al calor y a la digestión con tripsina, que la obtenida con ATP-Mg++-3´5´ AMP. Sin embargo, las constantes de Michaelis y velocidades máximas para UDPG y G6P y las inhibiciones producidas por UDP y glucosa son semejantes para ambas glucógeno sintetasas. Se comprobó además que otros factores que actúan sobre el sistema de la fosforilasa actúan también sobre el de la glucógeno sintetasa como ser: 1) acción de la adrenalina sobre el de la glucógeno sintetasa como ser: 1) acción de la adrenalina y de su intermediario el 3´5´ adenosina monofosfato; 2) inhibición del efecto del Ca++ por una fracción sobrenadante de la precipitación de la glucógeno sintetasa a pH 5,2 y 3) la acción destructiva del mismo Ca++ sobre el factor proteico que interviene en sus efectos sobre la glucógeno-sintetasa y la fosforilasa b quinasa. Finalmente se discute la función que el Ca++ y el adenosina trifosfato pueden tener desde el punto de vista fisiológico, en relación con el trabajo muscular y las acciones hormonales en distintas condiciones. De las conclusiones del trabajo experimental descripto en esta tesis y de los elementos que nos da la bibliografía se puede esquematizar un mecanismo como el indicado en la figura 3 y 4.

Descripción: Fil: Capasso, Juan Miguel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: La interacción proteína-ADN juega un papel central en la fisiología celular. Dentro deéstas, se identifica al reconocimiento secuencia especifico con un rol regulatorio clave, pues deéstas interacciones depende la orquestación de los patrones de expresión génica de un organismo. Utilizando el dominio de unión a ADN del factor de transcripción E2 del papilomavirushumano, nos propusimos analizar la interacción en condiciones en las cuales fuera posibleextraer datos fisicoquímicos precisos del proceso de unión. Confiamos en que la interpretaciónde éstos en términos termodinámicos provee un marco para relacionar las estructuras proteicascon su funcionalidad biológica Caracterizamos un mecanismo de unión E2c-ADN al equilibrio en el cual E2c presentados modos diferentes de unión de ADN diferentes. Estos modos resultan estarestrechamente relacionados con la ocurrencia de poblaciones conformacionales del estado plegadode E2c. Mostramos ademas que ésto no sucede en un homólogo cercano con el quecomparte una alta identidad de secuencia y una topología de plegamiento idéntica, sugiriendoque ésto puede estar relacionado con los distintos roles funcionales que E2c presenta. El camino cinétíco de interacción E2c-ADN se inicia con una colisión rápida, limitadapor la difusión de las macromoléculas en solución. Esto da lugar a un "complejo de encuentro"estabilizado por interacciones electrostáticas, en el cual E2c tiene la posibilidad de deslizarsesobre la doble hélice. Si el ADN contiene un sitio E2, el complejo sufre fuertes rearreglos conformacionalesque, luego de una fase de expulsión de solvente. resultan en la formación de uncomplejo estable proteina:ADN. Este último paso involucra un ocultamiento de superficie accesibleal solvente y es allí donde se consolidan las interacciones cercanas aminoácido-base. Experimentos de doble-mezcla por flujo detenido nos permitieron asignar el orden secuencialde los rearreglos y demostrar que la unión puede también proceder por una ruta macroscópicaparalela. caracterizada como de dos estados. Utilizando una estrategia de mutagénesis sitio-dirigida realizamos un mapeoenergético de la interfase de unión. Pudimos asignar las contribuciones que cada residuo realiza, en forma aditiva, a la energía libre de asociación. Las asignaciones energéticas resultaronestar en excelente concordancia con las estructuras de alta resolución, y correlacionan con elcarácter altamente dinámico de la interfase de asociación. Lon conjuntos de estados de transición del camino cinético fueron analizados con 23mutantes sitio-dirigidas. Esto nos permitió disectar las contribuciones energéticas de los residuosindependientes a nivel atómico e inferir los cambios conformacionales que ocurren durantelas etapas de unión y reconocimiento de secuencia. Mostramos que la plasticidad estructuralque E2c presenta está íntimamente ligada a su capacidad de reconocimiento sitio-específico. Por último, presentamos un modelo funcional plausible de regular la actividad biológicade E2c y su capacidad de reconocimiento de secuencias de ADN.

Descripción: El Síndrome Urémico Hemolítico (SUH) es una enfermedad que afecta principalmente a niños entre 0-5 años causada habitualmente por Escherichia coli productoras de toxina shiga (STEC). El índice de mortalidad es bajo (2-6%) pero el 30% sufre secuelas renales o neurológicas. La acción de la toxina shiga (Stx) junto a la activación de la respuesta inflamatoria montada por el huésped son determinantes para el desarrollo completo del SUH. Nuestros objetivos fueron (a) estudiar los efectos de Stx in vivo sobre la respuesta inflamatoria y el balance oxidativo, y (b) analizar los mecanismos montados por el huésped para contrarrestar dichos efectos. En particular, investigamos el papel de los glucocorticoides (GC) y de los antioxidantes. Para esto utilizamos el modelo murino por inoculación endovenosa de Stx de tipo 2 (Stx2). Para analizar los efectos de los GC endógenos utilizamos el antagonista del receptor para GC (R-GC), Ru486. Stx2 indujo la neutrofilia y activación de los neutrófilos. El tratamiento simultáneo Stx2+Ru486 exacerbó la mortalidad, no alteró la concentración de citoquinas, aumentó el daño renal y la activación de los neutrófilos. La Stx2 indujo la expresión receptores para GC en neutrófilos y éstos fueron más sensibles a los efectos de la dexametasona. Stx2 indujo el estrés oxidativo depletando glutatión y aumentando la peroxidación lipídica del riñón, y la generación de intermediarios reactivos del oxígeno en neutrófilos. Este nivel de estrés oxidativo fue bloqueado parcialmente por agentes antioxidantes N-Acetil-L-Cisteina y S-Etil-L-Cisteína, aumentando la sobrevida y suprimiendo la oxidación. En conclusión, Stx2 genera un estado proinflamatorio y oxidativo que contribuyen al daño tisular. Los GC y los antioxidantes endógenos juegan un papel central frenando este efecto. Estos resultados nos permiten proponer el estudio de los efectos beneficiosos de los agentes antioxidantes o antiinflamatorios durante la infección con STEC, antes del desarrollo del SUH.

Descripción: El óxido nítrico (NO) es un mediador clave de múltiples procesos biológicos. En la adenohipófisis, además de regular la secreción hormonal, el NO puede inducir apoptosis o bien tener un papel citoprotector. Esto muestra que esta molécula tiene un papel activo en la regulación de la vida y muerte celular adenohipofisaria. El objetivo general de esta tesis doctoral fue estudiar la participación del NO en los procesos de muerte celular en la adenohipófisis y sus mecanismos de acción, estableciéndose dos objetivos puntuales: 1. Investigar los mecanismos intracelulares involucrados en la apoptosis inducida por altas concentraciones de NO, situación que puede presentarse durante procesos inflamatorias. 2. Investigar el proceso de regulación de la muerte celular luego de la ovariectomía y dilucidar el papel del NO en este proceso. Los resultados del primer objetivo han permitido identificar algunos de los mecanismos intracelulares involucrados en la apoptosis inducida por concentraciones micromolares de NO en las células adenohipofisarias. Dentro de los mecanismos que caracterizan a la vía apoptótica mitocondrial, se pudo establecer la sobreproducción mitocondrial de especies reactivas del oxígeno (ROS) como uno de los eventos disparadores de esta cascada apoptótica. Este aumento de ROS indujo cambios en la expresión de Bax y Bcl-2 y la activación posterior de la caspasa 3, que llevó finalmente a la muerte celular. Paralelamente a esta secuencia de eventos, el NO modificó la actividad de las diferentes enzimas antioxidantes y alteró los niveles intracelulares de glutatión, lo cual demuestra un papel activo del sistema de defensa antioxidante celular durante el desarrollo de este proceso apoptótico. Los resultados del segundo objetivo mostraron, tanto in vivo como in vitro, que luego de la ovariectomía hay un aumento de la muerte celular en la glándula debido a la inducción de apoptosis. Paralelamente, se observó un incremento en los niveles adenohipofisarios de NO. Estos cambios pudieron ser prevenidos por el tratamiento con inhibidores de la óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS) demostrando, por primera vez, que el NO tiene un papel clave en la ejecución de la muerte celular desencadenada en la adenohipófisis luego de la ovariectomía.

Descripción: Fil: Hermitte, Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Nuestros recuerdos no solo nos definen como seres humanos sino que son la principal base de la creatividad y la imaginación. La memoria implica tanto recordar a lo largo del tiempo como también mantener los recuerdos diferenciados y no confundirlos. Se cree que la capacidad de diferenciar experiencias similares en recuerdos distintos se basa en la separación de patrones, un proceso definido computacionalmente mediante el cual se amplifican pequeñas diferencias en la entrada de información. Mejorar estas capacidades cognitivas a través de intervenciones sencillas y ecológicas ha sido uno de los grandes desafíos de la neurociencia aplicada. En este trabajo, basándonos en los mecanismos estudiados en otras especies, evaluamos diversas intervenciones (actividad física y novedad) en distintas características (separación de patrones, memoria, pensamiento divergente y convergente e imaginación) y fases de la memoria episódica (consolidación y evocación). En la primera parte, pusimos a punto dos tareas completamente novedosas mediante las cuales evaluamos la separación de patrones en humanos. La primera tarea espacial se desarrolló dentro de un entorno de realidad virtual en el que el participante pudo interactuar y navegar por una amplia arena. Encontramos que una intervención aguda de actividad física durante la consolidación de la memoria - y no durante la evocación - mejoró la retención de largo término de memorias espaciales similares y no generó ningún efecto en memorias espaciales disímiles. Sin embargo, el rendimiento de los participantes que realizaban actividad física de manera crónica no fue significativamente mejor que el del grupo control. La segunda tarea fue de objetos y se puso a punto de manera virtual. Se observó que la actividad física aguda en este caso mejoró la memoria en general (tanto las memorias similares como las de reconocimiento clásico) con respecto al grupo control. En la segunda parte, estudiamos el efecto modulador de un evento novedoso en distintos aspectos de la memoria episódica en estudiantes de escuela secundaria. Observamos que la novedad mejoró la evocación de una memoria gráfica si se daba inmediatamente antes de la evocación pero no una hora antes. La novedad, además, mejoró el rendimiento en una tarea que evaluó el pensamiento divergente, pero no en una de pensamiento convergente. Luego, estudiamos la interacción entre la evocación de la memoria episódica y las tareas de creatividad. Hallamos una competencia no recíproca entre ambas tareas por los recursos brindados por la novedad: la memoria mejoró con la novedad únicamente cuando la tarea se realizó antes que la de creatividad, mientras que el pensamiento divergente mejoró tanto cuando se realizó antes como después de la tarea de memoria. El efecto promotor de la novedad sobre la memoria no se pudo reproducir de manera virtual durante el período de confinamiento asociado a la pandemia de SARS-CoV-2. Por último, estudiamos la capacidad de imaginar escenas en un amplio rango etario y observamos que el mejor desempeño lo obtuvieron los grupos de edades medias de 24 y 46 años, mientras que, tanto participantes menores como mayores obtuvieron peores rendimientos. Además, vimos un efecto modulador positivo de la novedad en la imaginación de escenas para el grupo de participantes de 6 años. Por lo tanto, en esta tesis, encontramos intervenciones sencillas y ecológicas de muy fácil aplicación real que mejoraron distintas capacidades cognitivas relacionadas con la memoria episódica en distintas poblaciones.

Descripción: En esta Tesis se abordó el estudio de los mecanismos bioquímicos involucrados en lainteracción entre algunas bacterias promotoras del crecimiento y dos plantas de interésagronómico, arroz (Oryza sativa) y tomate (Solanum lycopersicum). La bacteria Azospirillum brasilense promovió el crecimiento de plantas de arroz,especialmente de su sistema radicular; la inoculación indujo un aumento en la producciónde etileno en la planta y en la actividad y expresión de la ácido 1-amino-ciclopropano-1-carboxílico sintasa (ACS). Se observó también un aumento en la actividad de quinasa deproteínas dependiente de Ca⁺² cuyas características bioquímicas indican que se trata deuna CDPK que estaría relacionada con el crecimiento de las raíces laterales. La inoculación con A. brasilense promovió el crecimiento de plantas de tomate, aumentólos niveles de ácido indol acético (AIA) y etileno y la actividad y expresión de ACS. Elsuplemento exógeno de etileno y el uso de un inhibidor de su percepción permiten asignar amodo de hipótesis un rol intermediario del etileno en la promoción del crecimiento delsistema radicular en plantas de tomate inoculadas con A. brasilense. El análisis global del perfil de expresión génica asociado a la inoculación de plantas detomate con A. brasilense indicó que la inoculación estimuló la expresión de una variedad degenes, muchos de los cuales se inducen por etileno y que se han encontrado sobreexpresados en otras especies en respuesta a la infección con patógenos o afectadas poragentes generadores de estrés. Los niveles de expresión de los genes implicados en elestablecimiento de la respuesta hipersensible aparecen sub expresados lo cual podríafavorecer el establecimiento de la interacción endofítica entre A. brasilense y tomate. Utilizando la técnica de 2D-DIGE se comenzó el análisis de los perfiles de proteínasexpresadas en plantas de tomate inoculadas con A. brasilense. Con esta técnica se logróevidenciar diferencias en los patrones de expresión que dependen del tratamiento al que sesometió a las plantas.

Descripción: Fil: Santa Cruz, Ana Rosa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Diversas evidencias experimentales demostraron que el desarrollo de insulinorresistencia (IR) se acompaña de cambios en la actividad del eje hipotálamo-hipófiso_adrenal (HHA) que se traducen en variaciones en los niveles sanguíneos de glucocorticoides (GC), tanto en pacientes como en modelos animales de la enfermedad. En trabajos previos de nuestro laboratorio demostramos un aumento en los niveles de GC en animales tratados con una dieta rica en sacarosa (DRS) durante 7 semanas que se asoció con una respuesta adrenal disminuida en la prueba de estimulación con la hormona adrenocorticotropina (ACTH). Dado que la principal hormona reguladora de la secreción de GC es la ACTH, el objetivo central de este trabajo de tesis consistió en evaluar los efectos de la administración de DRS sobre la producción de ATCH en distintos estadios del dearrollo de IR y estudiar los mecanismos subyacentes a las alteraciones encontradas a nivel adenohipofisario. En ese marco, evaluamos los efectos del tratamiento antioxidante sobre cambios tempranos inducidos por el consumo de DRS y del ejercicio moderado como medida preventiva de los efectos de la exposición prolongada a la dieta. Los resultados obtenidos indicaron que en el modelo animal de IR por la administración de DRS, los animales presentaron cambios en la secreción de ACTH y corticosterona. En etapas tempranas del tratamiento (3 semanas) encontramos un aumento en la actividad del eje HHA, que fue previa a la detección de cambios en la insulinosensibilidad sistémica (evidente a partir de la séptima semana del inicio del consumo de DRS). Sin embargo, en animales tratados por períodos más prolongados (15 semanas) observamos una disminución de los niveles circulantes de ACTH y de corticosterona. Postulamos que la hiperactivación temprana del eje podría estar asociada con la generación de estrés oxidativo a nivel adenohipofisario, dado que el tratamiento antioxidante sistémico previno tanto el aumento de marcadores de este proceso como la hipersecreción de ACTH. La disminución en la actividad del eje HHA detectada en etapas más tardías del tratamiento podría ser consecuencia de la exposición crónica del tejido hipofisario al estrés oxidativo, inducido por concentraciones elevadas de ácidos grasos no esterificados (AGNE) circulantes, un efecto que podría ser medido por la inducción de autofagia. Demostramos que el ejercicio moderado previno la inducción de estos procesos y la inhibición de la secreción de ACTH en animales alimentados con DRS durante 15 semanas, además de evitar el incremento de AGNE. Finalmente, estudiamos con mayor profundidad estos procesos en células adenohipofisarias en cultivo evaluando el efecto de la incubación de células de la línea ArR-20 con ácido palmítico (C16:O) y con inductores de estrés oxidativo y autofagia. En suma, nuestros resultados indican que la administración de una DRS produce un incremento temprano en la expresión de Pomc y ACTH posiblemente mediada por la generación de estrés oxidativo tisular. Una exposición prolongada del tejido a niveles incrementados de nutrientes, como los ácidos grasos, adicionalmente induce el proceso autofágico, lo que lleva a una hipofunción de la glándula. Los GC afectan el metabolismo estimulando la movilización de las reservas energéticas. Sin embargo, un aumento sostenido de los niveles de estas hormonas podría contribuir al agravamiento de las características metabólicas del síndrome de IR, y precipitar la aparición de las complicaciones a largo plazo relacionadas con la enfermedad. En nuestro modelo, el estado de IR crónico se correlacionó con una inhibición de la actividad basal del eje HHA, lo que contribuiría al restablecimiento de la homeostasis metabólica. Sin embargo, también podría dar lugar a complicaciones adicionales, como la insuficiencia adrenal, afectando la respuesta del organismo frente a situaciones de estrés, lo que representaría otro factor de riesgo para los pacientes con IR.

Descripción: ambos cambios dependientes de óxido nítrico. En segundo lugar, se ha establecido que el precondicionamiento con un estímulo hipóxico de baja intensidad, confiere tolerancia parcial a una injuria hipóxica más severa 24 h después. Mediante la administración de moduladores de las HIF-prolil hidroxilasas, demostramos que la acumulación de HIF-1 durante el precondicionamiento es necesaria para que se manifieste la tolerancia a una injuria hipóxica posterior. Por último, observamos que la administración de inhibidores selectivos de nNOS/mtNOS y el precondicionamiento hipóxico, aplicados en forma conjunta, tuvieron un efecto aditivo, logrando una neuroprotección completa. Los resultados obtenidos sugieren que los efectos neuroprotectores de los inhibidores selectivos de nNOS/mtNOS en nuestro modelo se deben a efectos independientes de la acción de NO sobre la vía de HIF-1.

Descripción: En el aprendizaje asociativo, la reactivación de la memoria por la presentación de un recordatorio puede inducir dos procesos mnésicos aparentemente opuestos, la reconsolidación o la extinción. En esta Tesis describimos un switch molecular entre mecanismos de transcripción que se inducen diferencialmente en el hipocampo en la determinación de dichos procesos. Encontramos que NF-kB es necesario para la reconsolidación, mientras que para la extinción su activación se ve restringida por la fosfatasa calcineurina. El factor de transcripción NFAT es activado a su vez por calcineurina durante la extinción, y es necesario para que este proceso tenga lugar. Por el contrario, NFAT parecería no tener ningún rol en la reconsolidación. La actividad de calcineurina también es necesaria para que se lleve a cabo el proceso de extinción. Esta fosfatasa jugaría entonces un doble papel: 1) induciendo la activación y translocación de NFAT desde el citoplasma hacia el núcleo, 2) bloqueando a la vez la activación de NF- kB. Asimismo, nuestros resultados en el estudio de la consolidación sugieren fuertemente que calcineurina actúa como limitante negativo en la formación de memorias, y su mecanismo de acción involucra la regulación del estado de activación de NF-kB. Profundizamos entonces el modelo en el que quinasas y fosfatasas dependientes de calcio controlan activamente el procesamiento neuronal, mediante un equilibrio finamente regulado en el que se oponen entre sí. Por último, estudiamos el rol de NF-kB en plasticidad estructural relacionada a procesos de memoria, y resultados preliminares nos indican que el mismo tendría un rol clave en el aumento de densidad de espinas asociado al aprendizaje.

Descripción: El estudio de la conciencia y la arquitectura cognitiva subyacente a este fenómeno es motivo de amplia discusión y debate dentro de la neurociencia en las últimas décadas, gracias a los avances logrados sobre todo en el campo del procesamiento visual. El trabajo desarrollado en esta tesis se encuentra enmarcado dentro del estudio de los aspectos cognitivos y neurofisiológicos de procesos que involucran tareas de decisión perceptual, en particular, el acceso de la información sensorial a procesos cognitivos posteriores tales como la memoria de trabajo, la conciencia y el reporte subjetivo. Hemos desarrollado y profundizado el estudio de un paradigma de reporte parcial asociado a una respuesta subjetiva y analizado la relación existente entre la respuesta objetiva y la respuesta subjetiva. A partir de las propiedades temporales y espaciales encontradas y del análisis de los errores, observamos un efecto de aprendizaje perceptual en el acceso a la memoria icónica, una restricción atencional al acceso y mantenimiento de la información en memoria icónica, y un decaimiento de la información geométrica similar a la dinámica de la misma. Adicionalmente, encontramos una respuesta subjetiva robusta y bajo ciertas condiciones desacoplada de la respuesta objetiva. A su vez, gracias a la evidencia acumulada en los trabajos precedentes, evaluamos los correlatos neurofisiológicos del reporte subjetivo, independientemente de la respuesta objetiva, mediante la utilización de electroencefalografía de alta densidad (EEG), y alteraciones en el flujo de información en pacientes con lesiones frontales y pacientes con Trastorno Bipolar. Encontramos marcadas evidencias respecto a la participación de áreas pre-frontales, de la corteza cingulada y la corteza parietal en la generación del reporte subjetivo, en favor de un modelo global de acceso a conciencia que involucra la participación e integración de la información de áreas sensoriales por parte de regiones de la corteza pre-frontal y del cingulado anterior. Encontramos también evidencia de un proceso de acumulación involucrado en la generación de la confianza subjetiva. Desarrollamos en paralelo un paradigma de decisión perceptual con respuesta continua en donde logramos seguir en tiempo real el acceso de la información sensorial a la toma de decisiones, dividiendo este evento en secuencias discretas cuya duración y número covarían con la dificultad de la tarea. En este sentido, creemos que los resultados obtenidos en esta Tesis son un avance en el entendimiento de la dinámica de los procesos cognitivos, el acceso conciente y la generación de estados mentales subjetivos.

Descripción: El crecimiento y el desarrollo de las plantas se encuentran fuertemente influenciados por el ambiente luminoso que las rodea. Las señales de sombreado por plantas vecinas desencadenan respuestas como el aumento del crecimiento del tallo. CONSTITTUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1 (COP1) es una E3 ligasa involucrada en la ubiquitinización de proteínas dirigidas a degradación. En plántulas crecidas en oscuridad, COP1 se acumula en el núcleo y la exposición a la luz causa la migración de COP1 al citosol. Si bien COP1 es también necesario para que se produzca la respuesta de crecimiento a las señales de sombra, sus mecanismos de acción en esta condición no han sido dilucidados. Los resultados expuestos en este trabajo muestran que COP1 se acumula en el núcleo en sombra natural y sombra simulada, sugiriendo un rol activo en la señalización de la sombra. Las proteínas PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR (PIF) son factores de transcripción centrales en la regulación de la señalización de la sombra y la promoción del crecimiento del tallo a través de las auxinas. Estudiamos la posible convergencia de la vía de señalización de los PIF con COP1 mediante el análisis del transcriptoma, los niveles de auxinas y distintas respuestas fisiológicas. Las proteínas HY5 y HFR1 son blancos moleculares de COP1 antes que las plántulas sean expuestas a la luz por primera vez. Ambos regulan negativamente la actividad de los PIF mediante diferentes mecanismos. Los resultados presentados demostraron que COP1 regula negativamente los niveles de HFR1, pero no de HY5, en condiciones de sombra, por lo que proponemos que este sería un punto convergencia entre ambas vías de señalización. Finalmente, mostramos que COP1 también regularía negativamente los niveles de proteínas DELLA, que son claves en la señalización de giberelinas e inhiben la acción de los PIF formando heterodímeros.

Descripción: Durante mucho tiempo la Eritropoyetina (Epo) fue conocida únicamente por su acción sobre elsistema hematopoyético. Más recientemente, investigaciones desarrolladas para comprender losmecanismos básicos de sus efectos biológicos han revelado un efecto pleiotrópico de Epo que seextiende más allá de la regulación eritropoyética. En este sentido, su capacidad citoprotectorasugiere un posible uso terapéutico en enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares,además de su administración a pacientes anémicos. Por otro lado, la actividad de Epo sobre progenitores eritroides de médula ósea ha sido asociadaa una mayor incidencia de eventos trombóticos e hipertensión en pacientes, lo cual ha dadoorigen a la búsqueda de compuestos derivados incapaces de estimular la eritropoyesis queconserven su actividad citoprotectora. Uno de estos compuestos es la eritropoyetina modificadapor carbamilación (cEpo), cuyos efectos sobre el endotelio no han sido estudiados enprofundidad hasta el momento. Con el fin de optimizar el uso clínico de Epo se requiere de un mayor conocimiento para aclararla compleja interrelación de las acciones hematopoyética y no-hematopoyética de esta citoquinasobre distintos tejidos. En base a esto, uno de los objetivos de este trabajo de Tesis Doctoral esaportar nuevos datos sobre los efectos y mecanismos de acción de Epo sobre el endotelio, conparticular interés en la angiogénesis, al mismo tiempo que se busca dilucidar si la carbamilaciónde la molécula de Epo introduce algún cambio en su actividad biológica sobre célulasendoteliales. Mediante técnicas de migración por wound healing, formación de túbulos de células endotelialessobre un sustrato símil matriz extracelular y análisis del ciclo celular, realizados sobre la líneacelular endotelial humana EA.hy926, determinamos un efecto inductor de Epo sobre la funciónangiogénica, que no fue observado con cEpo. En cuanto a los mecanismos de accióninvolucrados, hemos descrito la participación del receptor EpoR2 y de la quinasa JAK2, asociadosa la acción eritropoyética de Epo, en su efecto inductor de la migración en células endoteliales. Sibien cEpo fue capaz de activar las vías de señalización asociadas a Epo, su ausencia de efectopromigratorio estaría relacionada con un cierre prematuro de su señal, mediado por la fosfatasa PTP1B. Este mecanismo de acción diferencial entre ambas eritropoyetinas fue reportado entrabajos anteriores de nuestro grupo realizados en células eritroides. Por otro lado, nuestros resultados muestran un efecto dual de Epo sobre la generación deespecies reactivas de oxígeno, siendo capaz de prevenirla a tiempos largos de exposición, al igualque cEpo, pero también estimulándola en forma transiente, lo cual constituiría un mecanismopromigratorio. La enzima óxido nítrico sintasa también estaría relacionada con la acción de Eposobre la migración de células EA.hy926. La relación entre calcio y eritropoyetina, descrita anteriormente en la diferenciación eritroide,también es importante en la migración de células endoteliales, como lo confirman ensayosrealizados con quelantes de este catión. Mediante experimentos realizados con inhibidoresfarmacológicos de canales de calcio dependientes de voltaje se determinó la participación de losmismos en el influjo de este catión estimulado por Epo, lo que constituye una evidencia a favorde la expresión de estos canales en células endoteliales. El estudio de estos canales nos permitió,además, conocer la actividad antiangiogénica de la amlodipina, un antagonista de calcio de usoclínico como antihipertensivo. Por otra parte, también se determinó la importancia de canales decalcio TRPC y canales de potasio en la respuesta migratoria a Epo. El calcio fue también unintermediario en el efecto inductor de Epo sobre la expresión de acuaporina-1, cuya funcióncomo proteína canal de agua hemos visto por primera vez asociada a la migración estimuladapor Epo. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo de Tesis muestran un efecto diferencialde eritropoyetina y su derivado carbamilado sobre la angiogénesis, mediante mecanismossimilares a los observados en células eritroides, y aportan información sobre los diferentesintermediarios y efectores de Epo en su modulación de la actividad angiogénica. La incapacidadde cEpo de activar procesos relacionados a la migración celular genera interés en su posibleaplicación terapéutica, ya que podría ejercer citoprotección sin estimular la angiogénesis ni laeritropoyesis en pacientes donde estos procesos pueden representar un efecto indeseado.

Descripción: La insulina desempeña un papel clave en la regulación de múltiples procesos celulares. La unión de la hormona a su receptor en la superficie celular activa la actividad intínsecade quinasa de tirosinas del mismo, ocasionando la autofosforilación del receptor y lafosforilación de sustratos intracelulares denominados IRSs. Los IRSs actúan comomoléculas adaptadoras en la transducción de señales, reclutando a una gran variedad deproteínas que contienen dominios de homología Src (SH2), entre ellas: la subunidadregulatoria (p85) de la PI3K a la “growth factor receptor binding protein 2”(Grb2). Esteevento conduce a la activación de las cascadas de la PI3K y de Ras/MAPK,respectivamente. En el presente trabajo hemos examinado la acción de la hormona peptídica sobre laexpresión del gen de la 5-aminolevulinato sintetasa (ALAS) en hepatocitos de rata y encélulas de hepatoma humano HepG2. La ALAS es la primera enzima y regulatoria de labiosíntesis del hemo, su nivel es normalmente bajo en el hígado pero se incrementamarcadamente en respuesta a drogas porfirinogénicas como el fenobarbital. El tratamientocon insulina 5nM produjo una notable disminución en los niveles del mRNA de ALAStanto en condiciones basales como de estimulación con fenobarbital. Este efecto fue dosisdependiente como pudo observarse mediante ensayos de Northern y slot blot. Por otraparte la vida media del mRNA de ALAS no fue modificada por la presencia de la hormonalo que sugiere que la acción ejercida por la insulina sería relevante a nivel transcripcional. Con la finalidad de determinar la actividad transcripcional del promotor, realizamos unaconstrucción (pACAT) que contiene 876 pb de la región 5’ flanqueante del gen de ALASdirigiendo la expresión de la cloramfenicol acetiltransferasa (CAT). En cotransfeccionestransientes de células HepG2 observamos una significativa disminución de la actividad CAT cuando se incubaron las células con la hormona. Considerando estos resultados, utilizamos dos metodologías diferentes paracaracterizar las vías de transducción de señales involucradas en la represión hormonal de ALAS. En un primer abordaje empleamos agentes químicos, permeables a la membranaplásmatica, que inhiben específicamente a proteínas intermediarias de la señalización deinsulina, para evaluar la contribución de estos efectores a la respuesta final. Losinhibidores de la PI3K (wortmanina y LY294002), de la famesilación de Ras (lovastatina y PD152440) y de MEK (PD98059) abolieron la acción de la insulina, mientras que elinhibidor de mTOR/p70RSK (raparnicina) no tuvo efecto alguno sobre la represiónhormonal. Por otra parte, analizamos el efecto de la sobrexpresión de formas dominantesnegativas o constitutivamente activas de intermediarios de las vías de Ras/MAPK y de la PI3K para evaluar el papel de estas cascadas en la inhibición transcripcional de ALAS. Lacotransfección de células HepG2 con versiones dominantes negativas de SOS, Ras, Raf, MEK y MAPK interfirió la acción de la insulina, mientras que la cotransfección conformas constitutivamente activas de Ras, MEK y p90RSK mimetizó la inhibiciónhormonal per se, independientemente del estímulo en el receptor. Un comportamientosimilar se obtuvo cuando empleamos versiones dominantes negativas de PI3K y PKB o ala PKB miristoilada, respectivamente. Estos resultados nos permiten proponer que laseñalización a través de ambas vías es requerida para obtener la totalidad del efecto final. Por último, la regulación hormonal fue mediada por un fragmento de ll7 pb (-469/354)del gen de ALAS, capaz de conferir sensibilidad a insulina cuando fue subclonado ríoarriba del promotor heterólogo de la quinasa de tímidina (pALIRE). Esta región presenta lasecuencia GTTTTG, muy similar al IRE canónico reportado para genes reprimidos por lainsulina, que resultó crucial para la inhibición. En EMSAs pudo observarse la formaciónde complejos por unión a secuencias con alta homología a las de HNF3 y NF1 presentes enesta región. Todos estos hallazgos sugieren que la insulina requiere la acción orquestada deefectores celulares (intermediarios de las cascadas Ras/MAPK/p90RSK y PI3K/PKB)y de factores de transcripción que reconocen secuencias específicas y abre laposibilidad de considerar que miembros de las familias HNF3 y NF1 podrían interveniren la respuesta.

Descripción: La exposición a aluminio (Al) afecta la eritropoyesis. Sin embargo, poco se conoce acerca de las características de este efecto, así como de los mecanismos involucrados. En el presente trabajo de investigación se planteó, como primer objetivo, la necesidad de caracterizar la anemia producida por sobrecarga oral crónica con Al. Después de ocho meses de tratamiento, los animales desarrollaron anemia no ferropénica. La disminución de la concentración plasmática de haptoglobina, el aumento de reticulocitos y la presencia de esquistocitos apoyan la naturaleza hemolítica de la anemia desarrollada. A causa del tratamiento, se observó una importante inhibición del desarrollo de CFU-E en ensayos ex vivo de células de médula osea. El otro signo notable fue la aparición de severas alteraciones morfolófgicas en eritrocitos de sangre periférica, lo que sugirió una acción directa del A1 sobre las células eritroides maduras. Esa posibilidad fue corroborada en ensayos in vitro de eritrocitos humanos incubados en presencia del metal, en los cuales el rasgo persistente fue la desaparición de la típica forma bicóncava. El aumento de la degradación de la proteína estructural banda 3, observado junto con la detección de depósitos de A1 en la membrana, apoya no sólo la estrecha relación entre la morfología celular y la estructura y organización de la membrana del eritrocito, sino también una acción directa del metal sobre componentes de la membrana. La disminuida respuesta de las células progenitoras CFU-E a la eritropoyetina (Epo), después de la exposición crónica a Al, motivó la investigación de los efectos del metal sobre mecanismos involucrados en la vía de activación del receptor para Epo (EpoR). La exposición a A1 provocó disminución del EpoR a nivel de ARNm y de proteína, hallazgo que coincidió con la anulación del efecto antiapoptótico de la Epo sobre células K562. En la línea UT-7, altamente dependiente de Epo, sólo una exposición crónica a Al modificó la respuesta a la 1a hormona. Después de esa exposición, el aumento del EpoR a nivel de ARNm y de proteína, detectado bajo condiciones de carencia de Epo, sugiere un aumento de la sensibilidad de esta línea celular a1 factor de crecimiento. En conclusión, es evidente que el Al no resulta un elemento inocuo. Actúa sobre el sistema eritropoyético afectando a las células eritroides en distintos estadios de maduración. Los resultados sugieren una acción directa del metal sobre los componentes de la membrana celular de los eritrocitos maduros y un mecanismo de interferencia en distintos caminos de activación de células eritroides inmaduras mediados por la formación del complejo eritmpoyetina-receptor.

Descripción: Los factores HIF son heterodímeros compuestos por dos subunidades, y β. Mientras que los niveles de HIF-β son constitutivos, la estabilidad y actividad de las subunidades HIF-1α y HIF-2α están finamente reguladas por los niveles de O2: contienen un dominio de degradación dependiente de oxígeno (ODD) que en normoxia es blanco de hidroxilación. Cuando HIF-α está hidroxilada puede interactuar con el supresor tumoral von Hippel-Lindau (VHL), que conformando un complejo proteico con Elonguina C, Elonguina B, Cullina-2 y Rbx-1 promueve la poliubiquitinación de HIF-α, señal necesaria para su posterior degradación. El sindrome de VHL es causado por mutaciones en el gen de VHL, que llevan a una inactivación total o parcial de su función y generan que la estabilidad de HIF-1α y HIF-2α sea independiente de los niveles de O2, generando una actividad constitutiva de HIF. La desregulación de las vías dependientes de HIF conduce a la aparición de tumores altamente vascularizados como producto de la desregulación de factores pro-angiogénicos como VEGF. En el sindrome de VHL estos tumores aparecen en el sistema nervioso central y retina (Hemangioblastomas), en la glándula adrenal (Feocromocitomas) y en el riñón (Carcinoma Renal de Células Claras o RCC), entre otros tejidos. Resulta de interés determinar los mecanismos involucrados que en la pérdida de función de las mutantes VHL que promueven el establecimiento de tumores dependientes de VHL-HIF. Nuestro grupo de trabajo aisló a la proteína RWDD3 o RSUME (RWD domain-containing protein SUMOylation Enhancer) que se induce en condiciones de estrés celular y participa a la modificación post-traduccional conocida como sumoilación. En particular, se demostró que RSUME se expresa en hipoxia (HPX) e incrementa la sumoilación de HIF-1α, aumentando su estabilidad y actividad transcripcional. En normoxia, RSUME aumenta los niveles de HIF-1α incluso al sobre-expresar VHL, indicando una posible inhibición funcional de RSUME sobre VHL. RSUME se expresa en los tejidos característicos del sindrome. Además, mayores niveles de ARN de RSUME en tumores RCC correlacionan con un peor pronóstico de los pacientes, indicando que RSUME podría ser un marcador a tener en cuenta en el desarrollo de la enfermedad. El objetivo de esta Tesis fue caracterizar el mecanismo molecular de acción de RSUME sobre el sistema VHL-HIF. En el contexto de la enfermedad VHL, el trabajo se centró en estudiar la función de RSUME en el establecimiento de tumores VHL analizando su rol y mecanismos de acción sobre la pérdida de función de las mutantes de VHL. En primer lugar, utilizando un modelo celular que carece de expresión de VHL (la línea celular RCC-786-O) determinamos que RSUME sólo afecta la estabilidad de HIF-1α y HIF-2α cuando VHL se expresa ectópicamente. RSUME bloquea la degradación de HIF inhibiendo la ubiquitinación de HIF dependiente de VHL. Confirmando que los efectos de RSUME son directos sobre la función de VHL, observamos que RSUME bloquea la degradación de otros blancos de ubiquitinación de VHL. Determinamos que RSUME y VHL interactúan sin intermediarios. En el contexto celular, RSUME forma un complejo con el dímero VHL-HIFα, que disminuye la interacción de VHL con HIF-1 y 2, y así, aumenta la estabilidad de estas últimas. Dado que RSUME es un potenciador de sumoilación, se determinó que RSUME modula positivamente la sumoilación de VHL tanto in vitro como in vivo. Sin embargo, observamos que RSUME bloquea la acción de VHL incluso cuando se inhibe la sumoilación general o se usa una mutante no sumoilable de VHL, indicando que la acción de RSUME es independiente de su efecto sobre la sumoilación de VHL. Luego, analizamos el impacto de RSUME sobre el establecimiento de la enfermedad VHL. Detectamos la expresión proteica de RSUME en muestras tumorales de pacientes VHL, confirmando un posible rol de RSUME en los tumores. Además, determinamos que, a diferencia de VHL salvaje, mutantes de VHL características de la enfermedad son incapaces de inhibir la expresión de RSUME sugiriendo un potencial mecanismo de desregulación de RSUME en el contexto tumoral asociado a VHL. En el estudio de los mecanismos de acción de RSUME, determinamos que la sobreexpresión de RSUME potencia la pérdida de función de las mutantes de VHL, evidenciado por una mayor estabilidad y actividad transcripcional de HIF-2α. RSUME actúa independientemente de su capacidad de sumoilar a las mutantes de VHL. RSUME se une a las diferentes variantes de VHL, promoviendo una disminución en su interacción con HIF-2α y en la formación del complejo ECV, aumentando la estabilidad de los blancos de ubiquitinación. Utilizando clones generados en un modelo celular de la enfermedad de VHL en los que silenciamos la expresión de RSUME, verificamos el rol crítico de RSUME en la perdida de función de VHL. Menores niveles de RSUME resultaron en una ganancia de función en VHL, lo que se tradujo en una disminución en la vascularización asociada a VEGF y en tumores más pequeños y menos vascularizados. En conclusión, estudiando la función de RSUME en distintos modelos experimentales y a través de estrategias experimentales complementarias, nuestros resultados evidencian el rol fundamental de RSUME en el síndrome VHL y proponen mecanismos moleculares para explicar la acción de RSUME sobre VHL, enfatizando que RSUME no sólo es un promotor de la sumoilación sino que –como en el caso de VHL- regula a otras proteínas a través de la formación de complejos proteicos que modifican su función.

Descripción: Las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS y RNS) se producen en distintas condiciones fisiológicas y ambientales en estrecha relación con las condiciones de aireación. Los mecanismos de defensa contra estas moléculas resultan cruciales para la supervivencia. Pseudomonas extremaustralis es una bacteria antártica con alta resistencia al estrés por lo que es un modelo de interés para el estudio de la adaptabilidad ambiental. Este trabajo explora las respuestas al estrés oxidativo y nitrosativo en distintas condiciones de aireación utilizando enfoques globales y fisiológicos en P. extremaustralis. En aerobiosis se observó la activación de las defensas antioxidantes y poco efecto del estrés generado por el H2O2 en comparación con microaerobiosis. En contraste, el estrés oxidativo en microaerobiosis provocó mayor daño a macromoléculas y menor supervivencia. Los análisis globales realizados (transcriptómica y proteómica) mostraron no solo el despliegue de respuestas a estrés tradicionales sino también la sobreexpresión de genes relacionados con otros mecanismos entre ellos la formación de biofilms, flagelos y quimiotaxis. P. extremaustralis presentó un fenotipo de hiperflagelación y mayor formación de biofilms en condiciones de estrés oxidativo en concordancia con lo observado en los análisis globales. El análisis transcriptómico también permitió identificar y clasificar posibles pequeños RNA (sRNA) con expresión diferencial entre condiciones, que podrían tener funciones regulatorias relacionadas con la disponibilidad de O2 y el estrés oxidativo. Se validaron experimentalmente 8 de estos sRNA y uno de ellos, denominado sRNA40, fue analizado mediante experimentos de expresión pulsada seguidos de análisis transcriptómicos. Estos análisis permitieron identificar 19 genes con expresión diferencial en respuesta a la sobreexpresión de sRNA40 en microaerobiosis, relacionados con sistemas de transporte o de secreción que constituirían su blanco de acción. Por último, se analizó la respuesta a estrés nitrosativo inducido por nitrosoglutatión (GSNO) en microaerobiosis, donde la supervivencia luego de la exposición a GSNO fue menor que en aerobiosis. El análisis transcriptómico mostró incremento en la expresión de diversos genes como los relacionados con la producción y el transporte de pioverdinas, el metabolismo del hierro y la síntesis de proteínas, sugiriendo un alto turnover proteico probablemente relacionado con el efecto deletéreo del GSNO principalmente sobre proteínas que contienen hierro. También se verificó la activación del catabolismo del inositol, una vía poco estudiada en Pseudomonas, que aparece como una alternativa novedosa involucrada en la respuesta en presencia de estos compuestos. En conjunto, los resultados obtenidos muestran que en condiciones microaeróbicas P. extremaustralis despliega un conjunto de mecanismos fisiológicos, adicionales a enzimas detoxificantes, frente a agentes estresantes. Estos resultados contribuyen al conocimiento de la fisiología de P. extremaustralis frente al estrés oxidativo/nitrosativo en distintas condiciones de aireación. Algunos de los resultados obtenidos pueden extenderse a otras bacterias relacionadas y pueden ser de utilidad para aplicaciones biotecnológicas por su relevancia para la supervivencia de los organismos utilizados.

Descripción: Hemos analizado los distintos modos de conducción que tienen lugar a través delaislante de puerta en estructuras Metal-Oxido-Semiconductor (MOS). En especial, por susimplicancias en las tecnologías microelectrónicas, se ha puesto énfasis en lo concerniente aldióxido de silicio (SiO2). Dependiendo del rango de voltajes y de espesores de aislanteconsiderados, el SiO2 exhibe diferentes comportamientos que requieren un estudioparticularizado. Cuando el óxido es muy delgado (<5-6nm), la corriente de túnel a altas tensionespresenta unas oscilaciones que pueden interpretarse, a partir de la mecánica cuántica, comoconsecuencia de la reflexión parcial de la función de onda electrónica en la interfaz anódicade la estructura. Nosotros hemos propuesto un modelo semi-empírico que logra captar laforma de las características de conducción en todo el rango de tensiones permitidos y paratodos los espesores en los que el fenómeno es observable. Al aplicar un estrés eléctrico, la corriente de túnel a bajas tensiones exhibe uncrecimiento anómalo que puede atribuirse a la generación de trampas en el seno del aislante. Este mecanismo de conducción se denomina SILC (stress-induced leakage current). Por otrolado, para óxidos más gruesos (>10nm), es posible detectar un cambio en el estado de cargadel aislante a partir del desplazamiento de la curvas características capacidad-tensión ycorriente-tensión. Hemos propuesto una sencilla modificación de la expresión que se utilizahabitualmente para la corriente de túnel Fowler-Nordheim, la cual permite dar cuenta dedicho comportamiento. Finalmente, se presenta una ampliación de un modelo de conducción que permiteexplicar de manera consistente los dos modos de ruptura (SOFT y HARD) que tienen lugaren óxidos ultra-delgados. El modelo se basa en la física de los sistemas conductoresmesoscópicos y las propiedades de transmisión de los denominados contactos puntualescuánticos. Hasta ahora, este es el único modelo analítico disponible que puede explicarnumerosos hechos experimentales relacionados con el fenómeno bajo estudio.

Descripción: El objetivo del presente trabajo fue analizar diferentes mecanismos que modulan laacidificación tubular proximal utilizando dos estrategias: a) la modificación aguda de laviscosidad del fluido peritubular y b) la inhibición crónica del sistema renina-angiotensina (SRA). Se ha informado que el óxido nítrico (NO) estimula la acidificación tubular proximal. Dado que el shear stress es un agonista de la liberación de NO, y que el grado de shear stresses proporcional a la viscosidad (η) de la solución, evaluamos el efecto de aumentos en η de lasolución perfusora peritubular (SPP: Ringer HNaPO42- 20 mM, pH 7.4) sobre la acidificaciónluminal del túbulo contomeado proximal (TCP). Se realizaron experimentos de micropunturacon perfusión luminal y peritubular simultáneas. Se midieron los cambios en el pH de unagota de Ringer HNaPO4- 20mM (pHt=0:7,4) ubicada en el lumen del TCP por medio de unmicroelectrodo de resina sensible a H+. La viscosidad de la SPP se incrementó por elagregado de dextran neutro (P.M.: 300.000-400.000). Dado que aumentos en el shear tressinducen la liberación de ATP, se evaluó el efecto de ATP (10^-5 M) agregado a la SPP deviscosidad normal. La viscosidad aumentada indujo un aumento en el flujo de H+ (JH+)(85%y 97% con aumentos en η de 30% y 50% respectivamente, sobre el control). Este efecto fueabolido cuando se agregó el inhibidor de la síntesis de NO Nω-nitro-L-arginina (L-NNA, 10^-4 M) o los antagonistas de receptores purinérgicos suramin (10^-4 M) y reactive blue 2 (RB2, 3x10^-5 M). La adición de L-arginina 5x10^-3 M, a la SPP de alta viscosidad conteniendo L-NNA,recuperó el efecto estimulatorio de la alta viscosidad. El ATP indujo un aumento del 80% en JH+ y este efecto se bloqueó con L-NNA. Nuestros resultados sugieren que cambiosen η (y consecuentemente en el shear stress) modularían la secreción proximal de de H+, almenos en parte, a través de la liberación de NO dependiente de ATP desde las célulasendoteliales de los capilares peritubulares. Los cambios en la viscosidad de la sangre quecircula por la arteriola eferente y los capilares peritubulares, debidos a la filtraciónglomerular, podrían participar en el control normal de la reabsorción tubular (es decir, en elcontrol del balance glomérulo-tubular), además de los ya descriptos factores fisicos (presionesoncótica e hidrostática) La segunda parte de este trabajo se centró en el estudio del efecto de la inhibición crónicadel SRA sobre la acidificación tubular proximal y de los mecanismos involucrados en tal efecto, haciendo énfasis en la interacción del SRA con el NO. Se utilizó un protocolo deadministración crónica de enalapril, un inhibidor de la enzima convertidora de laangiotensina, y losartan, un antagonista de los receptores de tipo ATI para la angiotensina II (10 mg*Kg^-1xdía^-1 durante tres meses, en la bebida). Mediante experimentos de micropunturase determinó que el JH+aumentó 52% en los tratados con losartan y 87% en los animalestratados crónicamente con enalapril, comparados con animales sin tratamiento. La inhibiciónde la síntesis de NO con L-NNA (15 mg/kg, IV) durante el experimento, previno los efectosestimulatorios de losartan y enalapril sobre JH+.La actividad de síntesis de NO (NOS) sedeterminó mediante el dosaje de [14C]-L-citrulina formada a partir de [14C]-L-arginina. Loshomogenatos de corteza renal de animales tratados crónicamente con losartan y enalaprilpresentaron un aumento en la actividad de NOS de 41% y 46% con respecto al control,respectivamente. Estos resultados sugieren que el efecto estimulatorio del enalapril y dellosartan sobre la secreción proximal de H+ podría estar mediado, al menos en parte, por NO. La inhibición crónica del SRA no modificó los niveles de la isoforma inducible de la sintetasade óxido nítrico (iNOS), indujo un aumento en la abundancia de la isoforma endotelial (eNOS) y una disminución en la expresión de la isoforma neuronal (nNOS). Este resultadosugiere que las diferencias en la actividad de NOS observadas entre los grupos experimentalespodrían deberse, en parte, a la variación en el nivel de expresión de la eNOS. Por otra parte, lainhibición crónica del SRA, indujo un aumento en los contenidos de NHE-3 y la H+-ATPasaen membrana apical, analizados por westem blot en vesículas aisladas de ribete en cepillo. Estos resultados sugieren que el efecto estimulatorio de esas drogas sobre la acidificaciónproximal podría depender, al menos en parte, de los niveles de expresión de dichostransportadores en membrana apical. Por lo tanto, la inhibición crónica del SRA afectaría a laacidificación proximal mediante al menos dos mecanismos: un aumento en la disponibilidadde los transportadores involucrados y la estimulación del intercambio Na+/H+ apicaldependiente de la síntesis de NO. En resumen, este trabajo muestra que los mecanismos de control de la acidificación tubularproximal en respuesta al shear stress peritubular y a la inhibición crónica del SRA involucranla síntesis de NO, probablemente en el endotelio de los capilares peritubulares y/o de laarteriola eferente, y la interacción paracrina endotelio — epitelio.

Descripción: El homólogo de HIF-α en Drosophila melanogaster, Sima, está localizado principalmente en el citoplasma en normoxia y se acumula en el núcleo en hipoxia. A lo largo de esta tesis hemos caracterizado el mecanismo que regula la localización subcelular de Sima. Encontramos que Sima presenta un movimiento continuo entre el núcleo y el citoplasma, el cual depende de los niveles de oxígeno, de parámetros del desarrollo y del receptor de exportación nuclear CRM1. La importación nuclear depende de una secuencia de localización nuclear (NLS) bipartita atípica que mapea en la región C-terminal de la proteína. Identificamos una señal de exportación nuclear (NES) dependiente de CRM1 dentro del ODDD (dominio de degradación dependiente de oxígeno) de Sima que media su exportación hacia el citoplasma. Determinamos además que la hidroxilación dependiente de oxígeno de una prolina específica (P850) dentro del ODDD y el factor supresor de tumores de Von Hippel-Lindau (VHL) son necesarios para la exportación nuclear de Sima por parte de CRM1. Proponemos que la localización subcelular de HIFα/Sima es el resultado de un equilibrio dinámico entre importación y exportación nuclear, estando la exportación nuclear regulada por la tensión de oxígeno. Estos resultados en conjunto permiten postular que la maquinaria involucrada en la degradación de HIF-α/Sima es también necesaria para la regulación de su localización subcelular. Proponemos además que la localización subcelular de HIF-α/Sima es el resultado de un equilibrio dinámico entre importación y exportación nuclear, estando la exportación nuclear regulada por niveles de oxígeno.

Descripción: En poblaciones vegetales de alta densidad, es de vital importancia para las plantas ajustar sucrecimiento y desarrollo en respuesta a señales lumínicas percibidas por proteínas fotorreceptoras. Estos fotorreceptores actúan percibiendo cambios cualitativos y cuantitativos de la luz en loscanopeos, y activan varias vías de señalización cuyas respuestas tienen consecuencias importantespara la interacción de las plantas entre sí y con otros organismos. En esta tesis se abordó el estudiode cómo las bajas relaciones Rojo/Rojo Lejano (R/RL) o la disminución de la luz azul, querepresentan señales de competencia (futura o presente), desencadenan respuestas adaptativasfundamentales asociadas con la habilidad competitiva y la capacidad de defensa. La inactivación delfitocromo B (phyB) por bajas relaciones R:RL, es el evento principal que activa el Síndrome de Escape al Sombreado (SAS), aún en situaciones en las que las plantas no han sido efectivamentesombreadas por plantas vecinas. Cuando la sombra es efectiva, en canopeos de mayor área foliar,también disminuye la cantidad de luz azul, aunque las consecuencias fisiológicas de este cambio enel ambiente lumínico son menos conocidas. Experimentos fisiológicos y genéticos llevados a caboen esta tesis, empleando Arabidopsis thaliana, demuestran que la disminución de la irradiancia deluz azul es suficiente para activar el típico crecimiento elongado del SAS, y que el fotorreceptorinvolucrado en esta respuesta es el criptocromo 1 (cry1). A su vez, se encontró que la vía deseñalización reclutada por la inactivación de cry1 en las respuestas SAS, requiere de PIF4 y PIF5,pero que a diferencia de la vía de señalización del SAS disparada por la inactivación del phyB, norequiere TAA1. Otro fenómeno común en ambientes lumínicos que conducen a la inactivación dephyB es la atenuación en la producción de defensas anti-herbívoro o contra microorganismospatógenos. Este fenómeno es en parte una consecuencia de la pérdida de sensibilidad de los tejidosa la hormona de defensa ácido jasmónico (JA). Los mecanismos moleculares involucrados podríanser varios, y en esta tesis se estudió el rol de la proteína JAZ10, represora de la vía de JA, en elmecanismo que vincula la inactivación del phyB con la reducción en la sensibilidad a JA. Seencontró que el RL actúa estabilizando a JAZ10, lo que explica, al menos en parte, porqué lasdefensas están atenuadas cuando phyB es inactivado. Existe un creciente interés en comprender losmecanismos que permiten a las plantas activar respuestas adaptativas al enfrentar, en formasimultánea, un conjunto de factores de estrés, como la competencia con otras plantas y los ataquesde organismos heterótrofos. Los resultados obtenidos en esta tesis aportan elementos de importanciapara entender las bases fisiológicas de algunas de estas respuestas. Este conocimiento, desarrolladoen Arabidopsis como especie de referencia, podrá emplearse en el futuro para el desarrollo decultivos que, por ejemplo, expresen sistemas de defensa robustos en un amplio rango de densidadesde siembra.

Descripción: El objetivo principal de este trabajo de tesis ha sido el estudio de losmecanismos de defensa del girasol frente a la podredumbre basal causada porel hongo Sclerotinia sclerotiorum. El sistema experimental estuvo constituído por distintos estadios delciclo de vida del hospedante que exhiben diferencias en su susceptibilidadal ser inoculadas con el hongo. La determinación de dicho sistema implicó larealización de curvas de susceptibilidad en función de la edad bajo dos condicioneslumínicas: 12 y 16 horas de luz diaria. Las edades estudiadas fueron:estadio vegetativo (I); botón floral cerrado (II) y botón floral abierto (IV). El estudio se llevó a cabo a través del desarrollo de dos líneas principalesde trabajo: un estudio del estado nutricional del hospedante previo a suinoculación, el análisis de mecanismos de defensa bioquímicos y mecánicos prey postinfeccionales. La primera incluyó un análisis global de ciertos factores nutricionales quepodían gravitar tanto como factores predisponentes o de resistencia: contenidode azúcares totales, de aminoácidos libres y de calcio en las zonas basales detallos sanos de diversas edades. La segunda se inició con estudios preliminares acerca del efecto de diversos extractos de tallos sanos e inoculados de girasol sobre el crecimiento micelial (CM) y la formación de esclerocios in vitro. Ciertas evidencias sugirieronla relación de los compuestos fenólicos con los efectos inhibidores detectados. Esto llevó a la decisión de profundizar en el papel de estos compuestosen la defensa. Para ello se realizaron estudios cuali y cuantitativos de losfenoles en tallos sanos e inoculados de las diversas edades. Se aisló, identificóy cuantificó el compuesto de mayor actividad antifúngica. Se determinó laconcentración necesaria para producir una inhibícíón del 50% in vitro (Cl 50). Como complemento se estudió la localización anatómica por medio de métodoshistoquímicos y de autoflorescencia, de los fenoles en cortes transversalesde tallos, a fin de conocer si esta coincidía con las zonas de infección. El análisis de los mecanismos mecánicos consistió en un estudio de laanatomía del tallo sano según la edad del hospedante al inocular. Esto permitióconocer el estado de diferenciación del sistema vascular en cada estadío. Mediante reactivos histoquímicos se tuvo una idea de la proporción de loselementos lignificados e intensidad de la lignificación. El cálculo de los volúmenesde los distintos tejidos según la edad permitió elaborar una hipótesisacerca de la presencia y cantidad relativa de los mismos como factor de toleranciao susceptibilidad. Los resultados obtenidos permitieron concluir que existen diferencias genotípicaspara la susceptibilidad las que exhiben su máxima expresión en el estadiode botón floral cerrado (II). Se corroboró que dicha expresión a su vez aumentaal disminuir la cantidad de horas de luz bajo la que crecen las plantas. Por ello, las diferencias en susceptibilidad se deberían al menos a los dostipos de mecanismos: bioquímico y mecánico. Dentro del primero se destacó laacumulación del ác. isoclorogénico por encima de umbrales inhibitorios en losestadios tolerantes o individuos tolerantes dentro del estadio de máxima susceptibilidad. Asimismo se acumularon en los tolerantes ésteres fenólicos no inhibidoresper se, pero cuyas agliconas provocaron efectos tóxicos sobre el CM. Lalocalización periférica de los fenoles coincidente, con las zonas de infecciónconstituye una evidencia más a favor de la relación de estos compuestos con latolerancia. Con respecto a los factores mecánicos, la presencia de un anillo contínuode elementos lignificados así como un mayor volúmen de los misnos, se consideraun elemento complementario para retardar el avance fúngico en los estadios másadultos. Sumado a este mecanismo de naturaleza preinfeccional, la impregnaciónde ciertas paredes celulares con ésteres de ácidos fenólicos como consecuenciade la infección constituiría un factor de tolerancia adicional al dificultarla degradación de las paredes del hospedante. Los mecanismos bioquímicos incluirían compuestos de otras naturalezas que nohan sido estudiados (efecto inhibidor de extractos clorofórmicos en tallos inoculadosde edad IV). El ácido isoclorogénico resultó el compuesto fenólico más abundante en girasolestolerantes cultivados a campo y en tallos inoculados de H. tuberosus (especietolerante a S. sclerotiorum). Ninguno de los componentes de defensa sería por sí solo responsable de la tolerancia,sino que esta surgiría de un adecuado balance de los mismos no soloen magnitud sino también en tiempo de aparición y velocidad de desarrollo.

Descripción: Los artrópodos, en especial los insectos y crustáceos, son animales muy activos que poseen repertorios comportamentales altamente complejos, la mayoría de los cuales se encuentran guiados por la información visual. Así, la interacción entre el sistema visual y motor es fundamental en una variedad de funciones como por ejemplo: tener buenos sistemas de navegación, escape, detección e identificación de predadores, presas y coespecíficos, etc. Dentro de esta gama de comportamientos, esta tesis estudia el funcionamiento del sistema de escape del cangrejo Chasmagnathus granulatus frente a los estímulos de colisión. Para esto, desarrollamos un dispositivo que mide la respuesta locomotora del animal cuando se aplican estímulos visuales generados por computadora. Con este dispositivo caracterizamos la respuesta de escape de Chasmagnathus a estímulos que simulan colisiones de objetos que se acercan al cangrejo a velocidad constante. Medimos la respuesta motora del animal variando distintos parámetros del estímulo como ser: la velocidad de aproximación, el tamaño del objeto, la dirección de acercamiento y el contraste respecto al fondo. Encontramos que la respuesta de escape es compleja y está compuesta por una secuencia de fases encadenadas, es altamente direccional y la velocidad del animal es controlada instantáneamente por la entrada visual. Analizamos el comienzo del escape y encontramos una variable que lo predice. Luego de la caracterización comportamental, pasamos a describir la respuesta de las Neuronas Gigantes de la Lóbula (neuronas LG). Mostramos que las neuronas MLG1 y MLG2 (Monostratified Lóbula Giant Neuron 1 y 2) y BLG1 (Biestratified Lóbula Giant Neuron 1) responden preferencialmente a estímulos que representan colisiones de objetos y codifican la dinámica de expansión temporal de los estímulos. Mostramos que la tasa de disparo de las neuronas MLG1 y BLG1 codifican la velocidad angular del estímulo y que las neuronas MLG2 codifican la aceleración angular. Por otro lado, las neuronas BLG2 (Biestratified Lóbula Giant Neuron 2), codifican una información cualitativamente distinta a las tres neuronas anteriores respondiendo principalmente el comienzo y la finalización de la expansión. Una vez medidas las respuestas comportamentales y neuronales, analizamos la posibilidad de predecir el comienzo del escape en función de la actividad de las neuronas LG y encontramos un criterio que usa información de dos neuronas que correlaciona con el mismo. Finalmente, desarrollamos un modelo simple que usando la tasa de disparo de las neuronas LG, predice la velocidad de los animales durante el escape.

Descripción: La escisión precisa del transposón Tn10 se tomó como sistema modelo parael estudio de la generación de deleciones que ocurren entre secuencias cortas de ADNduplicadas que limitan a secuencias palindrómicas. Este tipo de estructura generafrecuentemente deleciones en bacterias y en organismos superiores. El transposón Tn 10 es un elemento genético de 9,3-Kb con extremos repetidosinvertidos de 1,5-Kb que duplica secuencias de 9-pb de la molécula aceptora durantesu inserción en el genoma. La escisión precisa de Tn10 es un evento independiente dela transposición, que se produce por la eliminación de todas las secuencias deltransposón junto con una copia de la secuencia repetida de 9-pb. La frecuencia deescisión precisa de Tn10 varía drásticamente con el sitio de inserción entre 10-6 a 10-8 por elemento por generación. En este trabajo se observó que la frecuencia de escisión precisa de Tn10,desde distintos sitios del genoma de Salmonella typhimurium y de Escherichia coliincrementa hasta 50 veces por la acción de la mitomicina C y Ia irradiaciónultravioleta. Con el objeto de dilucidar los mecanismos involucrados en la inducción de estefenómeno, se analizó la frecuencia de escisión precisa de Tn 10, luego de irradiaciónultravioleta o tratamiento con mitomicina C, en bacterias con mutaciones en genes dereparación del ADN. Los experimentos realizados con Salmonella typhimurium indicaron que elincremento en Ia frecuencia de escisión precisa de Tn10 luego de la irradiaciónultravioleta es independiente de la reparación por escisión de dímeros (sistema UvrABC) y dependiente de alguna función de la proteína RecA, ya que no se evidenciaen mutantes recA. Los experimentos realizados con la mutante topA y con elplásmido pKM101 sugirieron que la inducción de la escisión precisa de Tn10 ocurrepor mecanismos distintos a los involucrados en la inducción de mutaciones puntuales. Se continuaron los estudios en cepas de Escherichia coli con mutaciones engenes del sistema SOS. Los resultados obtenidos con la mutante lexA3 (ind-), que esdefectiva en la inducción del sistema SOS, demostraron que es necesaria la expresiónde algún gen de este sistema para que se incremente la frecuencia de escisión luegode irradiación ultravioleta. Experimentos realizados en mutantes laxA3 (ind-)portadoras de un plásmido ptac-recA (gen recA regulable por IPTG) indicaron quecantidades aumentadas de proteina RecA no son suficientes para que se produzca lainducción en condiciones de represión de los demás genes SOS. Con el fin de identificar el o los genes SOS responsables del aumento en lafrecuencia de escisión luego de irradiación ultravioleta, se analizó la inducción en cepasdefectivas en el procesamiento mutagénico SOS y en cepas defectivas en la reparaciónrecombinacional. Los experimentos realizados con mutantes umuC nulas, recA727 y el plásmidopKMlOl demostraron que los mecanismos involucrados en la inducción de la escisiónprecisa de Tn10 son distintos a los involucrados en la inducción de la mutaciónpuntual. Los experimentos realizados con las mutantes recN, ruvA y ruvB indicaron queestos genes, que participan en la reparación recombinacional o postreplicativa del ADN, intervienen en el proceso en estudio. Los experimentos realizados con las mutantes recBC sbcB y recF, indicaronque los genes recBC o sbcB y recF también podrían estar involucrados en formadirecta o indirecta en el proceso de inducción de la escisión precisa de Tn10. Con el fin de comparar los resultados obtenidos sobre el comportamiento de laescisión precisa de Tn10 con los de un elemento genético similar pero de menortamaño se utilizó un minitransposón de 1,8 Kb (mini-Tn10 Km). Se observó que la frecuencia de escisión de mini-Tn10 km incrementa hasta 10 veces por Ia acción de la mitomicina C y Ia irradiación ultravioleta. Experimentos realizados con mutantes lexA3 (ind-), defectivas en la induccióndel sistema SOS, indicaron que la inducción de la escisión de mini-Tn10 Kmdepende de la expresión de este sistema. Experimentos realizados con mutantes recN y ruvB indicaron que en elincremento de la escisión de mini-Tn10 Km están involucrados genes de reparaciónrecombinacional o postreplicativa. En conclusión, los resultados presentados en este trabajo demuestran que elincremento en la frecuencia de escisión de Tn10 y de mini-Tn10 luego de irradiacrónultravioleta depende de la expresión del sistema SOS y en particular de genesinvolucrados en la recombinación y reparación postreplicativa, tales como recN, ruvAy ruvB. Las mutaciones recN262, ruvA60 y ruvB52 no anularon completamente lainducción de la escisión, lo cual sugiere que varios mecanismos diferentesintervendrían en el proceso en estudio y/o que existe un cierto grado de redundanciaen las actividades de los genes involucrados.

Descripción: En este trabajo se estudiaron las anomalías inducidas por la diabetes materna en el embrión y en la decidua de rata en el período de organogénesis temprana, así como también el efecto de la administración de agonistas de receptores activados por proliferadores peroxisomales (PPARs) administrados en la dieta y/o de ácido fólico sobre dichas anomalías. Se encontró una disminución en el crecimiento embrionario y un incremento en las tasas de reabsorción y malformación embrionaria en las ratas diabéticas y se observaron disminuciones en los niveles de PPARδ tanto en los embriones como en las deciduas provenientes de ratas diabéticas. Además, se observaron en estos tejidos alteraciones en el metabolismo del ácido araquidónico, en la producción de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno y en la actividad y expresión de enzimas responsables de la remodelación tisular inducidas por la diabetes. Las dietas suplementadas con aceites ricos en agonistas de PPARs administradas a las ratas diabéticas gestantes revierten parcialmente las anomalías en el crecimiento embrionario y la tasa de malformación embrionaria. El mecanismo de acción involucra la regulación de la producción de prostaglandinas, la reducción del estrés oxidativo y nitrativo y la regulación de la actividad de las MMPs y TIMPs en el embrión y en la decidua diabética. El tratamiento consistente en la administración de ácido fólico junto a la dieta enriquecida en aceite de cártamo administrado a las ratas diabéticas logra una reversión total de las malformaciones embrionarias regulando el entorno pro-inflamatorio inducido por la diabetes y previniendo anomalías de enzimas involucradas en la remodelación de la matriz extracelular tanto en el embrión como en la decidua de rata diabética. Estos hallazgos nos permiten destacar a los tratamientos enriquecidos en aceites de oliva y cártamo (capaces de activar PPARs) y con folatos como eficaces reguladores del daño inducido por la diabetes materna, resultados de interés en la búsqueda de tratamientos plausibles de ser aplicados a la gestación humana.

Descripción: En esta Tesis Doctoral se abordó el estudio de la regulación funcional del citocromo c (Cyt); una hemoproteína multifuncional que se comporta como transportador electrónicomitocondrial y como enzima lipoperoxidasa en la activación de la muerte celular. Considerandosus funciones tan disímiles es de esperar que esta proteína esté fuertemente regulada,sin embargo el Cyt no forma parte de ninguna cadena de señalización. Para estudiarlos factores que determinan su función se emplearon métodos espectroscópicos, electroquímicosy computacionales. Se investigaron los cambios de la estructura y función del Cytdebidos a la presencia de concentraciones fisiológicamente relevantes de especies reactivasde nitrógeno y oxígeno (NOS y ROS) y a la formación complejos con sistemas miméticosde sus receptores naturales. En primer lugar, se investigó el efecto de la adsorción sobresuperficies de distinta naturaleza química; concluyendo que el Cyt se adsorbe sobrelípidos zwiteriónicos y aumenta su reactividad frente a ROS, en particular peróxido dehidrógeno. Esta especie oxida específicamente al ligando axial del hemo del Cyt cuando seencuentra unido a estos lípidos, dando como producto una peroxidasa estable. Por otrolado, se caracterizó el cambio estructural promovido por el tratamiento del Cyt con peroxinitrito. Se observó que la nitración de una de las tirosinas desencadena su deprotonaciónque está acoplada a un cambio de ligando Met/Lys, resultando en un aumento de actividadperoxidasa. Finalmente, se estudió como ambas modificaciones postraduccionales afectanla interacción con la cardiolipina y determinan la actividad del Cyt como enzima lipoperoxidasa. El conjunto de los resultados obtenidos sugieren que la regulación de la función alternativadel Cyt tiene un mecanismo cuyos actores principales son las interacciones con loslípidos de la membrana y las modificaciones postraduccionales debidas al estrés nitrooxidativo.

Descripción: La esquistosomiasis continúa siendo una de las enfermedades parasitarias con mayor prevalencia en el mundo. En la esquistosomiasis causada por S. mansoni, los huevos de los gusanos helmintos desencadenan un proceso de inflamación ganulomatosa hepática con desarrollo de fibrosis que esta mediado por linfocitos T CD4+ específicos para los antígenos del huevo (SEA). En el modelo murino de la enfermedad, los ratones de la cepa CBA desarrollan alta patología caracterizada por granulomas grandes y una pronunciada respuesta de linfocitos T hacia el SEA, mientras que los ratones de la cepa BL/6 desarrollan baja patología con granulomas de tamaño significativamente menor y una respuesta más atenuada de linfocitos T. En la fase aguda de la enfermedad en ambas cepas se desarrolla una respuesta de citoquinas del tipo Thl. Sin embargo, en el transcurso de la fase crónica se observa una respuesta combinada de citoquinas Thl/Th2 en los ratones de la cepa CBA, mientras que en los ratones de la cepa BL/6 la respuesta de citoquinas se polariza hacia una del tipo Th2. Los experimentos que se describen a continuación se realizaron con el fin de investigar cómo el ambiente de citoquinas, la apoptosis de los linfocitos T CD4+ y los mecanismos de coestimulación influyen el desarrollo de la inmunopatologia inducida por los huevos en el modelo murino de la infección con esquistosoma y sus consecuencias en la enfermedad. l. Se usó un modelo artificial de alta patología producido por la inmunización de ratones BL/6 con SEA en adyuvante completo de Freund (CFA) para estudiar el papel de las respuestas de citoquinas del tipo Thl vs. Th2 en el desarrollo de la inmunopatologia. Los resultados mostraron que la inmunización con SEA/CFA indujo un cambio en la producción de citoquinas hacia un perfil Thl por una población numéricamente estable de linfocitos T CD4+ específicos para el SEA que se correlacionó con una cxacerbación grave de la inmunopatologia y con la muerte prematura de los ratones. 2. Se estudiaron el papel de la apoptosis de linfocitos T CD4+ en el desarrollo de la inmunopatologia y el posible mecanismo inductor de este tipo de muerte celular comparando varios parámetros inmunológicos relacionados con los linfocitos T CD4+ entre las dos cepas de ratones polares, CBA y BL/6. Los resultados demostraron que la apoptosis de linfocitos T CD4+ de los granulomas y de los ganglios linfáticos mesentéricos (GLM) fue más elevada en la cepa de baja patología BL/6 que en la cepa de alta patología CBA como consecuencia de la falta de producción de la IL-2. El tratamiento in vivo de los ratones BL/6 con lL-2 recombinante resultó en un aumento de la patología hepática y una disminución de la apoptosis de linfocitos T CD4+. 3. Finalmente, se examinó el papel del mecanismo ICOS-B7RP-l (coestimulador inducibleproteína-l relacionada a B7) en el desarrollo de la inmunopatologia por medio del tratamiento de ratones BL/6 infectados con un anticuerpo monoclonal (AcMo) que bloquea a ICOS. Los resultados mostraron que el sistema de coestimulación ICOS-B7RP-l ayuda principalmente a controlar la producción de IFN-γ por linfocitos T específicos para el SEA y así promover un ambiente de citoquinas Th2 que lleva a limitar el daño hepático en la cepa de baja patología BL/6. Estos hallazgos contribuyen a nuestro conocimiento de los mecanismos que regulan la respuesta inmune en la esquistosomiasis murina. Ellos proveen nuevas evidencias de cómo los linfocitos T CD4+ regulan la inmunopatologia, confirmando que el establecimiento de un ambiente de citoquinas del tipo Th2 se correlaciona con la protección hacia esta infección por helmintos y que la apoptosis es un mecanismo para controlar los linfocitos T CD4+ que median la inmunopatologia. Los resultados presentados en esta tesis podrían ser utilizados para diseñar e implementar estrategias que resulten en un mejoramiento general de la inmunopatologia asociada con la enfermedad.

Descripción: Mecanismos de Interacción en Proteínas Intrínsicamente Desordenadas Las Proteínas Intrínsecamente Desordenadas (IDPs, del inglés Intrinsically Disordered Pro-teins) desafían el dogma de la Biología Molecular en cuanto no poseen una estructuratridimensional definida en solución y entonces se desdibuja la relación estructura-función,al menos como ha sido definida hasta el momento. Estas proteínas no se comportan comoestructuras tipo random coil, sino que uctúan entre variedad de conformacionesque dependen de cada sistema. Se ha predicho que al menos el 30% de las proteínaseucariotas son IDPs o tienen al menos un dominio que es intrínsecamente desordenado. Esto ha aumentado el interés por estas proteínas y su estudio se ha incrementado enlas últimas dos décadas, mostrando que cumplen procesos celulares clave, como ser enel ciclo celular. En esta tesis se estudiaron diversos sistemas que involucran a Proteínas Intrínsecamente Desordenadas. En el sistema p53TAD/CBP estudiamos los cambios producidos en elestado unido del complejo ante modificaciones post-traduccionales y las posibles implicanciasen los mecanismos de unión/plegado. En el sistema c-myb/KIX estudiamos elmecanismo de unión/plegado, y logramos caracterizar con detalle atómico al estado detransición. Finalmente, se desarrolla un potencial de interacción electrostática para uncampo de fuerzas de grano grueso tipo Go, que se prueba en dos sistemas modelo deproteínas ordenadas y se analiza en los sistemas c-myb/KIX y pKID/KIX los efectos decarga sobre la reacción de unión/plegado. Para realizar el trabajo planteado se recurrió a diversas herramientas computacionales. Se utilizaron los programas GROMACS y AMBER para realizar dinámicas molecularescon campos de fuerza atomísticos y de grano grueso. Se realizaron modificaciones en elprograma AMBER para utilizar campos de fuerza de grano grueso. Se utilizaron ademáspaquetes académicos de análisis computacional y de cálculo de ΔΔG de binding paraexperimentos mutacionales de unión entre proteínas.

Descripción: La anemia que padecen los pacientes con insuficiencia renal crónica (IRC) terminalresulta de la convergencia de múltiples factores. Entre ellos, escasa síntesis deeritropoyetina (Epo), presencia de sustancias que deprimen la eritropoyesis y pérdida desangre durante la diálisis y por el tracto gastrointestinal. La intoxicación por aluminio (Al) de pacientes que reciben medicamentos que contienen al catión puede producir, oincluso empeorar, la anemia preexistente. El propósito del presente trabajo es explorar silas sustancias acumuladas en el plasma de pacientes con IRC inhiben la eritropoyesis yestablecer el grado de participación del Al en ese proceso de inhibición. Los resultados alcanzados señalan que los pacientes con IRC poseen un númeroadecuado de progenitores eritroides tardíos (CFU-E), células que, aisladas del entornourémico, responden normalmente a1 estímulo por Epo. En el plasma de estos pacientesexisten sustancias (PM>10 kDa) que interrumpen el desarrollo de CFU-E, pero que nomodifican el PM de las proteínas de la membrana de los glóbulos rojos. La electroforesisde estas proteínas muestra perfiles similares entre los pacientes y los individuos confunción renal normal (FRN). Algunos mecanismos de acción del Al pueden ser conocidos a través de lasexperiencias realizadas in vitro. El Al³+ es captado por las células eritroides sólo cuandoestá unido a transfenina (Tf), no desplaza al Fe³+ ya unido a Tf e inhibe el desarrollo de CFU-E si existen sitios de unión vacantes en la molécula de Tf. La inhibición ocurre enpresencia de Epo en estadios tempranos de la estimulación celular, no es anulada pormayores concentraciones de Epo o de Ca²+ y depende del compuesto de Al. El estudio de la acción del Al sobre la eritropoyesis in vivo muestra que lasobrecarga oral con 0,5 μmol Al/g peso/día durante 2 semanas, induce la inhibición deldesarrollo de CFU-E in vitro, en ratones con FRN. La sobrecarga durante 22 semanasprovoca, además, la disminución del hematocrito (Hto) y de la hemoglobina (Hb),correlación negativa entre la concentración plasmática de Epo y el Hto y disminución dela fragilidad osmótica de los eritrocitos circulantes. La administración de 1 μmol Al/gpeso/día durante 102 días a ratas con FRN provoca aumento de la concentración séricade Al y moderada inhibición del desarrollo de CFU-E. Mayores dosis de Al inducen ladisminución del Hto y la Hb, el aumento de la resistencia osmótica, el acortamiento de lavida media eritrocitaria y la acumulación ósea de Al. En ratas con IRC, se observa aumento de la concentración de Al en suero, cerebroy hueso, así como una marcada inhibición del desarrollo de CFU-E. En síntesis, el Al resulta tóxico para las células eritroides cuando la acumulaciónintracelular está favorecida. La liberación lenta desde un compartimiento profundo que loha acumulado (tejido óseo), puede derivar en una exposición endógena prolongada de lascélulas eritropoyéticas en la médula ósea y favorecer la aparición de signos de anemia. Palabras claves: insuficiencia renal crónica, anemia, toxinas urémicas, eritropoyesis,inhibición de CFU-E, aluminio, toxicidad del aluminio, acumulación tisular de aluminio.

Descripción: La Fiebre Aftosa es la enfermedad viral del ganado que mayorimpacto económico ocasiona a la Argentina, no sólo por losperjuicios directos a las especies afectadas, sino también porlas pérdidas indirectas debido al cierre de mercados deexportación que representarían ingresos de divisas para nuestropais. El principal elemento utilizado en la lucha contra estaenfermedad es la inmunización preventiva, pero la principallimitante de los inmunógenos en uso es la corta duracion de lainmunidad que confieren. Existe gran cantidad de información sobre la epidemiología dela enfermedad y la biología del virus. Sin embargo, es muy pocolo que se conoce sobre la relacion virus-huesped y su respuestainmune. El proposito de este trabajo es abordar el problema desde elotro elemento de la ecuacion epidemiológica, el huesped, ytiene como objetivo considerar los mecanismos de respuestainmune específica que el hospedador pone en funcionamientofrente a la inmunización con virus activo e inactivado. Se seleccionó un modelo murino de infección al virus de la Fiebre Aftosa por lo detallado del conocimiento que se poseesobre el sistema inmune del ratón, la posibilidad que brindaeste animal de manipular sus poblaciones celulares inmunocompetentesin vivo y la experiencia ganada en investigacionesprevias realizadas en nuestro laboratorio. Se determinó que en el modelo murino experimental, existe unacorrelación entre el nivel de anticuerpos a-VFA inducido por elvirus activo o el virus inactivado y el grado de protecciónconferido. Sin embargo, la duración de la inmunidad producidapor la infección en ratones atímicos y eutímicos es prolongadamientras que la producida por la inmunización con 0.1 μg delvirus inactivado es de corta duración. Esta diferencia en laduración de la inmunidad no es atribuible a persistencia viral. Se observó un cumportamiento diferencial del sistema inmunedel ratón en la respuesta a ambos inmunógenos: En centraposición a lo que ocurre cuando se transfierencelulas B purificadas provenientes de dadores inmunizados con VA a receptores singeneicos irradiados e infectados (Borca, M.et al,1986), las células B provenientes de dadores inmunizadoscon VI no son capacez de eliminar la infección en los ratonesreconstituldoe pero sí lo son las células totales de bazoprovenientes de los mismos dadores. El agregado, a las celulas B, de una pequeña proporción decélulas T provenientes de las mismos dadores inmunizados con VI, sirve para acortar la viremia provocada por la infección delos receptores. El virus activo se comportaría como un antígenotimo-independiente "optativo", mientras que el Virus inactivadose comportaría como un antígeno timo-dependiente típico. Estosresultados se consideran relevantes para la elaboracion devacunas anti-aftosa formuladas con inmunomoduladores quepermitan mimetizar la respuesta del virus inactivado con lainducida por el virus activo, con el objeto de lograr una mejory mas duradera inmunidad.

Descripción: Fil: Socolovsky, Susana Emilia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: El mecanismo de las reacciones de sustitución nucleofílica aromática (SNA)entre sustratos activados y aminas en solventes apróticos no polares, no ha sido, hasta el momento, debidamente elucidado. Poca atención ha merecido, también, la influencia ejercida por grupos voluminosos vecinos al centro de reacción. Con el doble propósito de investigar a) el mecanismo de estas reacciones en solventes de baja constante dieléctrica y b) el efecto ejercido por sustituyentes con considerables requerimientos estéricos (-NO2; -Br; -CH3) próximos al centro de reacción, se han estudiado en la presente Tesis, las reacciones de 4-R- y 6-R-2-nitroanisoles con diversas aminas tales como:ciclohexilamina, n-butilamina, piperidina y N-metilpiperidina en benceno y/o ciclohexano. La elección de estos sustratos se basó en la caracteristica de nucleófugo pobre del grupo metoxilo, muy poco estudiado además, en solventes no polares. Los nitrofenil-alquil-éteres son particularmente adecuados para investigar la catálisis básica por el nucleófilo en las reacciones de SNA,ya que usualmente en las reacciones de estos compuestos la ruptura del complejo intermediario es el paso determinante de la velocidad. Estas reacciones, sin embargo, no son tan simples debido a un proceso lateral de sustitución nucleofílica alifática (SN2)por el cual se rompe la unión O—metilo de los éteres, lo que conduce a la formación de los fenoles correspondientes. Los sistemas estudiados, son, por lo tanto, apropiados para investigar la competencia entre las reacciones de SNAy SN2. En la presente Tesis se realizó el estudio cinético de 2,4- y 2,6-dinitroanisol con piperidina en benceno a diferentes temperaturas y varias concentraciones de la amina, a fin de determinar la importancia del paso base catalizado en la descomposición del compuestointermediario, como así también, la influencia ejercida por los grupos nitro operando desde las posiciones orto. En la reacción de 2,4-dinitroanisol con piperidina en benceno, los procesos de SNA y SN2 ocurren con velocidades semejantes, siendo la reacción de SNA acelerada suavemente por la amina, lo cual encuadra dentro de los casos de pequeñas aceleraciones descriptos por Bunnett. En la reacción de 2,6-dinitroanisol con piperidina, en cambio, hemos observado en todos los casos que la demetilación es entre 5 y 20 veces más rápida que la reacción de SNA. La velocidad del proceso de SNA para el 2,6-dinitroanisol es alrededor de 10 veces mayor que para el 2,4-dinitroanisol, lo que es interpretado en términos de un aumento de velocidad del paso no catalizado, k2 (ec. 2). Si bien es interesante la mayor reactividad del 2,6- frente al 2,4-dinitroanisol para la SNA, más natorio es el aumento en las velocidades de SN2. Las mediciones cinéticas permiten establecer que las velocidades de demetilación para el isómero 2,6- son 1000 y 300 veces más rápidas, con piperidina y N-metilpiperidina, respectivamente, que las del 2,4-dinitroanisol. Para explicar este fenómenose ha calculado el efecto de campo ejercido por el grupo nitro desde la posición orto. El cálculo de las temperaturas isocinéticas permite concluir que el proceso de sustitución nucleofílica aromática estará favorecido frente al de sustitución alifática, a más bajas temperaturas y a mayores concentraciones de la amina. Esta es una generalización sumamenteútil que permite el control de ambos procesos al planear la sintesis de los productos de SNA a partir de los respectivos anisoles. Por otro lado, trabajando con aminas primarias, los productos de demetilación se detectaron sólo a baja concentración de amina ( <0,1 M), esto es consecuencia de la notable aceleración de las reacciones de SNA al aumentar la concentración de aquélla. Al estudia las reacciones de 2,4- y 2,6-dinitroanisol con ciclohexilamina en benceno hemos encontrado, sorprendentemente, una relación cuadrática, entre la constante de velocidad de segundo orden, kA, y la concentración de base como se muestra en las fig. 5 y 7. Este comportamiento anómalo es irreconciliable con el mecanis moconocido hasta el momento para las reacciones de SNA. Trabajos previos de otros investigadores muestran un comportamiento similar, siempre en solventes apróticos no polares como benceno, tolueno e isooctano. Estos resultados no fueron interpretados mecanisticamente y el apartamiento del comportamiento esperado fue atribuido a un efecto inespecífico del solvente. Sin embargo, si se divide cada constante de velocidad de segundo orden por la concentración de amina, y los cocientes se grafican en función de esta última se observa una dependencia lineal (fig. 6 y 8). Esto indica que se trata de cinéticas de tercer orden respecto de la concentración de la amina. En 1981, Banjoko publicó resultados similares trabajando con 2,4,6-trinitrofenil-fenil-éter y anilina en benceno, y los explicó haciendo intervenir una tercera molécula de amina en el paso base catalizado. Su mecanismo,y las ec. cinéticas derivadas de él, no se ajustan, sin embargo, a nuestros resultados, ya que como puede observarse en las figuras 6; 10 y 12 para las reacciones desarrolladas a 60°C, se obtiene una meseta para altas concentraciones de la amina, lo cual no es predecible por el mecanismo mencionado. Estas y otras evidencias discutidas en la presente Tesis descartan el mecanismo propuesto por Banjoko. Es sabido que en solventes de baja constante dieléctrica, tanto las aminas alifáticas como aromáticas, se encuentran parcialmente auto asociadas formando dimeros. En el Esquema 5 proponemos un mecanismo para las reacciones de SNA donde el dimero de la amina compite con el monómero para llevar a cabo el ataque nucleofIlico. Este mecanismo conduce a ecuaciones cinéticas que se ajustan a las expresiones de velocidad halladas experimentalmente, en la presente Tesis y en otros trabajos de la literatura. A fin de investigar la generalidad del mecanismo propuesto se estudiaron otras reacciones de SNA en donde se varió: el sustrato, el nucleófilo y el solvente. Se realizó el estudio cinético de las reacciones de 2,4- y 2,6 dinitroanisol con n-butilamina en benceno, hallándose resultados que se encuadran dentro del esquema propuesto (fig. lO y ll). Además, en la reacción de 2,4-dinitroanisol se encontró que la velocidad de reacción disminuye al aumentar la temperatura. Este poco común efecto inverso de la temperatura halla su explicación en el mecanismo propuesto, ya que la autoasociación de las aminas decrece con el aumento de la temperatura. Un efecto inverso similar se detectó en las reacciones de ambos dinitroanisoles con ciclohexilamina en ciclohexano (fig. 12Y 13). Según lo determinado por Bernasconi y Zollinger, la reacción de 2,4-dinitrofluorbenceno con p-anisidina en benceno no se ajusta al mecanismo clásico; esto fue interpretado nuevamente en términos de un efecto del medio. La misma, sin embargo, responde al mecanismo propuesto véa el dímero. Se estudió entonces, la reacción de este sustrato con o-anisidina en benceno, a fin de comparar los resultados con los hallados por Bernasconi.En todos los casos se ha hallado que la reacción es de tercer orden respecto de la concentración de o-anisidina. (fig. 20 y 21) El efecto del agregado de una segunda especie básica catalizadora, tal como la piridina, tampoco se ajusta al mecanismo conocido, para la mencionada reacción con p-anisidina. De acuerdo con este me canismo la pendiente de la correlación lineal kA vs.la concentración de piridina,[P] , debe ser independiente de la concentración de anisidina; no obstante,se encontró que ésta aumentaba al aumentar la concentnación de la amina primaria, pero este resultado no fue interpretado por sus autores en términos mecanísticos. En la presente Tesisse estudió también el agregado de piridina en la reacción de 2,4-dinitrofluorbenceno con o-anisidina con el objeto de demostrar que existe una relación lineal entre la pendiente de la correlación kA vs.[P] y la concentración de o-anisidina, tal comolo predice el mecanismo del Esquema 6, donde se hace intervenir al dímero mixto entre ambas amina: como tercera especie nucleofílica. La fig. 23 muestra que existe la dependencia mencionada. Experiencias previas desarrolladas en nuestro laboratorio (J. Chem.Soc. Perkin Trans. II, 1256 (1976)) indicaban que la reacción de 2,4-dinitroanisol y ciclohexilamina en metanol no estaba catalizada por la amina. Resultado que es muy diferente al descripto aqui, trabajando en benceno. Por lo tanto, resultó de gran interés estudiar el comportamiento de este tipo de sistemas en mezclas de benceno metanol. Si se admite la hipótesis de la intervención del dímero en benceno y que en metanol opera el mecanismo clásico, en mezclas va riables de benceno-metanol debe observarse alguna manifestación del cambio de mecanismo, si éste verdaderamente ocurre. En la reacción de 2,6-dinitroanisol con ciclohexilamina se observó un pronunciado descenso de la velocidad de reacción por el agregado de pequeñas cantidades de metanol. Esto está de acuerdo con la disminución en la concentración del dímero de la amina, (la asociación de las moléculas de amina con el metanol es un proceso más favorecido, como se ha probado termodinámica y teóricamente). Luego la velocidad aumenta al aumentar la proporción de metanol siendo el nucleófilo, en esas condiciones, el monómero de la amina. Los efectos de los grupos vecinos al centro de reacción en la SNA han sido objeto sólo de unos pocos estudios sistemáticos. En la presente Tesis se discuten los factores que afectan las velocidades y mecanismos de reacción encuadrados dentro de los llamados Consulte el resumen completo en el documento.

Descripción: Esta tesis consiste en el estudio del ciclo celular de células madre pluripotentes (CMP) en diferenciación y los mecanismos moleculares que pueden almacenar memoria de un estímulo externo. Pretende mostrar cómo existen factores hereditarios que determinan el ciclo, y estudiar los mecanismos de herencia y memoria molecular dentro de las redes de regulación génica. Se divide en 3 capítulos. El primero aborda el estudio del ciclo celular y sus fases durante el proceso de diferenciación temprana en las CMP de embrión de ratón. Estas células fueron genéticamente modificadas para fluorescer en dos colores marcando las fases del ciclo, y ser filmadas por microscopía de time-lapse. Los análisis incluyen medidas del ciclo celular a nivel de célula única, construcción de dendrogramas de linajes celulares y el diseño y aplicación de algoritmos para probar si las relaciones familiares determinan la duración del ciclo celular. El resultado principal es que, durante la diferenciación, el ciclo se acorta y las células proliferan a mayor velocidad. Además, la duración del ciclo de una célula está determinada por las células progenitoras, probando que existen factores parentales que controlan la tasa de proliferación. Sin embargo, una de las dificultades a la hora de encontrar cuáles son estos factores, encontrar candidatos y compararlos es, por un lado, la falta de cuantificadores de memoria almacenada en las redes de regulación génica y, por otro, la falta de un catálogo de mecanismos moleculares capaces de almacenar memoria. El segundo capítulo, por su parte, consiste en el desarrollo de un cuantificador matemático de la memoria molecular en redes complejas, aplicado principalmente a vías de señalización celular y redes de regulación génica, que guardan información de estímulos transitorios. Una vez definido el cuantificador, se utilizó para buscar mecanismos o motifs de 1, 2 y 3 nodos que fueran capaces de almacenar información de estos estímulos. Los resultados principales consisten en que los ciclos de retroalimentación positiva son esenciales para dar multiestabilidad y memoria a las redes. Además, las redes capaces de oscilar de manera autónoma también pueden guardar información en la fase de la oscilación. El tercer y último capítulo consiste en una serie de experimentos en las mismas células que se utilizaron en el primer capítulo. El objetivo es detectar la existencia de mecanismos capaces de almacenar memoria. Para esto, tratamos a las células con un estímulo de diferenciación transitorio y luego aplicamos el cuantificador desarrollado en el segundo capítulo. El resultado es que, luego de solo un día expuestas al estímulo de diferenciación, las células lo recuerdan y continúan con el proceso de diferenciación. Asimismo, es probable que esta memoria se deba a la existencia de alguna retroalimentación positiva entre los factores de transcripción marcadores de la pluripotencia.

Descripción: La Terapia Fotodinámica (TFD) es utilizada para el tratamiento del cáncer y otras patologías no malignas. Se basa en la administración un compuesto fotosensibilizante (FS) que se acumula selectivamente en el tejido maligno y al recibir luz de longitud de onda adecuada, éste interactúa con el O2 produciendo especies reactivas del oxígeno (ROS), que son altamente tóxicas y desencadenan la muerte celular. La administración exógena del ácido 5-aminolevúlico (ALA), precursor biológico de la síntesis de los tetrapirroles, induce la acumulación de protoporfirina IX (PpIX), el único FS endógeno. En la erradicación de tumores mediante TFD intervienen diferentes procesos de muerte celular, los que incluyen apoptosis, necrosis, y autofagia. En el presente trabajo se estudiaron los mecanismos que llevan a la muerte celular por TFD basada en ALA en células de adenocarcinoma de pulmón humanas (A549) cultivadas de modo convencional -en monocapa- o en esferoides multicelulares (EMCs, agregados celulares compactos que desarrollan gradientes de nutrientes y oxígeno), y en una variante resistente derivada mediante sucesivos ciclos de tratamiento fotodinámico y recuperación. La acumulación de PpIX a partir de ALA aumentó con el tiempo de incubación y la concentración de ALA hasta alcanzar un plateau con 1 mM tanto en monocapas como en EMCs. Estudios de microscopía confocal indicaron que las mitocondrias son el principal sitio de localización de PpIX endógena pero no de PpIX administrada exógenamente, la cual se localiza en la membrana plasmática. Los EMCs presentaron una capacidad de síntesis de PpIX similar a las células en monocapa, mientras que en células resistentes se observaron niveles menores de acumulación. La TFD-ALA reduce significativamente la supervivencia celular de manera dosis lumínica dependiente aunque en menor medida tanto en células resistentes como en EMCs. La TFD-ALA induce en las células la generación de ROS tales como ¹O2, O2ֿ y peróxidos, en células en monocapa pero no en EMCs; y esa producción puede ser modulada por agentes antioxidantes de alto grado de protección como el ascorbato y el trolox, con un consecuente aumento en la viabilidad celular. Se observaron eventos asociados a apoptosis 1 h luego de la TFD: reducción del tamaño celular, irregularidades en la membrana plasmática, condensación de la cromatina, despolarización de la membrana mitocondrial, liberación de citocromo c al citoplasma, externalización de fosfatidilserina y activación de caspasa-3. En cambio, tanto en EMCs como en células resistentes se observó una reducción notable en la producción de ROS y en los parámetros de apoptosis. Por otro lado, en todos los casos se hallaron indicios de un proceso autofágico, caracterizado por la formación de vacuolas de doble membrana y la detección de LC3-II, así como la expresión de la proteína antiapoptótica Bcl-2. La activación del factor nuclear NFκB únicamente se halló en células tratadas con dosis bajas de TFD, mientras que las células resistentes mostraron presencia de este factor en el núcleo en todos los tiempos de irradiación, de manera creciente. Los resultados obtenidos en este trabajo permiten determinar que los mecanismos de muerte celular post-TFD ocurren principalmente por la vía apoptótica intrínseca, pueden ser modulados por agentes antioxidantes, y coexisten con procesos autofágicos. Por otro lado, el modelo de EMCs es más adecuado para el estudio de los efectos de la TFD-ALA respecto de la monocapa, ya que simula la estructura de microtumores avasculares y refleja características histológicas como la secreción de mucopolisacáridos y la expresión del factor inducido por hipoxia (HIF1-α). La autofagia es el mecanismo principal de respuesta a TFD en células resistentes, las cuales a su vez incrementan mecanismos de sobrevida como la activación de NFκB. Estos son factores condicionantes de la eficacia del tratamiento a considerar al aplicar TFD repetidamente en el tratamiento de tumores y al emplear agentes antioxidantes para minimizar el fotodaño a tejidos no tumorales.

Descripción: Los seres humanos han colonizado gran parte de los ecosistemas de la Tierra, lo que ha conllevado a una progresiva modificación de losambientes naturales. La urbanización del medio es un casoparticularmente drástico de modificación del hábitat en la que lamayoría de las especies no logran persistir. Sin embargo, muchas deellas son capaces de adaptarse a estos nuevos entornos e inclusoprosperar exitosamente, volviéndose muchas veces más abundantesque en los entornos rurales. Este escenario ha generado un interéscreciente en comprender cuáles son los procesos y mecanismosimplicados en la colonización exitosa de los hábitats urbanos, así comolos costos y beneficios derivados de ésta. La Lechucita de las Vizcacheras (Athene cunicularia) es una pequeña ave rapaz que sedistribuye a través del continente americano, donde muestra diferentestendencias poblacionales. Mientras que en el hemisferio norte lapérdida de hábitat, sumado a otras amenazas, ha llevado a ladisminución de sus poblaciones, en el hemisferio sur es una especiefrecuente que habita ambientes naturales, semi-naturales yurbanizados. En esta tesis se presentan los resultados de un estudio alargo plazo de una población de Lechucita de las Vizcacheras en laciudad de Bahía Blanca y en los alrededores rurales que la circundan. El seguimiento de la población se realizó mediante la captura y marcajede los individuos, tanto en áreas urbanas como rurales. Este marcajepermitió estimar tanto parámetros demográficos (fundamentalmentesupervivencia y productividad), así como estimadores fisiológicos con elfin de determinar los costos y beneficios de la ocupación de ambientesurbanos. Los objetivos de esta tesis fueron: 1) evaluar la selección de hábitat de reproducción de la especie teniendo en cuenta ladisponibilidad de ambientes naturales y urbanizados, 2) analizar larespuesta al estrés a largo plazo en individuos urbanos y rurales,evaluando su relación con la eficacia biológica de los individuos enambos ambientes, y 3) comparar los parámetros demográficos de laespecie (supervivencia, éxito reproductivo, productividad), teniendo encuenta la dispersión de los individuos entre hábitats. Los resultadosindican que la liberación de depredadores que se produce en ambientesurbanos (menor riqueza y abundancia de depredadores que enambientes rurales) podrían explicar la selección positiva de este hábitatpor parte de la especie, así como la mayor densidad de parejasreproductoras frente a las observadas en el hábitat más natural. Pese alas diferencias en las condiciones ecológicas existentes entre los mediosurbanos y rurales, los individuos urbanos no mostraron mayoresniveles de estrés crónico que sus conespecíficos rurales. Esto sugiereque la vida en la ciudad no constituye una fuente de estrés adicionalpara los organismos. Más aún, los individuos adultos alcanzaronvalores de supervivencia mayores en estos hábitats comparados con losindividuos rurales, algo que no se observó en individuos juveniles, cuyasupervivencia en medios urbanos y rurales no fue estadísticamentediferente. La diferente supervivencia de los individuos adultos en uno yotro medio evidenció una relación cuadrática entre los niveles de estrésy la supervivencia de los individuos, con mayores mortalidades enindividuos con bajos y altos niveles de corticosterona en pluma. Finalmente, también se encontraron diferencias en los parámetrosreproductivos de los individuos urbanos y rurales, con valores mediossuperiores para el caso de los primeros. Cabe destacar la interacciónexistente entre hábitat y años, que evidencia la estabilidad de losvalores de productividad para el caso de los individuos urbanos frente alas fluctuaciones observadas en los rurales. En resumen, los resultadossugieren que las ciudades tienen una papel de conservación importantepara las especies que son capaces de colonizarlas exitosamente, algofundamental cuando consideramos especies cuyos hábitats naturales se encuentran amenazados o en declive, como es el caso de los pastizalestemplados.

Descripción: En las últimas décadas se demostró que la producción transitoria de peróxido de hidrógeno (H2O2) constituye un evento muy importante de señalización disparado a través de la activación de receptores de superficie o determinado por el estado metabólico mitocondrial, y que modula el grado de fosforilación de determinadas proteínas. En este contexto, estudios recientes han confirmado la presencia de kinasas en la mitocondria que hemos interpretado como un mecanismo modulatorio en la disponibilidad celular de las kinasas. Las mitocondrias normales poseen la mayor concentración celular de ATP y H2O2 en el estado estacionario y contribuyen naturalmente al grado de fosforilación y oxidación de proteínas, dos modificaciones post-traduccionales centrales en la activación de las kinasas. Sobre estas bases, formulamos la hipótesis que el estado redox produce efectos celulares diferenciales en consonancia con la activación de Akt1 y ERK1/2 en la mitocondria, y que en este compartimiento, el H2O2 determina cambios conformacionales que favorecen la fosforilación y posterior translocación nuclear de las mismas. Los estudios realizados en esta Tesis confirmaron que: 1) en la línea celular NIH/3T3, el H2O2 efectivamente modula la progresión del ciclo celular a través de la oxidación y fosforilación selectiva de Akt1 en mitocondrias; 2) en la línea tumoral LP07, el H2O2 asimismo promueve la oxidación selectiva de ERK1/2 o p38-JNK1/2 y posterior translocación al núcleo con efectos ulteriores en la proliferación celular; y 3) el sistema de tiorredoxinas (Trx) modula el destino celular regulando el nivel de oxidantes en las líneas celulares y provocando una activación selectiva en el eje central de Akt1 en el modelo tumoral analizado in vivo. En la línea NIH/3T3, la modulación por H2O2 involucró la entrada de P-Akt1 Ser473 a las mitocondrias, donde fue fosforilada en Thr308 por PDK1. A concentración celular limitada de H2O2, la fosforilación de Akt1 en Thr308 en mitocondrias fue significativa, determinó su pasaje al núcleo y disparó mecanismos genómicos que favorecieron la proliferación celular. En cambio, a elevadas concentraciones de H2O2, la asociación Akt1-PDK1 fue interrumpida y P-Akt1 Ser473 fue retenida en la mitocondria en detrimento de su translocación nuclear. La actividad disminuida de Akt1 favoreció la liberación de citocromo c al citosol conduciendo a la apoptosis. Los efectos diferenciales en la interacción Akt1-PDK1 dependieron de la oxidación selectiva de la Cys310 de Akt1 a ácido sulfénico y sulfónico. Las respuestas celulares observadas en la línea tumoral LP07 involucraron la activación selectiva de ERK1/2 y la interacción eficiente con MEK1/2 determinada por la oxidación de cisteínas conservadas pertenecientes a dominios redox sensibles. Estas modificaciones post-traduccionales que tuvieron lugar en la mitocondria determinaron el pasaje de la kinasa al núcleo. Considerando que las mitocondrias tumorales son disfuncionales, su incapacidad para incrementar la producción de H2O2 podría interrumpir la oxidación sincronizada de ERK1/2 y la regulación del ciclo celular causando la persistencia del fenotipo proliferante. En el mismo modelo tumoral analizado in vivo, el silenciamiento de Trx1 y 2 fue capaz de revertir el efecto de las condiciones redox proliferativas por una activación diferencial de Akt1. Los resultados obtenidos indicaron que al revertir la baja condición redox proliferante, P-Akt1 Ser473 aumentó en la mitocondria en detrimento de la translocación al núcleo, mientras que en los tumores que exhibieron bajo H2O2, P-Akt1 Ser473 se encontró predominantemente en el núcleo, sugiriendo una marcada modulación en la activación de la kinasa y su posterior translocación al núcleo. En esta Tesis, se demuestra el rol central del H2O2 en la activación y tráfico mitocondrial de Akt1 y ERK1/2 en la progresión del ciclo celular. Se concluye que la localización subcelular de estas kinasas en mitocondrias aporta un nuevo modelo para explicar la regulación de la activación por la oxidación de cisteínas específicas y la fosforilación en los residuos correspondientes. De esta forma, el ciclo intramitocondrial de Akt1 y ERK1/2 constituye un eje central para la modulación redox del destino celular en células normales o tumorales.

Descripción: La enfermedad de Chagas es causada por el parásito protozoario intracelular Trypanosoma cruzi (T. cruzi) y afecta alrededor de 10 millones de personas. Aproximadamente un 20 a 30% de los sujetos crónicamente infectados muestran la progresión a miocardiopatía, después de padecer infección asintomática durante un período de años a décadas. La miocardiopatía de la enfermedad de Chagas es la causa más frecuente de miocardiopatía infecciosa en el mundo. Las respuestas inmunes mediadas por células CD8 y células T CD4 son cruciales para el control de esta infección crónica. En el pasado, debido a la escasez de los parásitos en el corazón, prevaleció la hipótesis de que la miocarditis chagásica crónica era atribuible exclusivamente a reacción cruzada autoanticuerpos al tejido cardiaco, y que la presencia del parásito era dispensable para la inflamación y fisiopatogénesis. Esta idea, en combinación con la elevada toxicidad y la falta de estudios controlados sobre la eficacia del tratamiento, exacerbó el escepticismo sobre la conveniencia de un tratamiento antiparasitario durante la infección crónica. Este escepticismo se mantuvo hasta finales de la década de los 90. Por otra parte, las pruebas serológicas convencionales pueden mantenerse positivas durante años o incluso décadas después de tratamiento antiparasitario exitoso y los resultados de un ensayo clínico doble ciego controlado con placebo para determinar la eficacia del tratamiento benznidazol no están disponibles actualmente. En el presente trabajo hemos estudiado los mecanismos inmunoregulatorios presentes en células T de sangre periférica, específicas o no contra T. cruzi y también en el corazón de pacientes humanos infectados con este parásito. Así mismo evaluamos el impacto del tratamiento tripanocida (benznidazol) sobre, la expresión de las moléculas de inmunoregulatorias y sobre los niveles de subpoblaciones de células T (ítems 1, 2 y 3). 1) Caracterización funcional de moléculas inmunoregulatorias y producción de citoquinas por parte de linfocitos T específicos contra T. cruzi. 2) Evaluación del impacto del tratamiento con benznidazol en subpoblaciones de linfocitos T en pacientes con infección crónica. 3) Composición celular, grado de diferenciación celular y perfil funcional de las células reclutadas hacia el corazón de pacientes con miocarditis crónica de Chagas. 1) Caracterización funcional de moléculas inmunoregulatorias y producción de citoquinas por parte de linfocitos T específicos contra T. cruzi. En los individuos infectados, más del 80% de los linfocitos T específicos contra el parásito productores de IFN-γ, presenta expresión del receptor inhibitorio CTLA-4, pero no de LIR-1. Por el contrario, en los mismos sujetos los linfocitos T específicos contra antígenos de la vacuna TetaDif productores de IFN-γ, no expresan ni CTLA-4 (3%), ni LIR-1 (5%). Además demostramos que la expresión de CTLA-4 en células T específicas contra T. cruzi tiene consecuencias funcionales, debido a la activación de CTLA-4 conduce a la disminución de la producción de IFN-γ en respuesta a antígenos de parásitos. Interesantemente, detectamos expresión de CTLA-4 en linfocitos T en el corazón de pacientes con miocarditis chagásica crónica. Luego de la activación policlonal, la expresión de CTLA-4 aumenta en mayor medida en pacientes sintomáticos en comparación con la inducción de la misma en sujetos asintomáticos y no infectados (P<0,001). La expresión de este receptor inhibitorio en células T específicas contra el parásito en repetidas ocasiones durante la exposición antigénica crónica, podría resultar en el agotamiento immunológico observado en el compartimento total de células T después de 10-20 años de la infección inicial. 2) Evaluación del impacto del benznidazol en subpoblaciones de linfocitos T que se encuentran aumentadas en pecientes crónicamente infectados. La administración del fármaco tripanocida en adultos con infección crónica por T. cruzi induce una disminución temprana, duradera y significativa (5 años de seguimiento) en los niveles de linfocitos T altamente diferenciados, los cuales vuelven a niveles normales. Este cambio se observa en la mitad (7 de 14) de los individuos infectados tratados, pero en ninguno de los individuos infectados no tratados seguidos en el tiempo (0 de 12). La serología convencional acompaña a la disminución de los CD4 + LIR-1 + obtenido en los primeros tiempos después del tratamiento y, por tanto constituiría un marcador precoz subrogante de la eficacia del tratamiento. 3) Composición celular, grado de diferenciación celular y perfil funcional de las células reclutadas hacia el corazón de pacientes con miocarditis crónica de Chagas. Con el fin de caracterizar los tipos celulares presentes y su posible rol durante la miocarditis de la enfermedad de Chagas, se analizaron la composición celular (i.e. CD3, CD4, CD8, CD20, CD21, CD68, CD57), la expresión de moléculas coestimuladoras (i.e. CD27), receptores inhibitorios (i.e. HLA-G, PD-1, CTLA-4), factores de transcripción de TH1 o células T reguladoras (i.e. Tbet, FOXP3), marcadores de senescencia (i.e. CD57, CD45RA) y un marcador de ciclo celular activo (i.e. Ki67). 3a. El porcentaje de células T (CD3 + , CD4 + y CD8 + células) se encuentra incrementado significativamente en las regiones con mayor grado de inflamación (hasta 70% del total infiltrado). Por el contrario, el porcentaje de macrófagos (% CD68 + ) fue similar en regiones de alto y bajo nivel de infiltración (20% del infiltrado). Por otro lado, las células B (i.e. células CD20 + ) se observaron sólo en algunas áreas con alto grado de inflamación y en bajo porcentaje (i.e. mediana, rango; 2%, 0-13%). 3b. La mayoría de los linfocitos infiltrantes mostraron expresión de CD45RO y CD27, marcadores de células con experiencia antigénica y bajo grado de diferenciación. Por el contrario, la expresión de PD-1, CD57 y CD45RA fue muy baja o ausente en el corazón de pacientes con enfermedad de Chagas independientemente del grado de miocarditis. 3c. La expresión del factor de transcripción maestro de TH1, Tbet, se observó en una importante proporción de células durante la miocarditis chagásica. En contraste, el nivel de células T reguladoras (i.e. FOXP3 + ) mostró ser escaso. Se observaron altos niveles del células expresando el marcador del ciclo celular activo, Ki67, las cuales a su vez resultaron coexpresar CD3, pero no CD8. 3d. Mediante un análisis de estadística de dos dimensiones pudimos demostrar la infección del miocardiocito humano durante el curso natural de la infección induce un reclutamiento eficiente de linfocitos T con experiencia antigénica y bajo grado de diferenciación (i.e. CD45RO + CD57 – ). En resumen, hemos encontrado que las células T reclutadas por el corazón infectado de pacientes con Chagas miocarditis poseen bajo grado de diferenciación y un fenotipo similar al de los linfocitos T específicos contra T. cruzi en presentes en sangre periférica. Además, se observó que las células T proliferarían in situ, y que los linfocitos T con experiencia antigénica y bajo grado de diferenciación son reclutadas por los miocitos infectados de manera eficiente.

Descripción: Se describe la presencia, distribución y algunas propiedades de las ADN polimerasas aisladas de linfocitos humanos de sangre perisféroca normal sin estimular y estimulados por fitoheoaglutinina. En los linfocitos no estimulados se encuentran dos ADN polimerasas citoplasmáticas que eluyen de columnas de DEAE celulosa a 0,07 M de ClNa (C IN) y a 0,13 M de ClNa (C IIN). En la fracción nuclear contiene dos actividades enzimáticas,la correspondiente a N Is que no se adsorbe a la DEAE celulosa y la N IIs que eluye de la DEAE celulosa a 0,07 M de ClNa.

Descripción: La superfamilia del TGFβ está formada por polipéptidos que regulan diferencialmente ladivisión celular, en mamíferos. Dependiendo del tipo celular, el TGFβ1 puede inhibir, promover opotenciar la división celular. En monocapas confluentes y aquietadas de la línea celular Swiss 3T3, el TGFβ1 (O,5—2 ng/ml) no induce, ni inhibe la proliferación celular. Sin embargo, estefactor es capaz de potenciar la proliferación inducida por la PGF2α (300 ng/ml) [Gómez de Alzagaet aL., 1994]. De las señales activadas por la PGF2α, se buscó cúales eran las más importantes en lasinergia con el TGFβ1. Se comenzó estudiando la quinasa C (PKC), a través de la retromodulacióncon 12-tetradecanoilforbol l3-acetato (TPA, 800 nM, 96 hs.), o Briostatina l (lOOnM, 96 hs.). En la condición de retro-modulación de la PKC, se observó que el TGFβ1 (1,0ng/ml) era capaz de inducir la proliferación celular (50 % de células en fase S, después de 28 hs.de estimulación, y 50 % de aumento en el número de células, después de 48 hs. de estimulación),siendo ésta dependiente, tanto de la concentración del factor, como de la concentración de loscompuestos que retro-modulan la PKC. En las células pretratadas con TPA, la fase G1 tiene unas 6 a 7 horas más, que en las células sin pretratar. En la primer condición, el TGFβ1 induce laexpresión de la ciclina D1, y en correlación a la mayor duración de la fase G1, ocurre horas mástarde después de la estimulación (lO-12 hs.), comparado con las células sin pretratar, estimuladascon PGF2α (6-9 hs.) [Sauane et al., 2000]. Fue interesante observar, que la PGF2α, induce laexpresión de la ciclina Dl, en células pretratadas con TPA, aún cuando en esta condición no esmitogénica, y a pesar que la CDK4 se halle presente. Este resultado lleva a plantear que laexpresión de la ciclina Dl, no necesariamente indica que la célula se dividirá, y además que esindependiente de la PKC. Con el uso del anticuerpo monoclonal anti PKCα [Leach et al., 1988], seobservó que esta enzima está ausente en el momento de agregado el TGFβ1, en célulaspretratadas con TPA. La inhibición directa de la PKC con el inhibidor específico GF 109203X (1O μM), agregado una hora antes a células sin pretratar, no fue suficiente para permitir que el TGFβ1 indujera la mitogénesis. El GF es capaz de inhibir parcialmente la sinergia entre el TGFβ1y la PGF2α, mientras que inhibe totalmente la sinergia entre el TGFβ1 y el OAG, en células sinpretratar. Es decir que la PKC no es suficiente, pero sí necesaria en la primer sinergia, y sí muyimportante en la última. El agregado de GF por períodos prolongados, no logra retro-modular la PKC. Los receptores del TGFβ1, detectados con el uso de anticuerpos, están presentes en ambascondiciones, y la medición del transporte de glucosa, inducido por este factor, pone en evidenciaque la actividad de los mismos, no se ve alterada por el pretratamiento con TPA. El agregado deácido okadaico (5 nM), junto al TGFβ1, en células sin pretratar, induce la síntesis de ADN (lO %de células en fase S), indicando la presencia de fosfatasas de ser/thr, pero no sería el únicoimpedimento, por el cual el TGFβ1 no es mitogénico en las células Swiss 3T3. En el estudio delas sinergias del TGFβ1 con insulina y PGE1, se observó que, en células pretratadas con TPA, PGE1 no induce la proliferación, ni potencia la inducción de esta última por el TGFβ1 solo oagregado con insulina. De estos resultados se concluye, que la PKC es necesaria para que la PGE1 potencie la sinergia entre el TGFβ1 más insulina. La falta de potenciación entre el TGFβ1 yla PGE1, podría indicar un camino de señalización en común. Inhibiendo la PKA con PKI,péptido inhibidor (l nM), y también con el uso del inhibidor H-89 (l nM), se encontró que lainhibición de esta enzima no altera la inducción de la proliferación por el TGFβ1, en célulaspretratadas con TPA. Con el uso del inhibidor genisteina (10 μM), se observó que las quinasas detirosina están involucradas en la sinergia del TGFβ1 y la PGF2α, en ambas condiciones, y en lainducción de la proliferación por el TGFβ1, en células pretratadas con TPA. El uso de lovastatina (80 μM) y mevalonato (800 μM), puso en evidencia la importancia relativa de la isoprenilaciónde proteínas, en la sinergia entre el TGFβ1 y la PGF2α, en ambas condiciones. El TGFβ1 no activala MAPK (ERK 1/2) en ninguna condición, ni potencia la actividad, ni la presencia de la misma,en la sinergia con la PGF2α. La actividad de esta enzima se midió, a través de lainmunoprecipitación y fosforilación de la mielina básica, y con el anticuerpo anti ERK 1/2,bifosforilado (forma activa). El TGFβ1 induce la translocación de la Smad4 (medida porinmunoflourescencia, con anticuerpo anti Smad4), en ambas condiciones, y ésta no se ve alteradaen las sinergias de este factor y la PGF2α. En conclusión, el TGFβ1 induce la proliferación celularen células Swiss 3T3, que han sido pretratadas con compuestos capaces de retro-modular la PKC,es decir, primero activada y luego degradada. La inducción de la ciclina Dl, debe ocurrir por unavía alternativa a ERK l y 2. El pretratamiento con TPA lleva a las células a una fase G0 diferentede la misma fase en la que se encuentran las células confluentes y aquietadas, sin pretratar. El TGFβ1 activa las moléculas señalizantes específicas de su camino de señalización, y éstas debeninteraccionar con factores de transcripción u otros compuestos, que surgen por el pretratamientocon TPA, haciendo que la fase G1 sea más larga, tiempo en el cual se sintetizan y/o modificancompuestos necesarios para inducir la proliferación celular.

Descripción: Fil: Dada, Laura Andrea. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Los ritmos biológicos diarios son el resultado de la interacción entre un relojcircadiano endógeno y factores ambientales sincronizadores, principalmente laluz, que ejerce su efecto a través de cambios en la fase de los ritmos controlados. El objetivo del presente trabajo de tesis fue caracterizar la vía (o una de las vías)de transducción de señales fóticas que ponen en hora al reloj circadiano demamíferos. Para ello, se realizaron técnicas de registro comportamental (medición de actividad locomotora), neuroquímico (actividad deneurotransmisores), bioquímico (actividad enzimática, cuantificación proteica,fosforilación, etc.) y molecular (western blot, hibridación in situ) en hámsters (Mesocricetus auratus), obteniendo tejido hipotalámico conteniendo los núcleossupraquiasmáticos, sede del reloj circadiano. Los resultados de esta tesis, junto con las evidencias de la bibliografía sobre eltema, permiten sugerir un modelo de señalización de cuya entrada es lainteracción del glutamato de la vía retinohipotalámica con receptores de tipo NMDA, que inducen un aumento en el influjo de calcio. A su vez, este ion escapaz de activar tanto a la proteína quinasa dependiente de Ca2+ y calmodulina (CaMKII) y a la óxido nítrico sintetasa (NOS). El óxido nítrico, y posiblementetambién el monóxido de carbono, otro mensajero gaseoso, producen unaumento en la actividad de la guanilil ciclasa soluble (GC), que promueve unasubida en los niveles del GMPc y la activación de la proteína quinasa G (PKG). Si bien son pocos conocidos los sustratos de esta en el cerebro, se aportanevidencias en favor de que esta vía de señales lleva a la expresión fótica degenes reloj como mPer2.

Descripción: El objetivo central de este trabajo fue, en una primera etapa, el estudio de los mecanismos detransferencia de agua y solutos en diferentes epitelios, así como su regulación y farmacología. Estecampo es de gran complejidad, ya que las propiedades de transporte varían de tejido en tejido y deespecie en especie. Sin embargo existen mecanismos comunes que permiten entender las funcionesbásicas de estos sistemas. En lo que respecta a la transferencia neta de agua podemos decir que las fuerzas impulsoras sonbásicamente tres: 1) el gradiente transepitelial de presión hidrostática; 2) el gradiente transepitelialde presión osmótica y 3) los movimientos de agua asociados al transporte de soluto. Muchos puntos importantes no están, sin embargo, aún aclarados como ser: 1) ¿Cuál es el gradoreal de acople entre el movimiento de agua y solutos? 2) ¿Cuál es el rol de los gradientes osmóticose hidrostáticos en los flujos observados? 3) ¿Cuál es la importancia relativa de las vías paracelulary transcelular en los movimientos de agua y soluto? y 4) ¿Existen o no canales específicos para elmovimiento de agua?. El enfoque de los problemas antes expuestos permite diferentes aproximacionesmetodológicas que implican distintos niveles de complejidad estructural. Al avanzar en la disecciónde los fenómenos en estudio pasaremos del nivel supracelular al celular, para llegar al subcelular ypor último al molecular. Para dar una respuesta inicial a los problemas antes mencionados,utilizamos el estudio sistemáticoy paralelo de las propiedades de permeabilidad al agua y solutos en epitelios "in vitro", utilizandodos modelos experimentales: el amnios humano y el yeyuno de rata. Luego, comparamos losresultados obtenidos con los previamente informados por nuestro laboratorio para la vejiga urinariade anfibio. Estos estudios se centraron en el análisis de los mecanismos que regulan el balanceabsorción-secreción y sobre el rol de las vías transcelular y paracelular en los movimientos de aguay solutos. La metodología básica consistió en montar a los epitelios en estudio, entre dos cámaras de lucite,lo que permite la medición de los movimientos transepiteliales iónicos y moleculares, utilizandomarcadores radiactivos, así como la medición de los parámetros eléctricos (diferencia de potencial,conductancia y corriente de corto-circuito). Utilizamos, además, una técnica que permite controlar,minuto a minuto, el flujo neto de agua transepitelial. En una segunda etapa se procedió a la evaluación de las permeabilidades osmóticas y difusionalesal agua en ovocitos de anfibios. El objetivo de estas mediciones fue utilizar a este sistema comomodelo de expresión de las propiedades de permeabilidad. Esto se logra inyectando en el ovocíto el ARNm preparado a partir de determinado tipo celular, que posea la propiedad de permeabilidad enestudio. Esta metodología, basada en técnicas de biología molecular, demostró ser una herramientaadecuada para la expresión del canal de agua inducido por la presencia de la hormona antidiurética.

Descripción: En esta tesis, estudiamos algunos de los mecanismos a través de los cuales Xanthomonas campestrispv. campestris (Xcc) suprime la respuesta inmune de Arabidopsis thaliana. Los microbios gatillan el cierre estomático en la planta a través de patrones moleculares asociadosa microbios (MAMPs), sin embargo Xcc es capaz de colonizar A. thaliana a través de estos poros medianteun factor de virulencia (Xcc FV) capaz de inhibir su cierre. En la primera parte de esta tesis estudiamos el mecanismo de acción del Xcc FV y de una toxinade efecto similar producida por la bacteria fitopatógena Pseudomonas syringae pv. tomato denominadacoronatina. Encontramos que ambos compuestos inhiben el cierre estomático inducido por MAMPs y porla hormona ácido abscísico a través de la inhibición de la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) mediada por NADPH oxidasas y de manera dependiente de la señalización de jasmonatos. En la segunda parte de la tesis, estudiamos el rol del glucano cíclico β-(1,2) de Xcc en el procesoinfectivo. Hallamos que este compuesto inhibe la producción de ERO, disminuye la expresión de genes dedefensa y suprime la deposición de calosa inducidas por flagelina. Asimismo, observamos que el efectodel glucano cíclico β-(1,2) requiere de dos receptores quinasa con dominios ricos en lisina, LYK3 y LYK4,y que se une específicamente a preparaciones de membranas de A. thaliana, lo cual sugiere que actúa através de la unión a un receptor de membrana. En la tercera parte de la tesis, estudiamos el mecanismo a través del cual el xantano, unexopolisacárido producido por Xcc, actúa como factor de virulencia. A través del uso mutantes de Xccafectadas en enzimas biosintéticas encargadas de modificar químicamente el xantano, descubrimos que lapiruvilación sobre la manosa externa de la unidad repetitiva de este polisacárido son esenciales para suactividad de supresión de la respuesta inmune de A. thaliana. Palabras clave: estomas, ABA, coronatina, NADPH oxidasas, especies reactivas de oxígeno, glucanocíclico β-(1,2), flg22, inmunidad vegetal, xantano, Xanthomonas, Arabidopsis thaliana.

Descripción: Fil: Cerdeira, Silvia Beatriz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: La corona solar está formada por un plasma de alta temperatura cuya dinámica da lugar a unarica variedad de eventos de disipación de energía. Por un lado, las fulguraciones, capaces de liberarcantidades enormes de energía (hasta 10(32)erg) en tiempos del orden de minutos. Por el otro, elcalentamiento estacionario de las regiones activas, con una tasa de 10(5)—10(7)erg cm (-2) s (-1), que lasmantiene a una temperatura dos órdenes de magnitud mayor que la de la capa atmosférica inmediatamenteinferior (la fotósfera). Estos fenómenos pueden ser descriptos, al menos parcialmente, enla marco de la magnetohidrodinámica. El problema principal al que se enfrenta esta descripción esque los coeficientes moleculares de disipación en la corona son lo suficientemente pequeños comopara que los fenómenos disipativos solo puedan ser explicados en presencia de estructuras de escalapequeña. En ese sentido, la turbulencia magneto hidrodinámica y la reconexión magnética resultantal vez los candidatos naturales a describir, respectivamente, el calentamiento estacionario de lacorona y la disipación impulsiva en fulguraciones. Un estudio teórico-numérico de intermitenciamagneto hidrodinámica nos permite relacionar las propiedades estadísticas de la turbulencia conla geometría (asintoticamente fractal) de las zonas de disipación, y afirmar que la disipación estacionariaen la corona solar se encuentra sumamente concentrada en zonas distribuidas en formaaleatoria. La aplicación de una teoría de clausura turbulenta a dos puntos indica que los arcosmagnéticos son esencialmente calentados por corrientes eléctricas cuasi-estacionarias, inyectadaspor el campo de velocidades fotosférico. Estudiamos, tanto en forma numérica como teórica,un caso de reconexión magnética turbulenta entre dos tubos de flujo dentro de un arco coronal,obteniendo una tasa de disipación acorde a la de las microfulguraciones. Por último, una serie deestudios observacionales de la dinámica de las estructuras coronales en la línea espectral Hα nospermite conjeturar que el aumento de la vorticidad de esas estructuras, presuntamente ligado ala evolución de los campos dinámicos, puede constituir una herramienta útil para la predicción defulguraciones.

Descripción: Fil: Olabuenaga, Susana E.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Fil: Ramhorst, Rosanna Elizabeth. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Los mecanismos patogénicos subyacentes a las alteraciones neuromusculares producidas durante la infección con Trypanosoma cruzi fueron estudiados en un modelo murino empleando una cepa miotrópica de escasa virulencia (CA-I) y una cepa letal pantrópica (RA), mediante técnicas electrofisiológicas, histológicas e inmunológicas. Ratones C3H/HeN infectados con la cepa CA-I manifestaron un patrón electromiográfico de compromiso muscular primario, en tanto los infectados con RA, revelaron un patrón neuropático primario. Los estudios histopatológicos evidenciaron alteraciones inflamatorias de severidad creciente en los tejidos afectados estudiados en este modelo: músculo isquiotibial, nervio ciático y médula espinal. Las lesiones musculares eran de mayor intensidad en la infección con CA-I y las de tejido nervioso predominaban con RA, lo cual está de acuerdo con el tropismo parasitario. El fenotipo celular predominante en los infiltrados inflamatorios dependió de la cepa de T.cruzi, del tejido y del tiempo post-infección. Los rasgos más destacados en la infiección con la cepa CA-I fueron: a) Predominio de linfocitos T CD4 en músculo esquelético durante la fase aguda y crónica temprana y, b) Presencia de linfocitos B con IgM de superficie en la fase crónica tardía en todos los tejidos. Las características más relevantes de la infección con RA fueron: a) predominio de linfocitos T CD8 en tejido nervioso durante todo el curso de la infección, b) presencia de células NK (asialo-GMl+) en tejido muscular durante la fase crónica y, c) presencia células CD4-, CD8- en tejido nervioso durante la fase crónica. Estudios de proliferación linfocitaria realizados durante la infección crónica con el clon K-98 de CA-I demostraron la existencia de linfocitos T CD4 y CD8 autorreactivos frente a Ag de tejido muscular esquelético y sistema nervioso. En estudios similares con la cepa RA ambassubpoblaciones de linfocitos T sólo proliferaron frente a Ag de SN. La transferencia pasiva de linfocitos T CD4 de ratones infectados con K-98, indujo miositis con predominio de células T CD4+ y macrófagos en ratones singeneicos normales, sugiriendo el desarrollo de hipersensibilidad retardada (HR), frente a Ag musculares. Los linfocitos T CD8 de los mismos ratones no desencadenaron patología neuromuscular en los receptores. La transferencia de linfocitos T CD4 y CD8 de ratones infectados con RA, indujo neuritis y leptomeningitis, sugiriendo el desarrollo de mecanismos de HR como de citotoxicidad dependiente de linfocitos T frente a Ag de sisterna nervioso.

Descripción: The overall objective of this thesis was to study the relationship between IL-10 and the mechanisms of resistance to Trypanosoma cruzi (T. cruzi), the causative agent of Chagas disease. For this, we used a model of experimental infection with T. cruzi in mice deficient in IL-10 (IL-10 KO) from Balb/c background. Unexpectedly, we found higher parasitemia levels, greater weight loss and mortality in mice deficient in IL-10, compared with WT mice infected with T. cruzi strains of high and moderate virulence. The kinetics of T cells in spleen and peripheral blood showed that infected IL-10 KO mice failed to expand the relative number of spleen and total circulating CD8+ T cells, a phenomenon observed from 21 dpi in WT mice. CD8+ T cells from IL-10 KO mice had diminished effector functions (cytotoxic potential and IFN-γ production) and decreases ex vivo proliferative response than those of WT mice, despite the increased producing of IL-2 by the latter. At 21 dpi, in the absence of IL-10, CD8+ T cells failed to reach critical infected organs such as the heart. Consistent with this, IL-10 KO mice presented higher parasite burden in heart tissue than WT mice, but not in quadriceps. At chronic infection (5 months pi.), the extension and number of infiltrates decreased globally, but the IL-10 still appeared to be required to drive the CD8+ T cells accumulation in target tissues. Hystopathological studies of cardiac and skeletal tissues confirmed that IL-10 is involved in controlling inflammation, preventing irreversible damage to the muscle fibers. Adoptive transfer assays showed an improvement in controlling parasitemia in mice receiving CD8+ T cells from both infected WT as IL-10 KO mice. This finding shows that the lower resistance to T. cruzi seen in IL-10 KO mice correlates with the lack of expansion of CD8+ Tcells and with the absence of IL-10 produced by this cell subpopulation. In conclusion, during acute infection with T. cruzi, IL-10 plays a previously unrecognized immunostimulatory role on CD8+ T cells (the most relevant lymphocyte population for the control of intracellular parasites). Understanding the mechanism that control the effector function of this cell population is critical to understand factors involved in the susceptibility to Chagas disease, and for the rational design of effective strategies for the prophylaxis against T. cruzi

Descripción: Fil: Tezón, Jorge G.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: El objetivo general del presente trabajo de tesis fue determinar los mecanismos involucrados en la liberación de LHRH en condiciones normales y fisiopatológicas. En primer lugar se estudió la interacción entre los distintos mensajeros inter e intraneuronales involucrados en la liberación del neuropéptido en extractos de hipotálamo medio basal (HMB) incubados in vitro, así como los mecanismos desencadenados por LHRH sobre su propia liberación. Distintas concentraciones de LHRH dentro del rango fisiológico pusieron en marcha diferentes vías de transducción de señales que conducen a la inhibición de la liberación de la neurohormona, incluyendo incrementos en la liberación de GABA o inhibición en la liberación de glutamato. En segundo término, se estudió la presencia del sistema endocannabinoide en el hipotálamo y su potencial función moduladora de la liberación de LHRH. Los estudios inmunohistoquímicos mostraron una distribución dispersa de los CB1 en el área preóptica hipotalámica donde se encuentran las neuronas de LHRH. Además, se demostró el efecto inhibitorio de la AEA sobre la liberación de LHRH en extractos de HMB incubados in vitro. El efecto inhibitorio fue prevenido por el antagonista selectivo de receptores CB1, el AM251, confirmando que tal efecto es mediado por los receptores centrales del sistema endocannabinnoide. Adicionalmente, se demostró el papel del GABA como mediador de los efectos inhibitorios de AEA sobre la liberación de LHRH. Se ha descrito que la liberación de LHRH se encuentra disminuida en distintas condiciones patológicas como las que tienen lugar durante la exposición al LPS, al etanol y a los cannabinoides. Por lo tanto, el objetivo final de la presente tesis fue estudiar si la inhibición de la liberación de LHRH producida en respuesta al etanol y al LPS involucra la activación del sistema endocannabinoide. Nuestros resultados indicaron que el sistema endocannabinoide hipotalámico es activado por el etanol y por los agentes inflamatorios, LPS y TNFα, conduciendo a la inhibición de la liberación de LHRH.

Descripción: En esta tesis se estudiaron los mecanismos asociados con la exocitosisvesicular altamente acoplada al estímulo, su recuperación, y su mantenimientofrente a la aplicación de potenciales de acción a bajas frecuencias deestimulación, propias del estado basal de estas células. En primer lugar, seevidenció que frente a la aplicación de un estímulo que simula un potencial deacción se libera un grupo de ≈ 8 vesículas, al que denominamos ETAP (porexocytosis triggered by action potential). Este pool vesicular está incluido en elpool inmediatamente liberable (IRP, ≈ 25 vesículas), y su exocitosis depende enun 50% de fuentes de Ca2+ extracelulares y en un 50% de un mecanismoindependiente del influjo de Ca2+. Mientras que IRP recupera lentamente (τ ≈ 7 s)luego de ser deprimido, ETAP presenta una rápida cinética de recuperación (τ ≈ 0.7 s). Esta recuperación depende de dos procesos: (i) transferencia devesículas desde pooles vesiculares río arriba, y (ii) una endocitosis rápidadependiente de dinamina y altamente acoplada a la exocitosis precedente. En lasegunda parte de esta tesis se investigó el mecanismo de exocitosisindependiente del influjo Ca2+ mencionado previamente. Utilizandodespolarizaciones cuadradas de 100 ms (máxima respuesta), se determinaron lasiguientes características para dicho fenómeno: (i) independencia de fuentesextracelulares e intracelulares de Ca2+; (ii) dependencia de la proteína SNAREsinaptobrevina; (iii) dependencia sigmoidea con el voltaje aplicado; (iv) losresultados sugieren que el sensor de voltaje sería el canal de Ca2+ tipo P/Q, yque interaccionaría con la maquinaria exocitótica a través de la secuenciasynprint. En resumen, los resultados muestran que un potencial de acción induceuna exocitosis altamente acoplada y sincrónica al estímulo que es dependienteen parte de un mecanismo activado por Ca2+ y en parte de otro activadodirectamente por voltaje. Finalmente, demostramos que esta exocitosis, graciasa su rápida velocidad de recuperación vesicular, es capaz de mantener lasecreción de manera continua a frecuencias basales fisiológicas.

Descripción: La activacion temprana de los linfocitos T humanos por PHA,les confiere la capacidad de modificar la actividad contráctil dela auricula aislada de rata. Los efectos estimulantes de lapoblación linfocitaria T se deben a la contribución de los linfocitos CD4 y son mediados por factores solubles que desencadenanla liberacion de SRS-A del miocardio. Como en el proceso de activacion lintocitaria con lectinasaumenta la disponibilidad de AA libre, se estudió la accion delos linfocitos humanos normales expuestos al AA sobre la actividadespontánea contractil de la auricula de rata, prescindiendode este modo de la etapa de estimulación por PHA. Tanto las subpoblacioneslinfoideas T, como no T, CD4 y CD8 en presencia de AA, reaccionan in vitro con el miocardio aislado desviando elmetabolismo del AA hacia la via de la lipoxigenasa. Así, losefectos inotrópicos y cronotrópicos observados estarían relacionadoscon la generación de la SRS-A. Por último se comprobó que las células de pacientes con LLCo células linfoblastoideas B (Raji), ejercen en ausencia de AA unefecto depresor sobre la tension contráctil. Evidencias directase indirectas sugieren que la producción de Txs por estas celulastransformadas podrían estar involucrados en la respuestainotrópica negativa, asi como podrían intervenir en la regulaciónde su proliferación.

Descripción: Los genes R-spondin (Rspo) codifican para una familia de proteínas de secreción quemodulan las vías de señalización Wnt y están involucradas en múltiples procesos normales ypatológicos, de desarrollo y diferenciacion. Nuestro grupo determinó que particularmente Rspo3, aparece frecuentemente mutado y sobre-expresado en tumores inducidos por el virus deltumor mamario murino (MMTV), induciendo la transformación de células mamarias. Estosresultados también fueron corroborados posteriormente por otro grupo de trabajo. En el marco de esta tesis doctoral, demostramos que Rspo3 puede ser expresado porcélulas mamarias, no infectadas por MMTV, particularmente en aquellas que presentanmarcadores basales. De hecho, líneas tumorales mamarias que no expresan receptoreshormonales y poseen un fenotipo altamente metastásico son las que expresan niveles más altosde este gen. A continuación, nos propusimos determinar si Rspo3 se expresa en la glándulamamaria murina normal. Para ello, a partir de tejido de hembras vírgenes de la cepa C57B/L6, sesepararon las diferentes poblaciones celulares mediante citometría de flujo, y por RT-PCRcuantitativa se pudo determinar que la subpoblación basal enriquecida en células stem (Lin- /CD24+/CD29hi) expresa Rspo3, mientras que este ARNm no fue detectado en la subpoblaciónluminal. Al evaluar el efecto de RSPO3 sobre la línea epitelial mamaria no-tumoral NMuMG,hallamos que esta proteína favorecía características celulares asociadas a la transición epiteliomesenquimal,como la reducción en los niveles de E-cadherina y el incremento en la expresiónde Fibronectina, así como cambios morfológicos característicos de este proceso. Para investigar las consecuencias de la disminución de la expresión endógena de Rspo3 enlas células tumorales mamarias, se transfectó de manera estable células de la línea murina SCg6con diferentes secuencias de shRNA específicos para Rspo3. En aquellos clones en los que severificó una importante disminución en la expresión de dicha proteína se observó, por análisis de RT-PCR cuantitativa e inmunofluorescencia, una reducción en los niveles de marcadores basalescomo Vimentina. También, pudimos determinar en dichos clones la inhibición de la capacidadmigratoria de estas células así como la reducción en los niveles de actividad nuclear de β-catenina, lo que sugiere que Rspo3 estaría participando a través de la activación de la víacanónica de Wnt. Finalmente, se inocularon células de la línea SCg6 con Rspo3 efectivamente silenciado enlas glándulas mamarias o subcutáneamente y se evaluó la capacidad tumorigénica de lasmismas. Hallamos que estos clones no generaban tumores o lo hacían con una latencia mayorque las células SCg6 parentales. En conjunto, estos resultados demuestran que Rspo3 es relevante para el mantenimientode la capacidad tumorigénica de las células mamarias y sugieren que participaría en elmantenimiento del fenotipo basal tanto de células mamarias normales como tumorales.

Descripción: En este trabajo de Tesis se evaluaron las siguientes hipótesis: 1. El receptor de progesterona (RP) está involucradoen el crecimiento tumoral progestágeno-independiente (PI). 2. Vias preliferativas activadas por factores de crecimiento activan al RP. 3. Factores del estrema tumoral participan en la transición hacia la hormono-independenciaactivando RP. 4. Los receptores de estrógenos alfa (REα) tienen un rol en el crecimiento tumoralpregestágeno-dependiente (PD). Los ensayos se realizaron en un modelo experimental de inducción de cáncer de mama poradministración prolongada de acetato de medroxiprogesterona (MPA) en ratones hembras vírgenes dela cepa BALB/c. Los tumores utilizados fueron todos carcinomas ductales metastáticos con altocontenido de RE y RP, que se comportan como hormono-dependientes en los primeros pasajessubcutáneos singeneicos, creciendo sólo en presencia de progestágenos. En pasajes sucesivospueden adquirir un fenotipo progestágeno-independiente, independizándose del requerimiento dehormonas, pero aún así mantienen la expresión de RE y RP. Un estudio de comportamiento de unaserie de tumores PI, nos condujo a subclasificarlos en respondedores (PI-R) o no respondedores (PI-NR) (Helguero y col. Breast Cancer Res and Treat 79: 379-390, 2003) de acuerdo a la sensibilidad invivo para regresionar con el tratamiento a antiprogestágenos. Para evaluar si existen factores de crecimiento capaces de reemplazar a los progestágenos enla estimulación de la proliferación celular en cultivos primarios de un tumor PD, el CC4-HD, usamos albFGF y bloqueamos el RP mediante el uso de antiprogestágenos (RU 486 y ZK 299) y mediante el usode oligonucleótidos antisentido. En todos los casos el bloqueo del RP inhibió la proliferación celularinducida por MPA, factores séricos o bFGF, de manera específica. Resultados similares se obtuvieronutilizando cultivos primarios de 3 tumores PI diferentes: 59-2-HI, C7-2-HI y CC4-HI. Estudios de Mobility Gel Shift confirmaron que tanto el MPA como el bFGF pueden inducir laactivación del RP en células en cultivo y que los mismos se encuentran constitutivamente activados encultivos primarios de tumores PI. Por otra parte se demostró que in vivo la terapia con oligonucleótidos antisentido de RP fuecapaz de inducir una inhibición del crecimiento tumoral. Los tumores de animales tratados mostraronuna significativa reducción de células en fase proliferativa y en la expresión de RP. Se observóincremento de apoptosis sólo en un tumor en el cual el tratamiento indujo reducción de tamaño. Para evaluar la expresión del bFGF y los receptores (RFGF 1 al 4) en los tumores PD y PIprocedimos a evaluar primero su expresión en distintos estadios del desarrollo de glándulas mamariasnormales por inmunohistoquímica. Si bien la expresión de bFGF en la mama normal de ratón ya estabareportada, nuestros estudios revelaron una regulación de la expresión en el desarrollo. Los 4receptores también se expresan en las mamas normales y su expresión también está regulada en losdistintos estadíos del desarrollo. Por inmunohistoquímica o inmunofluorescencia no se detectaron diferencias evaluables deexpresión de bFGF o de sus receptores entre tumores PD y PI-R; si bien se pudo determinar lamarcación de bFGF predominantemente estromal y la de los receptores en el parénquima tumoral. Los RFGF 2 y 3 están ampliamente expresados con localización nuclear además de la convencional. Debido a que con la técnica inmunohistoquímica no se puede discriminar entre las distintasisoformas de bFGF, se hicieron estudios de Western blots para identificar la isofonna clásica de 16kDa. Se detectó una mayor expresión de esta isoforma cuando los tumores PD crecían en ausencia deprogestágenos. Para poder evaluar mejor la contribución de las células epiteliales o los fibroblastos enla expresión de bFGF, separamos ambas poblaciones y se hicieron cultivos primarios. Observamosmayor expresión de bFGF en los fibroblastos estromales de tumores PI que en los de tumores PD. Ensu conjunto estos datos indicarían que el bFGF estromal podría contribuir a inducir la proliferacióncelular en tumores PI a través de la activación de RP. En co-cultivos de células epiteliales obtenidas deun tumor PD con fibroblastos estromales obtenidos de un tumor PD o de uno PI se demostró queambos fibroblastos ejercían un efecto sinérgico de la proliferación celular y que este efecto era mayorcon los fibroblastos PI. A la inversa, células epiteliales PI cultivadas con fibroblastos PD crecieron máslentamente que al cultivarlas con fibroblastos PI. En el primer capitlo concluímos que los tumores con fenotipo PD y los PI-R necesitan de un RP funcional para proliferar y que el estroma cumple una participación activa en el crecimiento tumoral. En el crecimiento PI-R, el bFGF junto con otros factores provenientes del estroma podría estaractivando los RP presentes en el parénquima, contribuyendo al fenotipo PI. El estroma PI liberaría unamayor cantidad de factores en respuesta a señales del parénquima. En el segundo capítulo estudiamos la participación del RE en el crecimiento tumoral PD y paraello bloqueamos el REα con un antiestrógeno puro, el ICI 182.780 y oligonucleótidos antisentido de REα. Como resultado, en ambos casos obtuvimos una inhibición de la proliferación celularacompañada por una disminución de expresión de RP, sugiriendo que el REα participa en elcrecimiento PD y que la alta expresión de RP pueda deberse a la presencia de RE activados. En el tercer y último capítulo estudiamos el efecto de dos SERMs, y del antiestrógeno puro ICI 182.780, utilizados en la clínica sobre el crecimiento de un tumor PD y sobre la síntesis de RP. El ICI 182.780, el tamoxifeno y el raloxifeno mostraron efectos inhibitorios per se en el crecimiento in vitro aligual que el 17-β—estradiol (E2) pero en mayores concentraciones. El raloxifeno indujo una estimulaciónde la proliferación en presencia de progestágenos. EI ICI 182.780 y el raloxifeno revirtieron el efectoinhibitorio del E2 mientras que el tamoxifeno fue inhibitorio. El ICI 182.780 disminuyó la síntesis de RPmientras que el tamoxifeno y el E2 los aumentaron y el raloxifeno no tuvo efectos significativos. Concluimos que el tamoxifeno tiene un efecto similar al observado en la clínica en nuestro modeloexperimental inhibiendo el crecimiento tumoral y aumentando la expresión de RP. Estos resultados nosllevan a hipotetizar que el tamoxifeno pueda ejercer efectos inhibitorios por su efecto estrogénico levemás que por su acción antiestrogénica. En conjunto estos resultados: a) jerarquizan el rol del receptor de progesterona en elcrecimiento de carcinomas mamarios, b) brindan al estroma un posible rol protagónico en la adquisiciónde la hormono-independencia y c) la similitud entre los efectos del tamoxifeno obtenidos en la clínica yen estos tumores son interesantes para validar aún más los dos ítems anteriores en cuanto a surelevancia clínica.

Descripción: En este trabajo se han realizado experimentos para dilucidar la función local en el ovario de la Hormona Liberadora de Gonadotrofinas (GnRH-I). Se han estudiado procesos fundamentales del desarrollo folicular como la síntesis de esteroides sexuales y la angiogénesis ovárica en su relación con la apoptosis folicular. En nuestro laboratorio se postuló que el GnRH-I ejerce una acción inhibitoria durante el desarrollo folicular actuando como modulador intraovárico. En ratas estimuladas con gonadotrofinas analizamos los niveles de esteroides sexuales y la expresión y contenido de enzimas ováricas responsables de la síntesis de esteroides luego del tratamiento con un agonista de GnRH-I, Acetato de Leuprolide (LA). Los efectos observados se han corroborado con experimentos realizados in vitro utilizando este mismo agonista. Además, estudiamos factores angiogénicos esenciales para el desarrollo y establecimiento de la vasculatura en el folículo ovárico, como también parámetros de la atresia folicular. El tratamiento con el agonista afectó la síntesis de esteroides ováricos al igual que el contenido folicular de las enzimas esteroidogénicas, produciendo una disminución en la síntesis de andrógenos y como consecuencia, en la producción de estradiol. Estos resultados se observaron en los experimentos realizados in vivo e in vitro. También se observó una disminución en el contenido de factores angiogénicos y de sus receptores, acompañado de un aumento de la actividad de caspasa-3, enzima efectora clave en el proceso de apoptosis folicular. Se concluyó que el factor GnRH-I actuaría en el ovario localmente afectando factores esenciales para el desarrollo folicular. Este factor interfiere en la foliculogénesis inducida por gonadotrofinas, alterando la síntesis de esteroides gonadales e inhibiendo la angiogénesis folicular. Esto alteraría el balance de los factores de supervivencia de las células foliculares, causando la activación de proteínas reguladoras de la apoptosis, llevando a los folículos en desarrollo al proceso de atresia.

Descripción: La fiebre aftosa constituye un serio problema sanitario que afecta a las especies biunguladas que genera severas consecuencias económicas a nivel mundial. Las vacunas formuladas con virus inactivado como antígeno (Ag) inducen respuestas de anticuerpos seroneutralizantes (AcN) de corta duración y es necesaria la revacunación periódica. La infección experimental en ratón adulto genera una continua e intensa respuesta de AcN tal como sucede en el huésped natural. Esta prolongada síntesis de Acs anti-VFA hace del modelo murino un excelente sistema para el estudio de los mecanismos involucrados en una prolongada respuesta humoral. Aunque este fenómeno es conocido desde hace tiempo, las bases inmunológicas responsables de la prolongada inmunidad inducida luego de la infección se encuentran aún sin dilucidar. Con la intención de comprender la causa de la respuesta inmune humoral al VFA, la primera parte de este trabajo de tesis estuvo dirigida a aclarar si el mantenimiento de los niveles de Acs puede ser explicado por un fenómeno de infección persistente del individuo, o mediante una persistencia antigénica mediada por células presentadoras de antígeno (CPA). La segunda parte del trabajo de tesis fue dirigida a estudiar los mecanismos de acción de dos efectivos inmunomoduladores (Avridine -AVR- y la pared de Mycobacterium -PCM) en la inducción de una prolongada respuesta humoral. Es importante enfatizar que los ensayos de transferencia utilizados en este trabajo permitieron acotar el sistema a los esplenocitos transferidos, debido a que estas células resultaron suficientes para inducir una prolongada respuesta humoral en los animales receptores normales (Tabla 1). La hipótesis de la existencia de una infección persistente fue descartada mediante la utilización de varios métodos, en especial la falta de detección del genoma utilizando un ensayo de PCR cuya sensibilidad es de 10-3 DIRL 50%.(Tabla 3 A y B). Además, el hecho de que haya sido posible obtener resultados similares a través de la inmunización de los animales dadores con antígenos inertes corroboró que la replicación viral definitivamente no es una condición indispensable para que se induzca una prolongada respuesta humoral (figura 6B). La transferencia de esplenocitos irradiados provenientes de animales infectados a animales receptores presensibilizados y negativizados (inmunizados con bajas dosis de virus inactivado) permitió la detección funcional de CPA específicas para el virus aftoso. La inhibición de la presentación antigénica (PA) in vitro, los ensayos de inhibición de la PA in vivo y el establecimiento de una correlación entre la capacidad de presentar el Ag y el título de Acs del animal dador corroboraron que, en el modelo utilizado, la presencia de CPA es el mecanismo que media la prolongada respuesta humoral anti-VFA que se observa en animales que fueron infectados. Dos datos experimentales merecen ser destacados: (i) Las células B son suficientes para la producción del fenómeno (figura 16B). (ii) Las CPA fueron capaces de permanecer en el animal dador por lo menos 365 días después de la infección (figura 15 B) Conociendo que la presencia de CPA es el mecanismo que media la prolongada respuesta humoral anti-VFA en los animales infectados, se analizó: la capacidad de inducir CPA en los animales inmunizados con diferentes formulaciones vacunales. Los ensayos realizados demostraron que tanto las CPA que provenían de animales infectados así como las obtenidas de ratones que fueron inmunizados con las diferentes formulaciones fueron capaces de inducir Acs detectables por ELISA. Sin embargo, solamente los esplenocitos de animales infectados o inmunizados con la vacuna inmunomodulada con AVR indujeron Acs de tipo neutralizante en los ratones receptores presensibilizados (figura 20 B). La utilización del ensayo de doble transferencia (figura 22) demostró que la presencia de Ag circulante en el animal dador no es necesaria para el mantenimiento de las CPA (figura 24). Estos resultados son coincidentes con la continua presencia de CPA en los animales infectados (hasta los 365 días post-infección) en los cuales no es posible encontrar antígeno viral ni partículas infecciosas. Se utilizó un sistema de PA donde el antígeno a ser considerado es mucho más simple en términos de cantidad de determinantes antigénicos para intentar explicar la diferencia observada entre las respuestas inducidas por las distintas vacunas utilizadas. Los esplenocitos extraídos de los animales inmunizados con dosis crecientes correspondiente a la secuencia 135-160 de VP1 del VFA O1C (P1) indujeron respuestas correlativamente incrementadas de Acs detectables primero, por ELISA y, posteriormente, por SN. Estos resultados apuntalan la hipótesis que sostiene que las diferencias entre la inducción de anticuerpos neutralizantes y aquellos detectados solamente por ELISA puede ser meramente debida a la masa antigénica presentada. Posteriormente, se analizó el efecto de los dos inmunomoduladores en un posible procesamiento diferencial de las distintas porciones del P1 Los resultados demostraron que, en efecto, estas diferencias existen, ya que los patrones de reactividad demostrados por los sueros de los animales infectados e inmunizados con AVR resultaron similares y cualitativamente diferentes a aquellos presentados por los sueros de los animales inmunizados con PCM o el vehículo oleoso per se (figura 25). Esto sustentaría que adicionalmente a un fenómeno de tipo cuantitativo, también existe un factor cualitativo como explicación a las diferencias encontradas en la respuesta humoral inducida en los animales receptores de células provenientes de dadores inmunizados con diferentes inmunomoduladores. La estrecha correlación entre la presencia y actividad de las CPA específicas para VFA, y los titulos de Acs observados en los animales que fueron estimulados antigénicamente de la forma más diversa con (infectados experimentalmente o inmunizados con virus inactivo bajo muy diferentes condiciones), poderosamente sugiere que el mecanismo involucrado en el mantenimiento de la respuesta inmune es la presencia de CPA reestimulando en forma permanente la producción de Acs anti-VFA. Estos resultados son de importancia para el diseño y desarrollo de nuevas vacunas en las cuales se debería principalmente focalizar la atención en metodologías que estimulen la inducción y un eficaz mantenimiento de CPA especificas para VFA en los individuos vacunados.

Descripción: La Interleuquina 1β (IL-1β) es una citoquina proinflamatoria central en procesos fisiopatológicos que ejerce efectos pleiotrópicos sobre el sistema inmune innato y el adaptativo. A pesar de ser una proteína de exportación, la IL-1β carece de un péptido se~nal y es sintetizada en el citoplasma como una molécula precursora inactiva (proIL-1β), que tras ser procesada proteolíticamente, es secretada por mecanismos definidos de forma incompleta, que son independientes de la vía canónica de secreció celular que involucra al retículo endoplasmático y al aparato de Golgi. En este trabajo de tesis, investigamos los mecanismos involucrados en la secreción de IL-1β en neutrófilos aislados de sangre periférica humana. Nuestros estudios indicaron que la inhibición de la inducción de autofagia mediante el uso de inhibidores como 3-metiladenina y Wortmanina, o el bloqueo de lujo autofágico con Bafilomicina A1 (Baf A1) o E-64d, redujeron marcadamente la secreción de IL-1β inducida por LPS o LPS+ATP luego de 5 hs de cultivo. En neutrófilos diferenciados a partir de la línea celular PLB985, la reducción de la expresión (knockdow) de ATG5 mediante ARN de interferencia inhibió la secreción de IL-1β. En respuesta a la estimulación de neutrófilos con LPS+ATP, la IL-1β pudo ser detectada colocalizando con el marcador de vesículas autofágicas LC3B al ser analizadas por microscopia laser confocal a las 4 horas postestimulación (p.e.). En contraposición al impacto ejercido por la inhibición de la autofogia, su inducción por privación de nutrientes incrementó la colocalización entre IL-1β y LC3B a las 4hs. p.e., y promovió significativamente la secreción de IL-1β inducida por LPS+ATP a las 5 hs p.e. Dado que la secreción de IL-1β en neutrófilos requiere de la actividad de la NADPH oxidasa, nos planteamos como hipótesis que la actividad de la enzima es necesaria para evitar la acidificación de las vesículas que contienen IL-1β y de esta forma prevenir su degradación por proteasas ácidas lisosomales. En favor de esta posibilidad, el tratamiento de neutrófilos con inhibidores de la NADPH oxidasa como DPI y apocinina inhibió la secreción de IL-1β inducida por LPS+ATP y no modificó los niveles intracitoplasmáticos de la misma, sugiriendo que la IL-1β es degradada si la enzima es inhibida. Por otro lado, en neutrófilos estimulados por 4 hs. con LPS+ATP, la IL-1β pudo ser detectada colocalizando parcialmente con gp91 (componente de la NADPH oxidasa). Sin embargo, el tratamiento con DPI de neutrófilos estimulados con LPS+ATP no afectó la colocalización de la IL-1β vesicular con Lysotracker red, aunque disminuyó la colocalización de IL-1β con LC3B. Estos hallazgos indican que la actividad de la NADPH oxidasa es requerida para la secreción de IL-1β pero este efecto parece ser independiente de la acidificación de las vesículas que contienen a la IL-1β. Nuestros resultados no descartan que la NADPH oxidasa sea necesaria en otros pasos del proceso de secreción, como ser en la inducción del proceso autofágico o en la exocitosis de las vesículas autofágicas conteniendo IL-1β. Por último, también determinamos que una porción de la IL-1β sintetizada puede ser degradada por serin proteasas neutras, cuya actividad estaría determinada por el pH vesicular el cuál podría ser modulado por la actividad VATPasa. En conjunto, los hallazgos de este trabajo sugieren que la secreción de IL-1β en neutrófilos podría involucrar un mecanismo de autofagia secretoria y que la cantidad de IL-1β secretada dependería de su resistencia a ser degradada por proteasas antes de ser conducida al medio extracelular.

Descripción: La leptina presenta un papel importante en la reproducción, principalmente se ha sugerido que presenta funciones importantes en la placenta durante la gestación, donde se detectó su expresión y la de sus receptores. En mujeres embarazadas el nivel de leptina en suero aumenta en comparación a las no embarazadas, principalmente durante el segundo y tercer trimestre; aún antes de que se incremente el tejido adiposo. Originalmente la leptina, proteína de 16 kDa codificada por el gen LEP, fue descripta como una molécula producida por el tejido adiposo involucrada en la regulación del metabolismo al nivel central. La leptina placentaria podría tener efectos sobre el crecimiento, la angiogénesis y la inmunomodulación afectando tanto funciones maternas como fetales. En este trabajo, se analizó el efecto del 17β‐estradiol (E2) y las vías de señalización y factores de transcripción involucrados, sobre la expresión de la leptina en la placenta humana utilizando dos modelos experimentales, la línea celular BeWo, derivada de coriocarcinoma, y explantos de placentas normales humanas a término. Al analizar la importancia del factor de transcripción Sp1 sobre la regulación de la expresión de leptina mediada por estradiol, pudimos demostrar que la sobreexpresión de este factor incrementa la expresión de leptina determinada por Western blot. Más aún la sobreexpresión de un vector de expresión para Sp1 incrementa tanto la actividad basal del promotor de leptina como la inducida por E2. Específicamente aumenta la actividad de la región del promotor de leptina comprendida entre ‐1951 y ­‐1887pb que contiene al “enhancer” placentario de leptina (PLE). Estos resultados fueron confirmados al utilizar un inhibidor de Sp1, el ácido betulínico. En estos experimentos se pierde el efecto inductor de Sp1 sobre la expresión de leptina placentaria. La acción ejercida por este factor de transcripción sobre la expresión de leptina es dependiente de ERα ya que en las células que expresan un siRNA contra este receptor la sobreexpresión de Sp1 no tiene efecto alguno sobre la expresión de leptina. Además al utilizar un vector reportero que contiene el sitio halfERE mutado, la acción de Sp1 parecería anularse. Por otro lado al utilizar un vector que presenta el promotor de leptina con el sitio de unión para Sp1 mutado, la sobreexpresión de ERα no es capaz de inducir la expresión de leptina. Estos resultados sugieren que es necesario que se encuentre intacto el sitio de Sp1 para que se pueda evidenciar el efecto de ERα sobre la expresión de leptina placentaria. Además se evalúo la posible interacción de ERα y Sp1 por inmunoprecipitación. Se demostró que hay interacción entre ambas proteínas, ya que al inmunoprecipitar ERα, se puede evidenciar la presencia de Sp1 en el inmunoprecipitado, y al inmunoprecipitar Sp1 se puede observar ERα en el inmunoprecipitado. Lo que sugiere que habría un efecto cooperativo entre ambos factores en la inducción de la expresión de la leptina placentaria. El antagonista estrogénico, ICI 182,780 no generó inhibición alguna sobre el efecto del Sp1 sobre la expresión de leptina placentaria, lo que sugeriría que la inducción de Sp1 sobre la expresión de leptina no estaría siendo afectada por el inhibidor ICI 182,780. Encontramos también que la expresión basal e inducida por E2 se ve disminuida con el tratamiento con el inhibidor del factor NFκB, sulfasalazina, sugiriendo la participación de los dímeros del NFκB en los efectos regulatorios de dicho esteroide. A través de transfecciones transitorias hemos observado que la sobreexpresión de la subunidad p65 (Rel-­‐A) aumenta la actividad transcripcional basal del promotor de leptina y por otro lado la sobreexpresión de Rel-­‐A en las células BeWo-­‐Sh2, que poseen los niveles de ERα disminuidos por la estrategia de siRNA, produce una marcada disminución de la actividad basal del promotor de leptina, sugiriendo que el efecto de la sobreexpresión de p65 sobre el nivel basal de actividad del reportero sería dependiente de la expresión de ERα ya que al disminuir los niveles de este receptor el efecto de p65 se suprime. Por otro lado la sobreexpresión de p65 no estaría afectando la expresión de leptina mediada por E2 en presencia o ausencia de ERα. Se ha evaluado también la presencia y localización de ERy la subunidad p65 en las células BeWo, por ensayo de inmunofluorescencia y su posible interacción por coinmunoprecipitación. Hemos encontrado que ambas proteínas se encuentran localizadas en el citoplasma y cuando son sobreexpresadas migran al núcleo. Por otro lado determinamos que en las células BeWo estos dos factores de transcripción estarían interactuando, ya que al inmunoprecipitar ER, se pudo observar p65 en el inmunoprecipitado. Lo que sugiere que existiría un efecto cooperativo entre el ER y el NFκB. Hemos observado que el incremento de la expresión de leptina por estradiol en células BeWo depende de la integridad de la vía de señalización mediada por PKA, debido a que tratando a las células con inhibidores de ésta vía, H89 y SQ22536 se produce una disminución de su efecto. También observamos que la sobreexpresión de mutantes dominantes negativas para el factor de transcripción CREB anulan el efecto de estradiol sobre la expresión de leptina placentaria. Por otro lado la sobreexpresión de CBP, produce una estimulación del efecto inductor de estradiol, mientras que la sobreexpresión con HDAC, una deacetilasa de histonas, genera el efecto contrario. El tratamiento con tricostatina A (TSA), un inhibidor de la actividad acetiltransferasa, contrarresta el efecto de HDAC­‐1. Esto indicaría que la regulación de la expresión de leptina por estradiol sería un proceso multifactorial que involucraría la activación de la vía de señalización de PKA y la modificación de la acetilación de histonas. Los resultados obtenidos contribuyen a mejorar la compresión de la expresión de leptina en la placenta humana así como las vías de señalización y factores de transcripción que actúan en la acción del E2 sobre la expresión de la misma.

Descripción: La actividad de HO-1 ha sido asociada a una plétora de efectos biológicos. En particular estudios previos de nuestro grupo de trabajo han demostrado su rol como modulador autócrino/parácrino de la esteroidogénesis en la corteza adrenal de ratas estimuladas con ACTH [1] y LPS [2], así como su acción citoprotectora como parte del sistema antioxidante adrenal. En el presente trabajo de tesis estudiamos mecanismos de inducción de HO-1 en células adrenales. Los resultados obtenidos confirman que el tratamiento de células Y1 con ACTH induce la transcripción de HO-1. Se localizó una zona del promotor murino de HO-1 de 400 pb aledaña al inicio de la transcripción, donde se encontraron secuencias consenso para la unión de los factores de transcripción CREB y AP-1. Se demostró también la participación de la vía de transducción de señales de AMPc/PKA/CREB y de Akt/PKB en el mecanismo de inducción de HO-1 por ACTH. El LPS incrementó la transcripción de HO-1 por un mecanismo que involucra una zona del promotor de aprox. 516 pb (entre -3216 y -2700). Tras el estímulo con LPS constatamos, además, la activación del factor de transcripción NFκB y la regulación de la expresión de HO-1 por la vía de la PKA. Finalmente, encontramos evidencias que nos permiten afirmar que el NO también induce a la HO-1 incrementando su transcripción, por un mecanismo que involucra la activación del factor de Nrf2, la actividad de PKC, la activación de la GCs y la generación de GMPc. En suma, demostramos que diferentes estímulos son capaces de activar la transcripción de HO-1, en células adrenales Y1, utilizando diferentes mediadores y factores de transcripción. Dado su rol modulatorio en la síntesis de glucocorticoides adrenales además de sus efectos citoprotectores, este conocimiento podría utilizarse para diseñar estrategias dirigidas a inducir HO-1 como un blanco novel alternativo en el tratamiento de patologías que cursan con disfunción adrenal.

Descripción: Fil: Valli, Eduardo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: El objetivo del presente trabajo fue evaluar los posibles mecanismos involucrados en la disminución de la capacidad de acidificación tubular proximal en ratas seniles. Mediante experimentos de micropuntura determinamos la contribución del flujo de bicarbonato (JHCO3-) sensible a EIPA (inhibidor del intercambiador Na+/H+) y a bafilomicina (inhibidor de la V-H+ATPasa) en túbulo contorneado proximal (TCP) de ratas adultas jóvenes (3 meses) y seniles (18-20 meses). Por Western blot evaluamos, en vesículas de membrana luminal de TCP de animales adultos jóvenes y seniles, la abundancia de las isoformas NHE3 y NHE8 del intercambiador Na+/H+ y de la V-H+ATPasa. Realizamos experimentos de RT-PCR en homogenatos de corteza renal de ambos grupos experimentales para evaluar la expresión del ARNm de NHE3, NHE8 y H+ATPasa. Determinamos la concentración plasmática de la hormona paratiroidea (PTH) y la cantidad de AMPc presente en corteza renal de ambos grupos experimentales. Las ratas seniles poseen un JHCO3- 30% menor que los animales adultos jóvenes. En ratas jóvenes, EIPA reduce JHCO3- un 60% y bafilomicina un 30%, mientras que en animales seniles EIPA reduce JHCO3- aproximadamente un 60% y bafilomicina un 50%. La abundancia de la proteína y la expresión del ARNm de NHE3 y de la V-H+ATPasa fueron similares entre ambos grupos experimentales, en tanto que la cantidad de proteína y de ARNm de NHE8 fue menor en los animales seniles que en los adultos jóvenes. La concentración de PTH se encuentra aumentada en los animales seniles. Si bien la concentración de AMPc observada en la corteza renal de animales adultos jóvenes no fue significativamente diferente, en los animales seniles mostró una tendencia a aumentar. Estos resultados sugieren que el intercambiador Na+/H+ está afectado en la reabsorción de bicarbonato en el TCP de ratas seniles y que la isoforma, sensible a EIPA, responsable de la reducción del flujo de bicarbonato en estos animales es NHE8. Sin embargo, no podemos descartar mecanismos de regulación de la actividad de la V-H+ATPasa o de la isoforma NHE3 no relacionados con la transcripción o traducción de estas proteínas. Una de las alternativas para la regulación del intercambiador Na+/H+ sería la inhibición de la PTH sobre su actividad por medio de un mecanismo alternativo al mediado por AMPc.

Descripción: El eje hipotalámico-hipofisiario es una estructura fundamental en el control neuroendócrino del organismo y es en la eminencia media donde se establece la principal conecxión entre ambos componentes a travéz de la liberación de factores hipofisotropos controladores de la secreción hormonal hipofisiaria. De este modo la liberación de PRL está sujeta principalmente a un control tónico de tipo inhibitorio ejercido por la DA, mientras que la sereción de la GH está controlada por la liberación cíclica de GHRH y STT. A nivel periférico, los estrógenos son los principales estimuladores de la síntesis y secreción de PRL y un tratamiento estrogénico crónico produce en la rata el desarrollo de nuestro modelo experimental: un prolactinoma o adenoma de lactotropos. La Angiotensina II (AII), además de ser una hormona involucrada en la regulación de la presión arterial sistémica, es uno de los factores que inducen endócrina y parácrinamente la secreción de PRL. Este octapéptido resulta interesante porque tiene además en diferentes tejidos efectos de tipo proliferativo y angiogénico y, en muchos casos, las acciones estimulatorias ejercidad a través del receptor AT1 son parcialmente compensadas y reguladas por efectos opuestos producidos vía AT2. El sistema renina-angiotensina (SRA) hipofisiario local se encuentra ampliamente influenciado por la acción estrogénica , y nosotros ya habíamos descripto en trabajos previos una alteración de la respuesta a AII en la hipófisis hiperplásica. Especificamente, se encontró alterado el patrón de movilización interna del ciclo y la secreción de PRL. Por los tanto la primera parte de la tesis decidimos analizar con el mayor detalle algunas de las alteraciones de la respuesta a AII en los tumores hipofisiarios, especificamente en relación con la participación de los subtipos de sus receptores. De este modo detectamos por Western-blot y por RT-PCR que el tratamiento estrogénico induce una sobreexpresión de AT2 y una subexpresión de AT1 en hipófisis. Por otro lado, describimos por primera vez la activación de ERK1/2 en la respuesta hipofisiaria a AII y definimos la vía de transducción involucrada en la glándula normal. Este proceso involucra la activación de una proteina Gq, un aumento intracelular del calcio y la transactivación del receptor EGF vía una tirosin kinasa no receptora de la familia Scr. Encontramos además que, en el caso del prolactinoma, la activación de ERK1/2 incluida por AII está en parte mediada por AT2, siendo ésta la primera evidencia de la participación funcional de este receptor en la hipófisis. La terapia farmacológica actual de los prolactinomas en muchos casos no resulta ser suficiente ni definitiva, ya que muchas veces es necesario recurrir a una combinación de cirugía y fármacos, e incluso así, el tumor suele reincidir una vez suspendida la aplicación de la droga. Por lo tanto se continúa en la busqueda de nuevas y más eficientes alternativas para completar la farmacoterapia tradicional. Se ha descripto que la progesterona (P4) es capaz de antagonizar efectos estrogénicos y que la dehidroepiandrosterona (DHEA) tiene un amplio espectro de acciones antitumorales y rejuvenecedoras. Entre otras cosas, DHEA inhibiría la génesis y progresión de distintos tipos de tumores de piel, pulmón, hígado, cólon, mama y próstata. Por otro lado se le ha adjudicado a este esteroide efectos benéficos sobre otras patologías asociadas al envejecimiento y el estrés, como enfermedades cardiovasculares, diabetes, enfermedades autoinmunes, obesidad y decaimiento cognitivo o anímico. Sin embargo, también se han descripto en algunos casos efectos deletéreos asociados a un tratamiento prolongado con dosis farmacológicas de DHEA. Entre ellos, una acción estrogénica sobre algunos tumores estrógeno-dependientes, hipertrofismo uterino y hepático, y desarrollo de ovarios poliquísticos. Por lo tanto decidimos estudiar el efecto de la P4 y la DHEA en nuestro modelo de hiperplasia hipofisiaria. Un tratamiento in vivo con P4 no evidenció efectos de tipo terapéutico, ya que no redujo el aumento del peso hipofisiario ni la hiperprolactinemia inducida por el tratamiento crónico con estrógenos. Sin embargo, pudimos determinar que la P4, sinergizando con los estrógenos, induce la participación de AT2 en la secreción de PRL astimulada por AII, lo que constituye la segunda evidencia de la participación funcional de este receptor en la hipófisis. En cuanto al tratamiento con DHEA, demostramos por primera vez su efecto benéfico sobre el tumor hipofisiario inducido por estrógenos, ya que fue capaz de revertir parcialmente los parámetros tumorales mencionados. Sin embargo, el esteroide mostró también per se una cierta acción hiperplásica, prolactinoliberadora y, bajo ciertas condiciones, estimuladora de la secreción de GH. En células adenohipofisiarias normales en cultivo evidenciamos una acción directa de DHEA a nivel hipofisiario. Si bien no se modificó la secreción basal de PRL y GH, si se vió alterada la respuesta a reguladores hiportalámicos. Así, demostramos que DHEA en hipófisis potencia la liberación de PRL y GH en respuesta a AII y a GHRH respectivamente y reduce la inhibición ejercida por la DA y la STT. Determinamos asimismo que la influencia de DHEA sobre la acción dopaminérgica estaría mediada por la movilización de calcio intracelular, mientras que la influencia sobre la cción de la GHRH estaría mediada por el AMPc. Creemos que los resultados presentados en esta tesis contribuyen a una mayor comprensión de los mecanismos que relacionan la acción estrogénica con la actividad de componentes del SRA, lo que es importante a la hora de entender en mayor profundidad procesos tumorigénicos que implican tanto la hiperplásia como la angiogénesis. Por otro lado, aportan a la explicación de las actuales controversias existentes en relación con la acción de DHEA sobre algunos tipos de tumores, especialmente estrogéno-dependientes, y de los efectos secundarios que muchas veces presenta un tratamiento crónico con este esteroide.

Descripción: La eritropoyetina (Epo) es una glicoproteína perteneciente a la familia de las citoquinas producida por los riñones en el individuo adulto. Su principal acción es inducir proliferación, supervivencia y diferenciación de los progenitores eritroides. La anemia, uno de los signos que más contribuye al deterioro de la calidad de vida de los pacientes con insuficiencia renal, es principalmente atribuida a la disminución del aporte de Epo debido a la reducción de la masa funcional del riñón. La purificación y clonación de esta citoquina permitió la generación de eritropoyetina recombinante (rHuEpo) usándose, en un principio, para contrarrestar la anemia de la enfermedad renal crónica, dado que el tratamiento permitía disminuir la frecuencia de transfusiones, reducir la mortalidad y mejorar la calidad de vida de los pacientes. Luego se expandió el uso de la rHuEpo al tratamiento de la anemia asociada a distintas patologías crónicas. A partir del hallazgo de la expresión del receptor de Epo (EpoR) en tejidos no hematopoyéticos y la habilidad protectora de rHuEpo frente a respuestas inflamatorias o estímulos apoptóticos se amplió la posibilidad de su espectro terapéutico. Sin embargo, esta acción no eritropoyética necesita dosis más elevadas que las utilizadas para el tratamiento de la anemia. Diversos ensayos han vinculado el uso de altas dosis de Epo con distintos efectos negativos, como estados protrombóticos o problemas cardíacos. A pesar del éxito del uso de la rHuEpo y sus derivados en diversas patologías, un porcentaje de pacientes no responde al tratamiento. Las dosis de la hormona requeridas para un tratamiento efectivo, así como la sensibilidad de los pacientes a la droga, varían ampliamente. No sólo se han descripto efectos negativos debido a las dosis elevadas, sino también resistencia al tratamiento con la hormona en pacientes que reciben dosis elevadas de rHuEpo pero no pueden alcanzar los niveles adecuados de hemoglobinemia. Teniendo esto en cuenta, el objetivo de esta Tesis Doctoral es ampliar el conocimiento acerca de mecanismos que pueden estar involucrados en la inhibición de los efectos biológicos de Epo. Durante el desarrollo del plan de trabajo se utilizaron líneas celulares con capacidad de diferenciación eritroide en ensayos realizados para investigar el efecto de altas concentraciones de Epo sobre la funcionalidad de la citoquina. Por otro lado, se evaluó la acción de Epo en condiciones inflamatorias o en presencia de posibles “toxinas” que suelen acumularse en la insuficiencia renal crónica y/o en enfermedad cardiovascular. Resultados previos del laboratorio mostraron que la Epo protege a células K562 diferenciadas al linaje eritroide de la apoptosis inducida por la citoquina proinflamatoria TNF- α. En este trabajo se observó que este efecto protector de Epo desaparece al aumentar su concentración. La falta de cambios en la expresión del EpoR nos llevó a estudiar mecanismos involucrados con el cierre de la señal. Se sabe que la unión de Epo a su receptor ocasiona la internalización del mismo, la cual es mediada por el proteasoma. El uso del inhibidor de proteasoma MG132, permitió recuperar la actividad antiapoptótica de la Epo, sugiriendo que el uso de altas concentraciones de Epo afectaría la internalización del EpoR, llevando a la pérdida de función observada. En los pacientes con enfermedad renal en etapa terminal se detecta un aumento del aminoácido no esencial homocisteína (Hcy) en sangre (hiperhomocisteinemia, HHcy). Además, se ha reportado que la HHcy puede originar un aumento intracelular de la concentración de S-adenosilhomocisteína (SAH), potente inhibidor competitivo de la mayoría de las enzimas metiltransferasas. En estadios crónicos, esta patología se asocia también a procesos inflamatorios. La acumulación de Hcy y adenosina (Ado) produce un desfasaje del ciclo de la metionina que lleva a la hipometilación de ADN. La importancia biológica de los niveles aumentados de SAH se registra principalmente en su rol en la regulación génica y en la transducción de señales. Para evaluar el efecto debido a la presencia de los dos compuestos y su relación con la función de Epo, células K562, en distintos estadios de diferenciación eritroide, fueron incubadas con Hcy y Ado, agregando a los cultivos TNF- α para simular condiciones inflamatorias. La presencia de Hcy-Ado aumentó la apoptosis celular, incrementando la actividad de caspasa 3, e indujo resistencia a la acción antiapoptótica de Epo frente al TNF- α. Se demostró que la despolarización de la membrana mitocondrial, provocada por la presencia de Hcy-Ado-TNF-α, está involucrada en el mecanismo de resistencia observada en estos tratamientos. La homocisteína tiolactona (HTL) es un derivado reactivo de la Hcy y puede unirse de forma covalente a los grupos ε-amino de los residuos lisina de las proteínas, en una reacción llamada N-homocisteinilación. Aquí, se demostró que la Epo puede ser N-homocisteinilada (HTLEpo). Se observó disminución de la proliferación y aumento de la apoptosis de las células UT-7, dependientes de Epo, al ser tratadas con la hormona previamente incubada con HTL. Mediante diversos estudios estructurales se demostró que la molécula de Epo sufre modificaciones por N-homocisteinilación. La Epo N-homocisteinilada muestra un aumento en las estructuras de hoja- β en detrimento de α-hélice. Este aumento de hojas- β repetitivas se relaciona con la formación de oligómeros, con menor movilidad electroforética. El aumento del radio de la proteína N-homocistenilada, determinado por la técnica de dispersión de luz dinámica, apoya la hipótesis de la formación de oligómeros solubles. Estos cambios estructurales en la molécula perturbarían la adaptación espacial requerida para una interacción ligando-receptor eficiente y, por lo tanto, se produciría la alteración de las funciones proliferativa y antiapoptóticas de Epo. Los resultados presentados en esta Tesis Doctoral intentan ampliar los conocimientos referentes a posibles mecanismos involucrados en la resistencia al tratamiento con Epo en varias patologías. En modelos celulares, observamos en presencia de altas concentraciones de Epo, una alteración de su funcionalidad, relacionada con un aumento de la velocidad de silenciamiento del receptor, vinculamos un posible efecto entre el aumento de la concentración de Hcy y Ado con la resistencia a la activación celular por Epo y describimos por primera vez la modificación estructural ocasionada por N-homocisteinilación de la Epo que conduce a alteraciones funcionales.

Descripción: La insulino resistencia se define como la baja habilidad de la insulina para ejercer sus acciones metabólicas. Se sabe que este estado metabólico alterado es capaz de afectar a los tejidos de manera diferente. El período prenatal es un momento crítico del desarrollo en el cual el feto es vulnerable a alteraciones en el ambiente materno que predisponen al desarrollo de patologías durante la vida adulta. Con un modelo murino de programación fetal por exceso de andrógenos hemos logrado emular en ratas adultas características de tipo síndrome de ovario poliquístico, dando dos fenotipos característicos uno ovulatorio irregular y otro anovulatorio. Estos dos fenotipos presentan un estado metabólico alterado caracterizado por una hiperglucemia, hiperinsulinemia e insulino resistencia sérica; y una insulino resistencia hepática que afecta tanto el metabolismo de la glucosa como la lipogénesis. A su vez encontramos alteraciones en la vía de señalización de la insulina en el ovario de manera fenotipo dependiente; estas alteraciones conllevan a una disminución de la respuesta metabólica a la insulina que es capaz de comprometer la fisiología del ovario y que se traduce en las alteraciones ovulatorias encontradas. Estas alteraciones encontradas tanto a nivel metabólico como reproductivo son reversibles a distintos niveles luego de un tratamiento con metformina.

Descripción: Experimentar situaciones de adversidad durante los períodos críticos del desarrollo del cerebro puede tener consecuencias deletéreas sobre el sistema nervioso central. En efecto, la malnutrición proteica materna tiene consecuencias a largo plazo que impactan en el desarrollo cerebral de la progenie y en el comportamiento tanto de las madres como de las crías. No obstante, se ha demostrado que un ambiente de crecimiento basado en la estimulación social y sensorial puede revertir el comportamiento alterado derivado de la malnutrición proteica perinatal. Dado el rol mediador que tiene la epigenética entre el ambiente y la expresión génica, se sugiere que los mecanismos epigenéticos podrían responder a los factores externos como la dieta y el entorno de crecimiento, y de esta manera, modular el fenotipo comportamental. Sin embargo, poco se sabe de los mecanismos moleculares y epigenéticos que median las consecuencias de la malnutrición proteica en las madres y las crías, como así poco se sabe de las marcas epigenéticas que podrían estar regulando la expresión génica y participando de la reversión comportamental dado por el ambiente enriquecido. Nuestra hipótesis sostiene que la malnutrición proteica tiene un impacto sobre la morfología del cerebro de las crías y afecta la expresión de genes relacionados con la maquinaria epigenética y la respuesta al estrés tanto en las madres como en las crías, dando origen a las alteraciones comportamentales. A su vez, sugerimos que el ambiente de crecimiento es capaz de revertir las alteraciones en la conducta derivadas de la malnutrición perinatal a través de la marca epigenética específica de cerebro 5-Hidroximetilcitosina (5hmC). Para contrastar esta hipótesis, trabajamos con un modelo murino y expusimos a las madres a una dieta normal (NP: 20% caseína) o hipoproteica (LP: 8% caseína) durante la gestación y la lactancia. Luego del destete, un grupo de crías hembras fueron alimentadas con comida normal y expuestas o bien a un ambiente estándar de crecimiento, o bien a un ambiente enriquecido social y sensorialmente. Encontramos que, en las madres, la actividad transcripcional de los genes relacionados con la maquinaria epigenética, genes asociados a la plasticidad neuronal y con la respuesta al estrés, no se ven afectados por la malnutrición. Sin embargo, observamos que la expresión proteica del receptor de glucocorticoides (GR) se ve disminuida en el grupo LP. En las crías, la malnutrición proteica perinatal no produce alteraciones considerables a la edad de 21 días en ninguno de los dos sexos sobre la anatomía de las estructuras del cerebro evaluadas tanto a nivel del hipocampo dorsal como del hipocampo ventral. Sin embargo tiene efectos sexo-específicos sobre la expresión de los genes relacionados con la maquinaria epigenética, genes asociados a la plasticidad neuronal y de la respuesta al estrés, encontrándose las mayores diferencias en las crías hembras. Además, encontramos que al igual que en las madres, la proteína GR se encuentra disminuida en las crías hembras hipoproteicas. También, evaluamos la distribución de la marca epigenética 5hmC en el hipocampo ventral de ratones hembra sujetas solo al modelo de malnutrición y al modelo de malnutrición más ambiente enriquecido. Observamos que esta marca se distribuye diferencialmente en el cuerpo del gen de acuerdo con la dieta y el ambiente de crecimiento. Al analizar las DhMRs (regiones diferencialmente hidroximetiladas), encontramos que la malnutrición está asociada a una disminución de la marca epigenética, específicamente en genes relacionados con el desarrollo del sistema nervioso central, mientras que la exposición a un ambiente enriquecido bajo el modelo de malnutrición perinatal aumenta la marca en genes relacionados con dichos términos. Finalmente, analizamos la expresión global de los genes mediante un RNAseq. Se encontró un número significativo de genes cuya expresión se vio afectada por la malnutrición y que revierten sus niveles debido al ambiente enriquecido. Además, si bien la marca 5hmC no parece estar asociada al proceso de transcripción bajo el modelo de malnutrición, podría estar regulando los niveles transcripcionales de genes afectados por el ambiente de crecimiento. En conclusión, en este trabajo de tesis demostramos que una dieta materna deficiente de proteínas altera la expresión de genes relevantes del eje HPA en las madres y en las crías hembras. Además, evidenciamos que la malnutrición proteica perinatal afecta la expresión génica de ciertos genes relacionados con la maquinaria epigenética, la plasticidad neuronal y de la respuesta al estrés en las crías hembras y machos de forma sexo-específica. Por último, demostramos que tanto la distribución de la marca específica de cerebro 5hmC, como la expresión de ARN se ven alteradas debido a la malnutrición proteica, y que los niveles de algunos genes pueden revertirse gracias al ambiente enriquecido.

Descripción: La hormona liberadora de corticotropina (CRH) ejerce un rol central en la respuesta neuroendocrina y comportamental al estrés, dirigiendo la activación del eje hipotálamo- hipófisis-adrenal y actuando como neuromodulador en el sistema nervioso central. Su desregulación se relaciona con desórdenes psiquiátricos y con el inicio de procesos neurodegenerativos. Nuestro objetivo es definir las vías de señalización de CRH por el receptor CRHR1 y los componentes moleculares involucrados, con potencial relevancia terapéutica en desórdenes ligados a estrés. CRHR1 es un GPCR clase B que se encuentra generalmente acoplado a proteína Gs, por lo que su activación promueve el aumento intracelular del segundo mensajero AMP cíclico (AMPc) y la consecuente activación de diversas cascadas de señalización. Hasta el momento, la vía de las MAP quinasas (MAPKs) fue la más estudiada río abajo de este receptor. En trabajos previos hemos descripto que el CRHR1 activa mecanismos dependientes de proteína G y otros dependientes de la endocitosis, los cuales se evidencian en la activación bifásica de la MAPKs ERK1/2 en la línea celular hipocampal murina HT22 que expresa el receptor de CRH tipo 1 (HT22-CRHR1). Hemos demostrado además que existen dos fuentes de AMPc asociadas a la activación del CRHR1, que involucran no solo a las adenilil ciclasas transmembrana (tmACs) sino también a la adenilil ciclasa soluble (sAC). Ambas fuentes participan en la fase aguda de activación de ERK1/2 pero solo sAC es esencial para la activación sostenida de esta quinasa. Como se ha descripto recientemente para un grupo de GPCRs, el CRHR1 activado continúa señalizando luego de su internalización. Akt es una serin/treonin quinasa presente en la mayoría de los tejidos, cuya actividad media procesos celulares diversos como el crecimiento, la proliferación y el metabolismo. En el cerebro, la vía de Akt tiene implicancias en la respuesta a estrés, la neurotransmisión y la plasticidad sináptica. A su vez, se ha descripto que el efecto antidepresivo de numerosas drogas es mediado por la cascada de PI3K-Akt. En este trabajo nos propusimos evaluar si la vía de PI3K-Akt estaba involucrada en la señalización del sistema CRH/CRHR1 y si existía un crosstalk con la ya descripta cascada de MAPKs. En las HT22-CRHR1, Akt se fosforila en respuesta al estímulo de CRH y esta fosforilación es dependiente del pool de AMPc generado por la sAC. Sin embargo, esta activación no depende de los efectores clásicos de AMPc (PKA y EPACs) sino que parece estar mediada por la proteína quinasa Src. En base al estado de fosforilación de diversos sustratos pudimos determinar que el Akt fosforilado (pAkt) es funcional en estas células. El perfil de activación de Akt resultó ser opuesto al de ERK1/2 lo cual sugería una posible conexión entre estas vías. La inhibición farmacológica de MEK no tuvo efecto sobre la activación de Akt, mientras que inhibir tanto PI3K como Akt disminuyó los niveles de ERK1/2 fosforilado (pERK1/2) en respuesta a CRH. Por el contrario, la inhibición de la vía PI3K-Akt llevó a un aumento de la respuesta global de AMPc mediada por CRH y de CREB fosforilado (pCREB). Teniendo en cuenta que la activación de Akt solapa temporalmente con la segunda fase de activación de ERK1/2 que es dependiente de la endocitosis, evaluamos los niveles de pAkt en células en las que la internalización fue bloqueada. Determinamos que al igual que para ERK1/2, la endocitosis del CRHR1 es crucial para la fosforilación de Akt. Mediante el análisis de colocalizaciones entre el receptor y marcadores de distintos compartimentos de vesículas y organelas de membrana, exploramos la identidad de las estaciones por las que transita el CRHR1 luego de su internalización. CRHR1 activado se detecta en endosomas tempranos (Rab5+), de reciclado (Rab11+) y en un compartimento sintaxina-6 positivo. CRHR1 colocaliza además, con los efectores de Rab5 APPL1 y EEA1. En HT22-CRHR1 silenciadas establemente mediante el uso de shRNAs, la depleción de APPL1 disminuyó los niveles de pAkt sin afectar la fosforilación de ERK1/2 en respuesta a CRH, mientras que la pérdida de EEA1 tuvo el efecto contrario. Estos resultados indican que la vía de PI3K-Akt se activa río abajo del CRHR1 en un contexto neuronal y que existe un crosstalk entre Akt y ERK1/2. Por otra parte, el hecho de que la fosforilación de Akt sea dependiente de la internalización del receptor y de la proteína endosomal APPL1, refuerza la idea de que el CRHR1 activado señaliza desde compartimientos intracelulares.

Descripción: La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa que se caracteriza por la degeneración gradual y muerte de las neuronas motoras de la médula espinal. Aunque en estos últimos años se han producido muchos adelantos sobre las posibles causas de la ELA, todavía no se conoce la fisiopatología de la enfermedad. El objetivo de este trabajo fue profundizar el conocimiento sobre los mecanismos celulares y moleculares que contribuyen a la muerte celular de las motoneuronas, para así entender su muerte selectiva en la ELA. Para el estudio de las características específicas a nivel de células individuales, utilizamos cultivos puros de motoneuronas espinales de rata. En esta tesis doctoral demostramos que, a pesar de que las motoneuronas exhiben una alta dependencia de los factores tróficos para su sobrevida, ciertas combinaciones de factores tróficos desencadenan una muerte apoptótica similar a la descrita para las motoneuronas crecidas en ausencia total de factores tróficos. Dicha muerte celular apoptótica es mediada por el receptor de neurotrofinas p75NTR y depende de la inhibición de la vía de PI3K/Akt y de la activación de la vía JNK, seguidas de la producción de especies reactivas del nitrógeno y la posterior formación de nitrotirosina. Asimismo, demostramos que la formación de nitritirosina en proteínas de las motoneuronas desencadena la muerte celular apoptótica observada en ausencia total de factores tróficos, ya que la presencia de péptidos que contienen tirosina en su secuencia disminuye la nitración endógena y previene la apoptosis, siendo los derivados radicales de la descomposición del peroxinitrito los agentes causantes de esta nitración. Nuestros estudios también demuestran que una de las proteínas nitradas en estas condiciones es la proteína de choque térmico 90 (HSP90), siendo las motoneuronas particularmente sensibles a la inhibición de la actividad ATPasa de la HSP90. La HSP90 también esta nitrada en médulas espinales de pacientes de ELA y en ratones transgénicos usados como modelo experimental de la enfermedad. De estos resultados podemos concluir que la decisión de la motoneuronas en vivir o morir está altamente regulada y que un mismo factor trófico puede producir efectos tan opuestos como activar la apoptosis o inhibirla, dependiendo de su entorno celular.

Descripción: Experimentos de nuestro laboratorio indican que la proteína epididimaria DE/CRISP-1 participa en el proceso de fusión de gametas, a través de sitios complementarios en el ovocito, de identidad aún desconocida. Los experimentos bioquímicos realizados con el fin de identificar a la molécula receptora para DE en el oolema permitieron detectar a un complejo DE-receptor, cuya caracterización final requerirá de tecnologías alternativas, al igual que lo descripto para los receptores espermáticos en ovocitos de invertebrados. Dado que la fusión de gametas desencadena la activación del ovocito, investigamos la posible participación de DE en dicho proceso, observándose que la proteína no cumpliría una función en etapas posteriores a la fusión. Contrariamente, nuestros resultados indicando la capacidad de DE de disgregar las células del cúmulus como así también de asociarse a la zona pelúcida sugirieron que la proteína cumpliría un rol en las etapas previas a la fusión, tales como la penetración del cúmulus y la interacción con la zona pelúcida. La alta homología de la proteína epididimaria DE/CRISP-1 con la proteína testicular Tpx-1/CRISP-2, también presente en el espermatozoide, sugería la existencia de posibles funciones comunes entre ambas moléculas. Nuestros resultados indicaron que Tpx-1 también participaría en la fusión de gametas a través de sitios complementarios en la superficie del ovocito. En conjunto, los resultados de esta tesis indicaron que, mientras que una proteína CRISP del espermatozoide (CRISP-1) podría participar en varias etapas de la fertilización, también podría existir más de una CRISP (CRISP-1 y CRISP-2) involucrada en un mismo evento. La información obtenida permitirá una mayor comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en la interacción de gametas, contribuyendo así al desarrollo de futuros métodos de regulación de la fertilidad, tanto en animales como en el humano.

Descripción: Las citoquinas inducen la producción de glucocorticoides (GC), los cuales inhiben la producción de citoquinas y sus acciones biológicas, protegiendo al organismo de una respuesta inmune exacerbada. Se observó que el factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) aumentó la actividad transcripcional inducida por GC vía elementos respondedores a GC (GRE) en fibroblastos de ratón L-929 transfectadas con un plásmido reporter inducible por GC. Además, TNF-a aumentó el número de receptores para GC (GR) y la actividad transcripcional en el promotor de GR (HGRP) en células L-929 transfectadas con un plásmido reporter HGRP. TNF-a no tuvo efecto en células que no expresan GR pero que sí expresan receptores para TNF-a, aunque, el efecto fue evidente cuando estas células fueron cotransfectadas con un vector de expresión para GR. Estas acciones ponen de manifiesto, que TNF-a puede aumentar la actividad transcripcional de GR en respuesta a GC independientemente del aumento en el número de GR. Más aún, TNF-a aumentó la unión de GR a GRE. Como correlato biológico de estos efectos, un priming (preincubación) de TNF-a (dosis baja, no citotóxica) aumentó significativamente la sensibilidad a la acción inhibitoria de los GC sobre la citotoxicidad/apoptosis inducida por TNF-a en las células L-929. TNF-a e IL-1b tuvieron el mismo efecto estimulatorio sobre la actividad transcripcional de GR en distintos tipos celulares (glioma, epiteliales, hipofisiarias). Concluimos que, las citoquinas, pueden modular la acción de los GC a nivel molecular aumentando la sensibilidad a sus efectos reguladores en la célula blanco.

Descripción: La mayoría de las células son resistentes a la apoptosis inducida por TNF-ᵅ y sesensibilizan cuando se inhibe la activad transcripcional de NF-kB o bien en presencia deinhibidores de la síntesis proteica capaces de inhibir la expresión de genes antiapoptóticos. En esta tesis analizamos el rol del estrés osmótico en la apoptosis inducidapor TNF-ᵅ. Nosotros encontramos que éste es capaz de sensibilizar a células HeLaresitentes a la apoptosis inducida por TNF-ᵅ y que esta sensibilización involucra, unaumento de la actividad de varias MAPKs, la inhibición de la expresión de Bcl-2 y elaumento en una etapa tardía de la actividad de NF-kB. La muerte ocurre a pesar delaumento de la actividad de NF-kB, cuya inhibición por otro lado causa un aumentomayor de la apoptosis. La proteína quinasa p38 parecería estar involucrada en laactivación de NF-kB ya que su inhibición provoca un aumento significativo del efectodel estrés osmótico en la apoptosis inducida por TNF-ᵅ. Se ha demostrado previamente que dosis bajas de TNF-ᵅ tienen un rolsensibilizador a la acción de los glucocorticoides en su protección de la apoptosisinducida por esta citoquina. En este trabajo estudiamos las señales inducidas por TNF-ᵅque podrían estar involucradas en la regulación de la actividad del receptor deglucocorticoides. Analizamos el rol de las MAPKs en la regulación de las actividadesbiológicas del receptor de glucocorticoides, en un modelo de células sensibles a laapoptosis inducida por TNF-ᵅ, donde los glucocorticoides son capaces de proteger a lascélulas de dicha muerte. Nosotros observamos que las cinco MAPKs mejorcaracterizadas hasta el momento son capaces de fosforilar al GR in vitro y que cuatromiembros de esta familia, JNK, p38, Erk6 y Erk1/2 son capaces de interactuar in vivo. Asimismo vimos que p38 induce la activación transcripcional del GR, incrementa sulocalización nuclear y su unión a sus secuencias blanco presentes en el ADN. Deacuerdo con nuestros resultados, existen mecanismos moleculares que involucran laparticipación de MAPKs inducidas por TNF-ᵅ, por los cuales la citoquina puede regularla actividad del GR y la sensibilidad a su acción protectora de la apoptosis en el modelode apoptosis inducida por TNF-ᵅ.

Descripción: Fil: Pignataro, Omar Pedro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Los trabajos realizados en la presente Tesis tuvieron como principal objetivo el estudio de la acción de ciertos agentes sobre la diferenciación de células monocíticas humanas, así como los mecanismos relacionados a esta. Para tal fin, hemos utilizado la línea celular U-937 proveniente de un linfoma histiocítico difuso, con características promonocíticas, capaz de diferenciarse in vitro por diversos agentes. En un principio, analizamos el efecto del hexametilenbisacetamida (HMBA), sobre varios parámetros relacionados a la diferenciación de dichas células, demostrando su capacidad de diferenciarlas. Nuestro próximo objetivo fue el estudio de las ADN topoisomerasas durante el proceso de diferenciación. Detectamos una disminución temprana de la actividad de ADN topoisomerasa I posiblemente debida a un cambio en la fosforilación de la enzima. Además, demostramos que la camptotecina, un inhibidor de la topoisomerasa I, también indujo la diferenciación de la línea celular en estudio. Por otro lado, estudiamos el efecto de la histamina en la expresión de los proto-oncogenes c-myc y c-fos, así como en la proliferación y diferenciación de las células U-937. Describimos y caracterizamos los receptores a histamina tipo H1 y tipo H2 y los segundos mensajeros asociados a estos receptores. Los resultados nos indican que la histamina no es capaz de inducir la diferenciación celular U-937, posiblemente debido a la rápida desensibilización de sus receptores.

Descripción: El síndrome del ovario poliquístico (SOP) es un desorden endocrino que afecta a mujeres en edad reproductiva, constituyendo una de las primeras causas de infertilidad por anovulación. Asimismo, los andrógenos promueven la acumulación abdominal de la adiposidad que se relaciona a insulino-resistencia e inflamación crónica sistémica. Tanto a nivel ovárico como sistémico existen evidencias de que el sistema inmune contribuiría a la patogénesis del SOP. Por ello en este trabajo se estudiaron alteraciones inmunes, metabólicas y endocrinas en un modelo murino de SOP por androgenización con dehidroepiandrosterona (DHEA). A nivel sistémico, se observó mayor peso corporal, insulino-resistencia y parámetros de inflamación crónica incrementados Los quistes ováricos mostraron una expresión alterada de moléculas de adhesión que coincidió con infiltración leucocitaria, daño tisular, incremento en el estrés oxidativo y disminución de la prostaglandina E2 ovárica. In vitro, DHEA incrementó la expresión de moléculas de adhesión y marcadores de activación en leucocitos pero falló en estimular su proliferación y secreción de citoquinas. Estos resultados muestran que el sistema inmune colabora en los desórdenes ováricos y sistémicos inducidos en este modelo de SOP. DHEA promueve la activación leucocitaria in vitro pero no puede inducir por si misma una respuesta inflamatoria completa, resaltando la importancia del ambiente endócrino y metabólico en las alteraciones inmunes asociadas a SOP in vivo.

Descripción: 1- Se describió el primer mutante de insectos que falla en la exportación demateriales desde la epidermis hacia el exoesqueleto cuticular. 2- Se logró medir por primera vez la actividad de una nueva enzima, la N-β-alanildopamina sintetasa, y se avanzó en su caracterización bioquímica. Esta es la enzima responsable de la síntesis del precursor principal de laesclerotización de la cutícula marrón de los insectos. Se propone quehabría jugado un rol decisivo en la evolución de los artrópodos. 3- Se demostró que, contrariamente a lo que se acepta entre losinvestigadores del área, la dramática deshidratación que sufre la cutículadurante el proceso de esclerotización no se debe a la incorporación decatecolaminas. Se propone un modelo alternativo que explica el fenómenode la pérdida de agua cuticular. 4- Se identificó el defecto metabólico de dos mutantes de cutículamelanizada de Ceratitis capitata, encontrándose que uno de ellos esdefectivo en el aminoácido β-alanina y que el otro es defectivo para la N-β-alanildopamina sintetasa. 5- Se contribuyó a la descripción de las primeras etapas de la metamorfosisde Ceratitis capitata.

Descripción: A lo largo de esta tesis se investigaron algunos de los mecanismos moleculares que modulan la actividad del receptor de glucocorticoides (GR), un factor de transcripción regulado por ligando. En primer lugar, utilizando cuatro esteroides con diferentes actividades se estudió cómo la estructura del ligando afecta la actividad transcripcional del GR. Además, mediante la técnica de Número y Brillo se demostró por primera vez, en forma directa, que el receptor es capaz de homodimerizar in vivo. Los resultados sugieren que este proceso sería independiente de la unión al ADN y a coactivadores como TIF2. En segundo lugar, se investigaron los mecanismos responsables de la inducción dependiente de glucocorticoides del gen pro‐apoptótico Bax, en células derivadas de timoma de ratón S49. Los resultados indican que el aumento transcripcional de bax no es causado por la estabilización de su ARNm, y que las primeras 6.5 kb del promotor del gen no estarían involucradas en el efecto inductor mediado por el GR. A través del uso de un glucocorticoide disociado, sugerimos que el GR induce la expresión de Bax mediante un mecanismo de transactivación. Más aún, no se descarta la posibilidad que el efecto del GR sea indirecto, es decir, induciendo la expresión de otro gen, necesario para aumentar los niveles totales de Bax. Por último, se investigaron los mecanismos involucrados en el efecto antagónico entre la melatonina (MEL) y los glucocorticoides. Nuestros hallazgos muestran que MEL no inhibe al GR en forma generalizada, sino que sólo lo hace en ciertos tipos celulares, y mediante mecanismos diferentes. Mientras que en timocitos de ratón MEL inhibe la disociación del complejo GR‐Hsp90, en células BHK inhibe la interacción del GR con el coactivador TIF2. Finalmente, presentamos evidencias que sugieren que el inhibidor farmacológico de los receptores de melatonina, el Luzindole, sería también un antagonista del receptor de glucocorticoides.

Descripción: La célula de Sertoli (CS), componente somático del tubo seminífero, provee elsoporte estructural y nutricional para el desarrollo de las células germinales. La CSmetaboliza glucosa a lactato, principal sustrato energético para las células germinales, por loque se ha postulado que utiliza ácidos grasos (AG) como fuente energética propia. Losfactores de transcripción de la familia de los PPARs son receptores activados por ligandoque participan en la regulación del metabolismo de AG en diversos tejidos. El objetivogeneral del presente trabajo de tesis fue estudiar los mecanismos moleculares queintervienen en la regulación del metabolismo energético en el túbulo seminífero. Para ello seutilizó como modelo experimental el cultivo de CS de rata de 20 días de edad. Se observóque la activación farmacológica de PPAR α y PPAR β/δ produce un aumento en la oxidaciónde AG y en la expresión de genes vinculados con su transporte y metabolismo (FAT/CD36, CPT1, LCAD y MCAD). Además, se observó que sólo la activación de PPAR β/δ regula demanera simultánea la oxidación de AG y la producción de lactato. Asimismo, se evaluaronposibles mecanismos fisiológicos que podrían conducir a la activación de los PPARs en eltúbulo seminífero. Se observó que las células germinales apoptóticas (CGA) y el ácidopalmítico, AG que podría provenir de la hidrólisis de las gotas de lípidos –generadas por lafagocitosis de CGA– o del exterior de la célula, regulan la expresión de genes vinculadoscon el transporte y metabolismo de AG y por otra parte, que en dicha regulación participa laactivación del PPAR β/δ. Por último, se evaluó la posible regulación hormonal de laoxidación de AG en CS y la participación del PPAR β/δ en dicha regulación. Se demostróque existe una modulación diferencial del metabolismo de AG por FSH y bFGF en CS. Seobservó que FSH –hormona anabólica de la CS– disminuye la oxidación de AG y aumentala expresión génica sin participación de PPAR β/δ, mientras que bFGF regula positivamenteel catabolismo de AG y la producción de lactato de manera PPAR β/δ dependiente. En suconjunto, estos resultados revelan la existencia de una compleja regulación de losmecanismos moleculares que participan en la oxidación de ácidos grasos y la producción delactato en CS que refleja el ajuste fino del metabolismo energético en el túbulo seminíferonecesario para una adecuada espermatogénesis.

Descripción: Las integrinas son receptores heterodiméricos de la superficie celular que juegan un papelcrítico en el desarrollo normal y tumoral de los tejidos. Nuestros resultados muestran que el ARNm que codifica para la subunidad β1 de integrina (Itgb1) posee una señal (PAS1) y sitio decorte y poliadenilación alternativa que produce una isoforma del ARNm, 578 pares de bases máscorta (Itgb1-C) que la isoforma reportada en las bases de datos. Esta isoforma no presenta en su 3’UTR, a diferencia de la isoforma larga (Itgb1-L) antes reportada, ni motivos ricos en AU nisecuencias blanco para miRNA que podrían estar implicados en la regulación de la estabilidad,localización y/o traducibilidad del ARNm. Hemos encontrado, además, que estas dos isoformas de Itgb1 se expresan de manera diferencial en los distintos tejidos de ratón analizados. Determinamos que la secuencia 3’UTR de la isoforma larga (Itgb1-L) es capaz de ser reconocidapor proteínas de unión a secuencias ricas en AU (AUBP) que pueden modular su estabilidad. Encontramos también que las isoformas Itgb1-C e Itgb1-L se expresan de manera diferencial a lolargo de los distintos estadios del desarrollo de la glándula mamaria de ratón, la isoforma larga se encuentra estable durante la lactancia y en la diferenciación in vitro de células HC11. Por otro lado, la involución post-lactancia y el estiramiento de células HC11 disminuyó la expresión de esta isoforma y aumento la expresión de la isoforma corta. Por lo tanto, nuestros datos identifican una nueva instancia de regulación para el control de la expresión de Itgb1 durante del desarrollo de la glándula mamaria.

Descripción: La interleuquina-1β (IL-1β) es una citoquina proinflamatoria central en procesos fisiopatológicos, sintetizada como un precursor (proIL-1β) que debe ser procesado proteolíticamente para la generación de su forma activa. En esta Tesis determinamos que los neutrófilos humanos altamente purificados liberan IL-1β en respuesta a estímulos infecciosos como el lipopolisacárido (LPS) y estériles, como los cristales de urato monosódico (MSU), así como también frente al primado con LPS y posterior estimulación con ATP. Los efectos de inhibidores específicos y la capacidad de los agonistas de inducir la activación de la caspasa-1 sugirieron que la secreción de IL-1β es dependiente de caspasa-1 y de las serinproteasas elastasa y/o proteinasa 3. Nuestros hallazgos realizados con neutrófilos de pacientes incapaces de activar a la enzima generadora de intermediarios reactivos del oxígeno (IRO) NADPH oxidasa, con una línea celular neutrofílica carente de actividad de esta enzima, y con un inhibidor específico de la misma, sugirieron que el evento de secreción de IL-1β madura de la célula requiere de la actividad de la NADPH oxidasa. Sin embargo, el procesamiento de la proIL-1β es regulado negativamente por los IRO, los cuales ejercen un efecto inhibitorio sobre la caspasa-1. Esta compleja regulación de la secreción de IL-1β que depende del estado rédox celular podría constituir un mecanismo fisiológico de control de procesos inflamatorios dependientes de IL-1β donde el neutrófilo cumple un papel destacado.

Descripción: La hormona liberadora de corticotrofina (CRH) juega un rol clave en la coordinación de la respuesta neuroendocrina, autonómica, inmune y comportamental frente al estrés. Se ha visto que el receptor de CRH de tipo 1 (CRHR1) estimulado por CRH activa ERK1/2 en función del contexto celular. En trabajos previos realizados en nuestro laboratorio, demostramos que CRH activa ERK1/2 en zonas límbicas del cerebro de ratón (hipocampo y amígdala basolateral). ERK1/2 es un mediador esencial de los procesos fisiológicos del hipocampo, incluyendo el comportamiento emocional, la plasticidad sináptica, el aprendizaje y la memoria. Para dilucidar los mecanismos moleculares mediante los cuales CRH activa ERK1/2 en neuronas del hipocampo, utilizamos una línea celular ampliamente empleada como modelo neuronal hipocampal, las HT22. En este trabajo demostramos por primera vez que la activación de ERK1/2 en respuesta a CRH es de tipo bifásica, con una primera fase mediada por cAMP y B-Raf, y una segunda fase que depende fundamentalmente de la proteína β-arrestina2 y de la internalización de CRHR1. Teniendo en cuenta el hecho de que las interacciones biomoleculares juegan un papel crucial en la mayoría de los procesos celulares, decidimos analizar el interactoma de B-Raf mediante estudios de espectrometría de masa. En una primera etapa describimos el interactoma de B-Raf en células en estado basal. Habiendo encontrado interactores de esta MAPKKK que podrían ser componentes clave en la regulación de la señalización vía B-Raf- MEK1/2-ERK1/2, nos propusimos, en una segunda etapa, estudiar complejos proteicos asociados a B-Raf después de la activación de CRHR1 a tiempos cortos, donde B-Raf juega un rol clave. Usando herramientas farmacológicas y moleculares, evaluamos el impacto funcional de algunas de las proteínas identificadas en asociación a B-Raf en dichos tiempos cortos. Nuestros resultados indican que las proteínas 14-3-3, PKA, y Rap1, son esenciales para la etapa temprana de activación de ERK1/2 inducida por CRH, mientras que dinamina y vimentina son necesarias para la fase dependiente de la internalización de CRHR1. Demostramos que ambas fases de pERK1/2 dependen de la entrada de calcio y se ven afectadas por la inhibición de la CaMKII. Por lo tanto, este trabajo describe la dinámica y la naturaleza bifásica de la activación de ERK1/2 río abajo CRHR1 en un contexto neuronal e identifica nuevos componentes críticos de la maquinaria de señalización de CRHR1 que controlan selectivamente, o bien la fase temprana, o bien la fase tardía de la activación de ERK1/2, proporcionando así nuevos posibles blancos terapéuticos para trastornos relacionados con el estrés.

Descripción: En este trabajo de Tesis se demostró, por primera vez, que la síntesis retiniana de prostaglandinas E2 y F2α en el hámster dorado varía circadianamente aún en condiciones de oscuridad constante y está regulada por un reloj circadiano local, independiente de los núcleos supraquiasmáticos (NSQ), posiblemente localizado en la capa de células ganglionares. Asimismo, se demostró la existencia de variaciones diarias en los niveles nucleares (pero no citosólicos) de las proteínas reloj CLOCK y BMAL1 que persisten en condiciones constantes de iluminación ambiental, son independientes, al menos en parte, de la actividad del reloj hipotalámico y se expresan exclusivamente en las células ganglionares. Este conjunto de resultados indican un rol central para las células ganglionares de la retina en la actividad circadiana local. Dadas estas evidencias, se evaluaron las funciones no visuales en un modelo experimental de glaucoma. Para ello se desarrolló un modelo experimental de glaucoma a través de la administración semanal de condroitín sulfato (CS) en la cámara anterior del ojo de rata, que reproduce características centrales del glaucoma humano. Se demostró una disminución significativa en los niveles de melanopsina y en el número de células ganglionares que expresan este fotopigmento. Asimismo, se demostró una alteración significativa en el reflejo pupilar aferente, en la supresión fótica de la producción nocturna de melatonina pineal, en la inducción por luz de c-Fos en los NSQ y en los ritmos de actividad locomotora, luego de 10 semanas de tratamiento con CS. Estos resultados indican que el glaucoma induce alteraciones significativas en el sistema visual no formador de imágenes. En este contexto, se evaluó la fisiología circadiana en pacientes con glaucoma avanzado. Los resultados obtenidos demostraron que la eficiencia del sueño fue significativamente mayor en el grupo de pacientes control, en tanto que la cantidad de minutos de vigilia y la actividad durante el intervalo de sueño fueron mayores en el grupo de pacientes con glaucoma. Estos resultados, sugieren alteraciones circadianas, particularmente en la calidad de sueño, en pacientes con glaucoma avanzado.

Descripción: El Hipocampo es una región del cerebro fundamental para la adquisición, almacenamiento y evocación de memorias episódicas. Un componente esencial de estas memorias es el contexto en el que se adquieren. En el Hipocampo existen neuronas que se activan preferentemente en un sitio determinado del espacio (place cells - PC). En conjunto estas neuronas forman un “mapa” que puede representar una situación o un contexto. Si un animal es expuesto a un contexto diferente, estas neuronas pueden modificar su actividad y conformar un nuevo mapa del nuevo contexto, proceso conocido como remapeo. Además, las PC pueden codificar otros aspectos de una experiencia, como por ejemplo la identidad de un objeto, la valencia de una recompensa o el tiempo, entre otros, sugiriendo que también guardan información no puramente espacial. Diversos estudios han mostrado cómo las PC cambian su actividad ante cambios contextuales. Sin embargo, aún no está claro cómo la actividad de estas neuronas y su codificación del contexto se relaciona con la expresión de diferentes memorias episódicas. Esta tesis busca comprender la relación que existe entre la codificación contextual del Hipocampo y la evocación de memorias episódicas contextuales con distinto grado de superposición. Para ello, realizamos registros electrofisiológicos en CA1 y CA3 (dos regiones hipocampales) en ratas mientras ejecutaban una tarea de reconocimiento espontáneo de objeto en contexto. Esta tarea permite discriminar si los animales reconocen un contexto como familiar o novedoso, al mismo tiempo que se registra su actividad neuronal. Encontramos que los procesos de diferenciación y generalización de la memoria compiten por el control del comportamiento. Dependiendo del grado de superposición entre eventos, uno de los dos procesos tiene lugar. Demostramos que el grado de remapeo de las neuronas CA3 y de CA1, subyacente a un proceso de separación, está relacionado con la formación/evocación de memorias episódicas de un objeto en contexto. Cuando los animales reconocen un objeto en contexto como familiar, independientemente de las claves contextuales presentes, hay menos remapeo en las neuronas de CA3 y de CA1 que cuando la relación objeto-contexto es considerada novedosa. Por otro lado, aportamos evidencia de que la actividad de CA1 durante la ejecución de la tarea también está influenciada por factores como la presencia de un objeto o el número de experiencias en un ambiente dado. Nuevamente estos resultados muestran que la codificación del espacio de las PC no responde únicamente a características físicas del 5 ambiente, apoyando la idea de que estas neuronas cumplen un rol clave en las memorias episódicas. En conjunto los resultados expuestos en esta tesis contribuyen a comprender la naturaleza adaptativa de la memoria para guiar el comportamiento ante cambios en las representaciones internas del contexto que tienen los individuos.

Descripción: Un punto de vista predominante en la ciencia moderna de la memoria es que los recuerdos son inicialmente frágiles, pero se vuelven más estables con el tiempo. A pesar de que la persistencia es una característica fundamental en el almacenamiento de la memoria, su mecanismo se encuentra escasamente caracterizado. Para comprender los procesos que subyacen a la memoria de largo término (MLT) debemos entender cómo es que las trazas de memoria persisten a lo largo del tiempo, a pesar de la vida media corta y de la alta velocidad de recambio de sus sustratos moleculares. En este trabajo, mostramos que la MLT de evitación inhibitoria duradera pero no la que dura más allá de 2-3 días, depende de la expresión tardía de c-Fos en el hipocampo y en la corteza retrosplenial. Por otra parte, la inhibición de la transcripción en el hipocampo 24 h luego del entrenamiento afecta la persistencia, pero no la formación de la MLT. No obstante, la inhibición de la transcripción en la corteza retrosplenial impide la formación de la memoria. Además, mostramos que los requerimientos de traducción en la corteza retrosplenial alrededor del entrenamiento, en la formación de la memoria, y tardíamente luego del entrenamiento, en la persistencia de la memoria, son similares a los vistos en el hipocampo. Estos hallazgos indican que una fase de transcripción y traducción tardía son esencial para el mantenimiento de una traza de memoria inducida por miedo. Nuestros resultados apoyan la hipótesis de la existencia de rondas recurrentes de eventos como la consolidación, que ocurren luego del aprendizaje en el hipocampo y corteza retrosplenial para mantener las memorias.

Descripción: Fil: Juvenal, Guillermo Juan. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Los neutrófilos son leucocitos que cumplen un papel clave en la defensa antimicrobiana. Éstos constituyen las células más numerosas de la sangre periférica, con una producción que se incrementa dramáticamente durante la inflamación o infección sistémica. Tradicionalmente se les ha adjudicado un papel microbicida en la respuesta inmune, pero estudios recientes demostraron que pueden modular el curso de las mismas a través de la secreción de citoquinas, entre las cuales se encuentra la Interleuquina‐1β (IL‐1β). Ésta es una citoquina proinflamatoria central en procesos fisiopatológicos que ejerce efectos pleiotrópicos tanto sobre el sistema inmune innato como el adaptativo. La IL‐1β es sintetizada como un precursor inactivo que requiere clivaje proteolítico para ser activado. En respuesta a la estimulación con LPS y ATP, los neutrófilos humanos sintetizan pro‐IL‐1β y median la generación de su forma activa a través de la caspasa‐1 tras la activación del inflamasoma. La IL‐1β carece de péptido señal, por lo que es sintetizada en el citoplasma y secretada por vías no convencionales de naturaleza controvertida, que son independientes de la vía canónica que involucra al retículo endoplásmico‐aparato de Golgi. En este trabajo de tesis aportamos evidencias que sustentan que un mecanismo de autofagia secretoria se encuentra involucrado en la exportación de IL‐1β en neutrófilos humanos, a través de estudios cinéticos cuantitativos que involucraron inmunomarcaciones, técnicas de microscopía confocal y cuantificación de las imágenes, así como ensayos de ELISA específicos y Western Blot. Estos estudios también indicaron que aun cuando los neutrófilos humanos liberan pro‐IL‐1β, su secreción no está mediada por autofagia. Además, los resultados evidenciaron que las serinproteasas neutrofílicas regulan la secreción de la IL‐1β. Nuestros hallazgos indicaron que la IL‐1β es secretada mayoritariamente en forma soluble, y sólo en una mínima proporción dentro de microvesículas y exosomas. Los resultados son compatibles con un modelo que involucra la participación de la chaperona HSP‐90 y de la Gasdermina D en la translocación de la IL‐1β a las vesículas. Nuestros hallazgos también sugirieron que la autofagia controla el destino de los inflamasomas. Teniendo en cuenta las diversas condiciones de naturaleza infecciosa e inflamatoria en las que los neutrófilos infiltran masivamente los tejidos, los resultados de esta tesis aportan blancos moleculares potenciales, que podrían ser sujeto de investigaciones en el futuro para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas para mitigar la inflamación en patologías en las cuales la IL‐1β neutrofílica cumpla un papel relevante en su patogénesis.

Descripción: En la presente tesis se estudió la relación entre el volumen celular y los flujos transmembranales de K+ en hepatocitos de goldfish (Carassius auratus) expuestos a condiciones anisosmóticas o a limitación energética. La respuesta de volumen fue luego comparada con aquella presentada por hepatocitos de trucha (Oncorhynchus mykiss) y de rata (Rattus rattus). El volumen celular fue estudiado utilizando video microscopía y microscopía de epifluorescencia, mientras que la medición de los flujos de K+ se estimó a partir de los flujos unidireccionales de 86Rb+. En hepatocitos de trucha y rata, la exposición a medio hiposmótico (180 mosM) a pH 7.45 produjo el aumento de volumen celular seguido por disminución regulatoria de volumen (RVD), respuesta que es mediada por el eflujo neto de KCl seguido de agua. Por el contrario, los hepatocitos de goldfish aumentaron su volumen pero no presentaron RVD en esas condiciones. En hepatocitos de goldfish, si bien la N-etilmaleimida pudo activar la salida de K+, esto no ocurriió cuando las celulas fueron expuestas a medio hiposmótico (120-180 mosM). Se desarrolló un modelo matemático con el fin de analizar las interacciones existentes entre el volumen celular, el potencial de membrana, y la masa de los principales solutos difusibles bajo condiciones anisosmóticas. Este modelo pudo ser utilizado para simular las respuestas volumétricas de los hepatocitos de las tres especies. Los resultados del modelo apoyan la idea de que la ausencia de RVD observada en hepatocitos de goldfish se debe a la ausencia de un elemento sensor de volumen. La comparación entre los resultados obtenidos con el modelo matemático y los resultados experimentales sugiere que los hepatocitos de goldfish poseen una capacidad restringida para desarrollar RVD. El bloqueo de metabolismo energético puede generar gradientes osmoticos por aumento de la osmolaridad intracelular. En el presente estudio, la inhibición de la glucólisis por ácido iodoacético (IAA)no alteró el volumen celular en hepatocitos de goldfish, mientras que en presencia de cianuro (CN), inhibidor de la fosforilación oxidativa, o de CN y IAA (IAA+CN), el volumen celular disminuyó un 3—7%.A pesar de que en los hepatocitos de goldfish la limitación energética no tuvo efecto sobre el eflujo de K+, el influjo disminuyó un 57-66% en presencia de CN y CN+IAA pero no se vio alterada por el IAA sólo. La pérdida de K+ intracelular luego de 20 min de exposición a CN o IAA+CN fue solo de un 4% del K+ intracelular total. En general, los resultados de este estudio sugieren que los hepatocitos de goldfish, a diferencia de las células de especies sensibles a la anoxia, evitan el desacople de los flujos transmembranales de K+ en respuesta a un gradiente osmótico o limitación energética. Esto podría explicar por un lado la incapacidad de estas células para presentar RVD, pero al mismo tiempo la extraordinaria capacidad para mantener las concentraciones intracelulares de K+, prolongando de esta manera la viabilidad celular.

Descripción: Los seres vivos utilizan información para tomar decisiones. En particular, las células operan sobre información acerca de las condiciones externas e internas, más la información almacenada en sus genomas, para tomar decisiones que determinan sus acciones futuras. La centralidad de la información, y de cómo se usa para tomar decisiones, define una diferencia clave entre los seres vivos y otros sistemas no biológicos complejos. Para transmitir esta información las células evolucionaron sistemas complejos, mayoritariamente basados en especies proteicas. Estos sistemas son ubicuos, operan tanto en bacterias, como en eucariotas, en procesos tan diversos como la quimiotaxis bacteriana, el sensado y metabolismo de azúcares, la respuesta a gradientes de morfógenos, la maduración del sistema inmune, y la transmisión de impulsos nerviosos. La desregulación de sistemas de transmisión de información esta en la base de muchas patologías, como la autoinmunidad y el cáncer. Por esto, la compresión del modo en que estos sistemas operan es fundamental tanto desde el punto de vista básico (comprender la transmisión de la información en sistemas vivos) cómo aplicado (por ejemplo para el diseño de agentes y métodos terapéuticos más efectivos). En esta tesis nos centramos en la relación entre los sistemas de detección y de transducción, con el foco en mecanismos que controlan los límites de detección (el rango dinámico, rango de estímulos para los cuales se pude responder de manera dosis-dependiente). Las redes intracelulares de señalización cuentan con mecanismos de detección tales como los receptores de membrana, encargados de convertir estímulos extracelulares en activación del receptor. Esto desencadena actividad en la red, que se compone de distintos pasos de transducción, y genera una respuesta. Es comúnmente aceptado que los niveles de estímulo que ocasionan ocupación máxima de los receptores no pueden ser distinguidos unos de otros. Sin embargo se ha observado que, a pesar de esta aparente saturación de los sensores, el sistema es capaz de originar respuestas distinguibles a señales supuestamente indistinguibles. En esta tesis estudiamos la importancia de la cinética de la unión entre receptores de membrana y ligandos extracelulares, sobre la base de nuestros resultados preliminares que indican que esta cinética es capaz de controlar las características de la respuesta, incluido el rango dinámico. El resultado preliminar es la existencia de un mecanismo, denominado "sensado y señalización pre-equilibrio" (pre-equilibrium sensing and signaling - PRESS), que permite discriminar niveles de señal que saturan a los receptores en equilibrio. El mecanismo se basa en el acople de un proceso de sensado lento comparado con la escala temporal de los procesos ro abajo: si la red de señalización puede responder, gracias a una transducción rápida, antes de que la detección alcance el equilibrio, podrá distinguir dosis de ligando que en equilibrio resultan indistinguibles. La consecuencia de este acople es provocar una expansión del rango dinámico del sistema. En particular, diversos pares ligando-receptor de membrana tienen cinética de unión lenta, lo que sugiere que la modulación del rango dinámico debida al mecanismo PRESS podra ser una característica general de los sistemas de señalización. El mecanismo PRESS haba sido propuesto y estudiado, con anterioridad a esta tesis, en relación la interacción ligando-receptor y con el requerimiento de que la cinética de unión fuera lenta. Uno de los capítulos de esta tesis aborda y resuelve estas dos limitaciones del mecanismo. En primer lugar, estudia sistemas de señalización que reciben estímulos que crecen lentamente. Encontramos que la dinámica en el estímulo controla el tiempo asociado al sensado, resultando en un sensado lento aun cuando la cinética ligando-receptor no sea lenta. En segundo lugar, estudiamos que otras componentes básicas de una ruta de señalización celular pueden utilizar este mecanismo que modula el rango dinámico. Encontramos que tanto ciclos de modificación covalente como redes regulatorias genéticas simples, utilizan PRESS. En todos los casos realizamos estudios teórico-computacionales a fin de encontrar condiciones que optimicen la utilización de información pre-equilibrio. En un capítulo muy relacionado al anterior, nos preguntamos si modelos más realistas, y por lo tanto más detallados, de la interacción ligando-receptor aún conservan la capacidad de usar PRESS. Para esto consideramos un modelo de receptor con dos estados, vinculados por un cambio conformacional, y evaluamos la capacidad de modulación del rango dinámico en función del espacio de parámetros. Para esto, desarrollamos una combinación de técnicas computacionales y estadísticas, que son aplicables en general y no exclusivamente en este trabajo. Los elementos ubicuos de rutas de señalización celular que mencionamos y estudiamos, se encuentran interconectados en estas rutas. Es de interés, por lo tanto, preguntarse si cambian sus propiedades, y de ser así, como lo hacen, debido a la interconexión. Con esta motivación llevamos a cabo un estudio en el que evaluamos los efectos de la interconexión de componentes bio-moleculares en la transmisión de información. Para esto, tomamos como ejemplo un modelo de cascadas de quinasas de 3 ciclos, perturbamos el sistema ro arriba para estudiar la propagación de la información directa, y también perturbamos el sistema ro abajo para estudiar la propagación reversa. Para este estudio desarrollamos herramientas analíticas, computacionales y estadísticas, para dar conclusiones en términos de probabilidad de ocurrencia en el espacio de parámetros que nos permitieron dividir el comportamiento del sistema según si propaga solo la señales directas, solo las reversas o si tiene propagación bidireccional. En esta tesis estudiamos aspectos relacionados la transmisión de información en rutas de señalización celular, buscando extraer principios generales y evaluando estos principios con teoría y simulaciones numéricas, dando un rol preponderante a la exploración del espacio de parámetros.

Descripción: En esta tesis se aborda el estudio de los parámetros que regulan las reacciones detransferencia electrónica (TE) en metaloproteínas que contienen dos tipos de sitios decobre distintos. Para ello se utilizó una variedad de métodos espectroscópicos yelectroquímicos, cuyos resultados fueron analizados en el marco de la teoría de Marcusde TE. El principal modelo de estudio es un fragmento soluble de la citocromo ba3oxidasa de Thermus thermophilus (Tt-CuA), que contiene el centro binuclear de CuA,aceptor de electrones primario de la enzima. Mediante distintas estrategias demutagénesis tales como mutaciones puntuales de primera esfera de coordinación oingeniería de bucles, se investigaron los factores que determinan las propiedadeselectrónicas del sitio nativo, y que en última instancia determinan los mecanismosregulatorios de la TE. Desde la óptica de la termodinámica estadística, se logróracionalizar las contribuciones entálpica y entrópica al potencial de reducción del sitiode CuA y se verificó la aditividad de los efectos producidos por las distintas mutacionesde primera y segunda esfera de coordinación. Diferentes estudios espectroscópicos (RR, RMN, UV-Vis, EPR) revelan que laestructura electrónica del sitio de CuA puede ser descripta mediante una superficie deenergía potencial con dos pozos que corresponden a estados fundamentalesalternativos. Más aún, la población relativa de estos estados puede ser modulada através de mutaciones de primera y segunda esfera, y en una mutante específicamediante el pH del medio. Empleando voltametría cíclica de films proteicos fue posibledeterminar los parámetros cinéticos de TE para ambos estados fundamentales demanera independiente. En particular, la mutante puntual de ligando axial M160Hconstituye el primer caso conocido en que resulta posible activar selectivamente dosestados fundamentales diferentes mediante un simple cambio de pH. Por otra parte, estudios realizados sobre sitios de cobre tipo 1 (T1) reconstruidos enel esqueleto proteico de Tt-CuA mediante ingeniería de bucles muestran clarasdiferencias en relación a los sitios T1 nativos. Grandes cambios espectroscópicos onotables desplazamientos de los potenciales redox demuestran el rol determinante dela matriz proteica sobre las propiedades estructurales y funcionales de los sitios redox. Estos sistemas novedosos presentan además la capacidad de modificar la coordinacióndel sitio activo a partir del agregado de un ligando exógeno sin perder su actividad redox,permitiendo el estudio de este tipo de fenómenos en un sistema biológico.

Descripción: La formación placentaria normal influencia el desarrollo embrionario a término. Alteraciones en factores que regulan la interacción materno-fetal temprana, tales como ladisrupción de los niveles de óxido nítrico (NO), las metaloproteasas (MMPs) y desbalances enel estado oxidativo, son causa de placentopatía y anomalías embrionarias tempranas. Con lahipótesis que la exposición materna a alcohol desde antes de la preñez (17 días previos a lapreñez) y hasta la organogénesis (día 10 de gestación (D10) genera cambios en la expresión yactividad de MMPs y de moléculas de la matriz extracelular, afecta la regulación del sistemanitridérgico, incrementa las especies reactivas del oxígeno en la interfase trofoblásticodecidualy en el embrión, y conduce a anomalías de la placentación temprana y disrupción deldesarrollo embrionario durante la organogénesis, se plantearon los siguientes objetivos, luegode la administración perigestacional de 10% de alcohol a hembras murinas: 1) determinar losefectos materno en variables biométricas y reproductivas; 2) en el embrión: a) analizar lamorfogénesis embrionaria, la calidad histológica y la adhesión celular, b) evaluar la expresiónde moléculas de la MEC y MMPs, c) evaluar la expresión y actividad de las óxido nítrico sintasas (NOS), d) analizar los cambios en el sistema oxidativo y sus consecuencias en macromoléculasembrionarias. 3) En el tejido trofoblástico-decidual (T-D): a) analizar cambios histológicos ynucleares; b) evaluar la expresión de colágenos, proteoglicanos, ácido hialurónico y MMPs; c)analizar las alteraciones en el sistema nitridérgico; d) determinar el estado oxidativo y efectoslipídicos, proteicos y nucleares. La ingesta perigestacional de alcohol induce, al D10, pérdida de los sitios de implantación,aumento de las reabsorciones, retraso del desarrollo embrionario, disminución del crecimientoy anomalías morfológicas e histológicas embrionarias por disrupción de la expresión decadherinas y de MMPs, colágenos y proteoglicanos, efectos posiblemente relacionados conalteraciones del sistema nitridérgico, aumento de estrés oxidativo y efectos nitrosativos yapoptóticos. El tejido trofoblástico y decidual de las hembras tratadas presentó cambios en lamorfología nuclear, alteraciones del lecho vascular, disminución de los colágenos fibrilares enla MEC y alteraciones en la expresión y actividad de MMP-2. El sistema nitridérgico tambiénfue afectado por la exposición a alcohol, evidenciado por alta concentración de nitritos,aumento de estrés oxidativo y lipoperoxidación. En conclusión, el daño histomorfológico embrio-placentario temprano por exposiciónperigestacional a alcohol, vinculado a alteraciones en las moléculas de la MEC, podrían serproducto, al menos en parte, de desbalances en la producción de agentes moduladores comolas especies reactivas de oxígeno y el óxido nítrico en la interfase materno-embrionariatemprana.

Descripción: Las células pueden detectar, generar y responder a un amplio rango de señalesexternas, químicas y físicas, integrar y analizar esta información y, en consecuencia,cambiar su morfología, dinámica, comportamiento y, eventualmente, destino. A nivelcelular, las respuestas biológicas a fuerzas externas se originan en dos tipos deestructuras especializadas: adhesiones focales (célula-matriz extracelular) y unionesadherentes (célula-célula). Las adhesiones focales son complejos de proteínasdispuestos en ensamblados multi-moleculares que unen la matriz extracelular, a travésde receptores integrales de membrana, a componentes del citoesqueleto. Estos sitiosde adhesión son estructuras planas, alargadas de unos pocos micrones cuadradosque a menudo están localizadas en la periferia de las células, y que ademásfuncionarían como organelas de señalización en el proceso de mecanotransduccióncelular. Uno de los retos que se presenta para estudiar el sistema es el de poderintegrar y combinar distintas técnicas que nos permitan analizar la dinámicaintracelular, la biomecánica de la célula/sustrato, detección de las fuerzas generadasen/por la célula, y observar la respuesta global de la célula en las distintascondiciones. Entonces, el estudio de la estructura, mecánica y dinámica de lasproteínas de adhesiones focales en respuesta a un estímulo mecánico en células vivasrequiere de técnicas que permitan visualizar y caracterizar en forma integrada ladinámica de eventos localizados en la célula. Estos métodos deben contar con unaresolución espacio-temporal alta, de forma tal que permitan detectar eventostransientes y altamente localizados. En este contexto, se han implementado, en estetrabajo de Tesis, distintas microscopías y espectroscopías de alta resolución espacialy temporal, en combinación con técnicas de biología molecular y celular. Con el objetivo de caracterizar las propiedades mecánicas de sustratos y células, enuna primera etapa se implementó un modo de operación avanzado en microscopía defuerza atómica (AFM), denominado PF-QNM (del inglés, Peak Force Quantitative Nanomechanical Property Mapping). Este modo permite obtener simultáneamente laimagen de topografía, junto con los mapas cuantitativos sobre las propiedades deelasticidad, adhesión, dureza, disipación de energía y deformación superficial. Seutilizaron sistemas modelo con distintas propiedades mecánicas de manera tal decubrir el amplio rango que va desde GPa a kPa, y estudiar las propiedades desustratos (vidrio, membranas de silicona y geles de poliacrilamina), así también comola línea celular utilizada en la Tesis. A nivel de adhesión focal, la estrategia fue transfectar células de epitelio mamario deratón (HC11), con proteínas componentes de la adhesión (por ejemplo, zixina, FAK,vinculina, paxilina) fusionadas a proteínas fluorescentes visibles. De esta forma,empleando microscopías y espectroscopías de fluorescencia, es posible visualizar laexpresión de las proteínas, registrar su localización y evolución en el tiempo y,mediante diferentes análisis, extraer información cuantitativa de dinámica, cinética yorganización de los complejos de adhesión focal. El análisis de la dinámica y difusiónde los complejos de adhesión focal y sus interacciones, fueron realizados mediante laespectroscopía por correlación de fluorescencia (FCS). Se caracterizaron loscoeficientes efectivos de difusión de las proteínas mencionadas. El análisis de lacorrelación cruzada de las fluctuaciones de fluorescencia de pares de proteínas deadhesión focal (FCCS) permitió evidenciar la interacción entre distintas proteínasadhesivas de la adhesión focal. La cinética de disociación de proteínas desde laadhesión focal fue evaluada mediante la recuperación de la fluorescencia luego delfotoblanqueo (FRAP) en diferentes condiciones. Para estudiar los cambios generados en la organización y dinámica de adhesionesfocales en células vivas en respuesta a un estímulo mecánico externo global, seempleó un dispositivo de tracción equibiaxial adaptado para ser usado en simultáneocon el microscopio confocal FV1000. La tensión mecánica aplicada por el dispositivode tracción es capaz de inducir cambios en el área de las células vivas al igual que enlas adhesiones focales. En respuesta al estiramiento mecánico se observó un mayorreclutamiento y translocación de la proteína zixina acompañado de una disminuciónsignificativa de su constante de disociación. Con el fin de correlacionar las propiedades mecánicas del sustrato y la fuerza detracción generada por la célula a nivel de las adhesiones focales, sin perder de vista laorganización y dinámica de las proteínas en la adhesión focal, se implementó la Microscopía de Fuerzas de Tracción (TFM). Esta técnica posee la sensibilidadnecesaria para medir la fuerza de tracción generada por la célula sobre un sustratoelástico y transparente, la cual se puede combinar con otras técnicas de microscopíade fluorescencia como FRAP o FCS. El análisis de los datos TFM para la proteínazixina permitió obtener los mapas de deformación y de fuerzas de tracción, a la vezque se evaluó la cinética de disociación mediante FRAP.

Descripción: En esta tesis se estudiaron fluidos simples sometidos a confinamiento por paredes rígidas de diversas formas. Primariamente se realizaron cálculos analíticos de mecánica estadística y simulación computacional. El confinamiento limita la región del espacio disponible para las partículas que forman el fluido, induciendo la inhomogeneidad del sistema. Para describir el fluido se utilizaron potenciales de interacción simples acorde con una mirada de grano grueso. Esta falta de detalle apunta a centrar la atención, no en las propiedades específicas del fluido, sino en el efecto del confinamiento. Las distintas formas de confinamiento incluyeron paredes planas y cavidades con curvatura. Pusimos especial interés en cavidades muy pequeñas, con dimensiones del orden del radio de las partículas. Este tipo de confinamiento conduce a un marcado aumento de los efectos de borde respecto de los de volumen. Caracterizamos unos pocos coloides confinados en un nanoporo esférico describiendo sus fases. Estudiamos gases a baja densidad en confinamiento esférico y cilíndrico y presentamos la interfase fluido-pared utilizando integrales de cluster. Asimismo, analizamos el confinamiento por pared plana de un líquido modelo evaluando su adsorsión y tensión superficial, alcanzando altísimos niveles de precisión. Por último, estudiamos el flujo de un líquido simple en un nanocanal cilíndrico, mediante sus distribuciones no triviales de densidad, velocidad y temperatura. Por el lado de la teoría se destaca primariamente el desarrollo de modelos que describen el comportamiento termodinámico de superficie en función de parámetros como la curvatura o la temperatura. Para producir resultados analíticos con la mayor generalidad posible, trabajamos con potenciales de interacción simples como hard spheres (HS), square well (SW) y Lennard-Jones (LJ). Los sistemas tratados son también de geometría sencilla como la pared plana, esférica y cilíndrica. En todos los casos el confinamiento está dado por paredes rígidas, es decir puramente repulsivas y de contacto. Hemos utilizado resultados previos del grupo sobre la función de partición de pocas partículas SW en un poro esférico, para describir su comportamiento termodinámico en todo el espacio de parámetros. Mediante la expansión del virial pudimos deducir expresiones analíticas de magnitudes termodinámicas de superficie como la tensión superficial para gases confinados. Por otro lado, también exploramos cómo abordar sistemas fuera de equilibrio con una inhomogeneidad marcada en densidad y temperatura. Para la ejecución de las simulaciones se utilizó el algoritmo regido por eventos (event driven), especialmente efectivo para trabajar con potenciales constantes a trozos, como el SW. Los eventos que dictan la dinámica del sistema son las colisiones: de los núcleos de partículas, de los campos de las partículas y de núcleos de partículas con la pared rígida. Para las simulaciones, aprovechando las dimensiones reducidas del sistema, se utilizó un termostato de pared térmica, que es un modelo realista de cómo intercambia calor un sistema con el medio confinante. Durante la ejecución de las simulaciones se midieron una serie de magnitudes en forma de perfiles según la simetría de la cavidad. Las magnitudes se emplearon en trabajos de caracterización en función de parámetros relevantes. También, se utilizaron para contrastar con resultados teóricos o para brindar los datos necesarios para efectuar ajustes con modelos aproximados.

Descripción: El citoesqueleto es una red auto-organizada y dinámica presente en las célulaseucariotas. Está compuesto por tres tipos de biopolímeros: filamentos de actina,filamentos intermedios y microtúbulos. Estos filamentos se constituyen a partir dela polimerización de proteínas más simples y forman estructuras con diámetros de ~6nm para los filamentos de actina y ~10nm para los filamentos intermedios. Losmicrotúbulos son los elementos más rígidos del citoesqueleto, con una estructuratubular de diámetro externo de ~25nm. Estos biopolímeros, en conjunto con proteínas motoras, componen un entramado con propiedades mecánicas que permite alas células generar y reaccionar ante la acción de fuerzas. El citoesqueleto está involucrado en numerosos procesos celulares tales como lamigración, división, contracción y el transporte de organelas. Por este motivo es muy importante estudiar el comportamiento mecánico de los filamentos del citoesqueleto para lograr un mayor conocimiento de la organización y mecánica celular. La microscopía de fluorescencia ha revolucionado nuestro conocimiento del citoesqueleto, permitiendo su visualización en células vivas. El análisis del movimiento y de las fluctuaciones en las formas de los filamentos del citoesqueleto permite estudiar las propiedades mecánicas relevantes a su función biológica. Este tipo de análisis requiere la identificación de las posiciones de filamentos individuales con alta precisión. Sin embargo, el seguimiento de filamentos individuales a partir de imágenes de microscopía de fluorescencia de células vivas es extremadamente complejo. Es por ello que en la primera parte de esta Tesis, desarrollamos un algoritmode tracking de filamentos que permite obtener las coordenadas de microtúbulosfluorescentes con precisión subdifracción. Evaluamos el rendimiento de esta rutinamediante simulaciones numéricas de imágenes confocales y experimentos in vitro yobtuvimos una precisión de ~9nm para filamentos in vitro y ~20nm para filamentosen células fijadas. Utilizando este algoritmo, estudiamos las distribuciones de curvaturas de microtúbulos en células melanóforas de Xenopus laevis vivas. Mediante un análisis de Fourier de las formas de los filamentos hallamos que, en un entorno fuera del equilibrio como el citoplasma, las curvaturas se ajustaban a un comportamiento térmico, de acuerdo con resultados reportados anteriormente. Estos datos fueron utilizados para calcular la longitud de persistencia de los microtúbulos en distintas condiciones experimentales. La longitud de persistencia es un parámetro ampliamente utilizado para describir las propiedades mecánicas de filamentos, y se define como la razón entre la rigidez exural del filamento y las fuerzas térmicas actuando sobre el mismo. La longitud de persistencia efectiva calculada para microtúbulos en células vivas fue ~20 nm, valor significativamente menor que el medido in vitro. Este parámetro no se vio modificado en presencia de la proteína asociada a microtúbulos XTP o la depolimerización de actina. En contraste, la depolimerización de la red de filamentos intermedios disminuyó significativamente el valor de este parámetro. Por otra parte, exploramos si la inhibición de los eventos de polimerización y depolimerización de los microtúbulos podría afectar su rigidez exural efectiva. En este caso, la distribución de formas de los filamentos no se ajustó a un comportamiento térmico, como el observado en células control, indicando que el comportamiento mecánico de los microtúbulos depende de un delicado equilibrio de fuerzas activas dentro de la célula. Observamos que la depolimerización de filamentos de actina e intermedios aumentasignificativamente las fluctuaciones laterales de los microtúbulos, sugiriendoque estos filamentos contribuyen a la organización global de dicha red. Por otra parte, verificamos que la producción de fuerzas no es homogénea dentro de las células ya que los microtúbulos presentaban un movimiento más lento, pero más direccionado en la región cortical en comparación con la región perinuclear. En la segunda parte de esta Tesis, estudiamos los aspectos dinámicos de loseventos de buckling de microtúbulos en células melanóforas de Xenopus laevis. Éstosson eventos transitorios y localizados observados frecuentemente en células, y secaracteriza por una rápida exión del filamento seguida de su relajación. Se hapropuesto que estos eventos de rápida deformación dependen de fuerzas localizadasespacio-temporalmente resultantes de la acción de motores moleculares. Para comprender este fenómeno, caracterizamos los eventos de buckling medianteel tracking de microtúbulos fluorescentes individuales en combinación con simulaciones numéricas, las cuales nos permitieron explorar distintos mecanismos que podrían producir la exión de filamentos. Los eventos simulados reprodujeron muchas de las características observadas en microtúbulos en células vivas, sugiriendo que el modelo mecánico implementado representaba los procesos esenciales del buckling de microtúbulos. Luego analizamos la interacción entre vesículas fluorescentes transportadas activamente y la red de microtúbulos pudiendo así observar eventos generados por fuerzas activas y correlacionarlos con el movimiento de las vesículas. Los resultados obtenidos de este análisis sugieren que los microtúbulos podríanafectar el transporte indirectamente, aparte de servir como vías para las organelastransportadas. Con el fin de extender nuestro análisis del citoesqueleto a otros sistemas biológicos, estudiamos células de cáncer de próstata, que muestran una expresión anormal de proteínas del citoesqueleto, resultando en una resistencia a la quimioterapia y capacidad de colonizar órganos lejanos. Desarrollamos técnicas computacionales para analizar imágenes de fluorescencia de citoesqueleto en estas células y, en particular, cuantificar la acción de una droga que induce la expresión de Hemo oxigenasa-1, una enzima implicada en la regulación de la morfología celular. Nuestros resultados mostraron que la células bajo la inducción de HO-1 presentaban menos migración y una proporción significativamente mayor de protrusiones tipo-filopodias que las células control, los que indicaría una mayor comunicación entre células vecinas. En síntesis, llevamos a cabo experimentos biológicos para observar el citoesqueletoy desarrollamos técnicas que nos permitieron estudiar estos filamentos en célulasvivas. De esta forma, pudimos analizar cuantitativamente la importancia del balancey dinámica de fuerzas activas en células para la organización de la red de microtúbulos. Estos conocimientos también fueron de utilidad para analizar los cambios en elcitoesqueleto de células de cáncer de próstata.

Descripción: flujos de fuentes puntuales en función de su declinación.

Descripción: Fil: Cardona, María Angélica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Fil: Rovero, Adrián Carlos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: El trabajo realizado consiste en: 1°) Un estudio teórico general sobre el comportamiento a radiofrecuencia de las celdas de paredes aislantes provistas de electrodos anteriores. 2°) Un estudio experimental particular sobre el significado de las lecturas de capacidad cobtenidas con un oscilador de grilla sintonizada y placa sintonizada al que se conectan dichas celdas. 1°.) Parte teórica: El comportamiento eléctrico de las celdad referidas se explica mediante su circuito equivalente, o sea un circuito no distinguible, por métodos eléctricos, de la propia celda. Las propiedades de dicho circuito pueden sintetizarse por su admitancia Y (inversa de la impedancia Z). Se ha calculado: Y = Gp + j W Cp Cp = [A.k.w^(2).Cl^(2)/(A^(2).k^(2)+w^(2).(Cl + p.A)^(2)] (1) Cp = [Cl.A^(2).k^(2)+w^(2).Cl.p.A.(Cl+p.A)/A^(2).k^(2)+w^(2).(Cl+p.A)^(2)] (2) Donde: Y= admitancia de la celda, Gp= conductancia equivalente en paralelo de la celda, Cp= capacidad equivalente en paralelo de la celda,j= operador imaginario = √-1w= 2π frecuencia A= constante que depende de la forma y dimensiones de la celda,k= conductividad de la solución contenida en la celda, Cl= capacidad entre los electrodos externos y la solución,p= 0,08845x10^(-12) faradios x constante dieléctrica de la solución. Para soluciones acuosas diluídas puede considerarse la constante dieléctrica aproximadamente constante al variar la concentración. Luego, para una celda determinada y a frecuencia constante. Gp=f(k) y Cp=F(k) La curva Gp=f(k) comienza en Gp=0; k=0 y presenta un máximo cuyas coordenadas sonk(máx)=w(Cl/A+p) Gp(máx)=wCl^(2)/2(Cl/A+p)siendo la pendiente máxima de la rama ascendente 8 veces mayor que la pendiente máxima de la rama descendente, y por lo tanto la sensibilidad obtenible 8 veces mayor en la primera que en la segunda. La máxima sensibilidad corresponde a k=0. Un aumento de la frecuencia aumenta las coordenadas del vértice conservando la sensibilidad inicial invariable. Un aumento de Cl aumenta las coordenadas del vértice y los valores de la sensibilidad inicial. Un aumento de A disminuye las coordenadas del vértice, siendo máxima la sensibilidad inicial para A=Cl/p. Un aumento de la constante dieléctrica aumenta k(máx) y disminuye Gp(máx) con disminución de la sensibilidad inicial. En general es conveniente aumentar k(máx) para obtener una zona útil de trabajo más amplia, pero sin disminuir la sensibilidad inicial. La función Cp=F(k) es monótamente creciente entre: Cp(k=0)=(p.A.Cl/p.A+Cl) y Gp(k=infinito)=Clel intervalo de variación de Cp en ΔCp=Cl^2/(Cl+p.A) La máxima sensibilidad se encuentra para un valor de k(máx.sens.)=w.(Cl/A+p)/√5 Un aumento de la frecuencia aumenta k(máx.sens.) sin variar ΔCp y disminuyendo la sensibilidad. Un aumento de Cl aumenta ΔCp y k(máx.sens.) con aumento de la sensibilidad. Un aumento de A disminuye ΔCp siendo máxima la sensibilidad para A=Cl/p. Un aumento de la constante dieléctrica provoca una disminución de ΔCp y de la sensibilidad. 2°.) Parte experimental: Tuvo la finalidad de verificar si al conectar a un oscilador de grilla sintonizada y placa sintonizada una celda de electrodos exteriores en paralelo con el tanque de placa, la variación de capacidad de placa en estado de resonancia a un estado relacionado con ella es igual a la capacidad equivalente en paralelo de la celda. Se utilizó un oscilador del tipo mencionado alimentado por una fuente de tensión regulada. Se eligió como estado de referencia relacionando con la resonancia el mínimo valor de la capacidad de placa suficiente para anular las oscilaciones, por ser este estado bien definido y reproductible. Se comprobó que conectando en lugar de la celda un condensador patrón variable puede calibrarse el condensador de placa en unidades de capacidad, siendo la disminución de capacidad de placa -ΔC igual a la capacidad conectada. Se determinaron experimentalmente valores de -ΔC en función de k con dos celdas diferentes a la frecuencia de 1 megaciclo/segundo con soluciones acuosas a 25°C de cloruro de potasio, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico e hidróxido de potasio de conductividad conocida, comprendida entre 2.10^(-6) a 4.10^(-3) ohm^(-1) cm^(-1),se midieron las constantes A y Cl de cada celda y se calcularon las funciones Cp=F(k) con la fórmula (2) para cada celda. Una comparación de los resultados permitió comprobar que -ΔC era constantemente mayor que Cp para igual valor de k, coincidiendo solamente para k=0 y para k=infinito. Con ello quedó comprobada la incorrección de la hipótesis inicial de la parte experimental. Con el objeto de investigar la razón de la diferencia observada se estudiaron varias celdas corrientes de conductividad, formadas por electrodos de platino platinado sumergidos en la solución. Para estas celdas Gp= A.k; Cp= p.A= constante. El valor de Gp= A.k se midió por métodos corrientes a baja frecuencia y se determinó -ΔCen función de Gp, obteniéndose rectas de la forma -ΔC= a Gp + constante (3)siendo a una constante empírica igual para todas las celdas. Se formuló la hipótesis de que, generalizando este comportamiento al caso de las celdas con electrodos exteriores, podría esperarse un resultado de la forma -ΔC=Cp.aGp, luego Cp=-ΔC-a.Gp (4)siendo a la constante cuyo valor se halló en la fórmula (3). Esta hipótesis fué verificada así: Se calculó Cp=f(k) para ambas celdas aplicando la fórmula (1); con estos datos y los de -ΔC en función de k obtenidos anteriormente, se aplicó la fórmula (4) calculando Cp en función de k. Los valores de Cp obtenidos con la fórmula (2) y los obtenidos con la fórmula (4) concordaban satisfactoriamente. Las discrepancias obtenidas, aproximadamente iguales a 0,05 ΔCp para ambas celdas, estaban dentro de los errores experimentales.

Descripción: Desde los estudios de Ernst Abbe, a finales del siglo XIX, se dio por aceptado que la microscopíaóptica de campo lejano tenía un límite en su poder de resolución espacial: objetosque se encontraran más cercanos entre sí que media longitud de onda de la luz utilizada nopodrían distinguirse. Sin embargo, en las últimas dos décadas se han desarrollado un númerode técnicas basadas en fluorescencia que mantienen las ventajas de la microscopía óptica decampo lejano, y proporcionan una resolución espacial limitada únicamente por el tamañodel marcador fluorescente. Estas técnicas se denominan microscopías de superresolución onanoscopías de fluorescencia e involucran la transición entre estados moleculares de los fluoróforosque permitan o no la emisión de fluorescencia. En particular, en la nanoscopía STED (Stimulated Emission Depletion), se produce esta transición mediante depleción por emisiónestimulada, con el fin de desactivar fluoróforos en regiones controladas del espacio y de estaforma reducir el volumen efectivo de observación. En el marco de esta tesis, y gracias a una colaboración formal y activa con Stefan W. Hell (Department of NanoBiophotonics, Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany), galardonado en 2014 con el premio Nobel de Química por su trabajopionero en las nanoscopías de fluorescencia, se construyó el primer nanoscopio STED de Argentina (Grupo de Nanofísica Aplicada, Centro de Investigaciones en Bionanociencias (CIBION), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Buenos Aires (BA), Argentina). El nanoscopio STED se aplicó para indagar y dilucidar problemas biofísicos con resoluciónnanométrica. En colaboraciones interdisciplinarias se estudió: (a) la organización deproteínas en la membrana del Trypanosoma cruzi, en colaboración con el Grupo de Inmunología Molecular, Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (IIB), Universidad Nacional de San Martín (UNSAM), CONICET, BA, Argentina; (b) procesos de reestructuración del citoesqueletode los conos de crecimiento durante la polarización neuronal, en colaboración conel Laboratorio de Neurobiología, Instituto de Investigación Médica de Córdoba (INIMEC), CONICET, Córdoba, Argentina; y (c) la formación y estabilidad de estructuras periódicasde actina en procesos de degeneración axonal, en colaboración con el Laboratorio de Neurobiología, INIMEC, CONICET, Córdoba, Argentina y el Grupo de Neurobiología Molecular, Instituto de Investigación en Biomedicina de Buenos Aires (IBIOBA), CONICET, BA, Argentina. Asimismo, se desarrolló un nuevo esquema de implementación de la nanoscopía STEDque expande considerablemente su campo de aplicación. Generalmente, luz de longitud deonda situada en la zona roja lejana del espectro de emisión del fluoróforo es utilizada para inducir el fenómeno de emisión estimulada. En esta tesis, se demuestra que STED continuo (CW) también es posible utilizando longitudes de onda de STED ubicadas en el máximo deemisión, donde la sección eficaz de emisión estimulada puede ser hasta 10 veces mayor. Comoresultado, es posible obtener imágenes de STED utilizando potencias proporcionalmentemenores. Además, fluoróforos que se consideraban inadecuados para ciertas configuracionesespectrales de nanoscopía STED, pueden ser utilizables.

Descripción: La espectrometría de masas con aceleradores de partículas (AMS) es unatécnica ultrasensible de medición que posibilita la identificación y medición deradioisótopos de vidas medias largas (en el rango de 10^3 a 10^8 años), con nivelesde concentración tan bajos como una parte en 10^16. Estos radioisótopos son deinterés en diferentes disciplinas puesto que pueden brindar información sobre muchosde los procesos interesantes que ocurren en la Tierra y en el sistema solar, loscuales tienen escalas temporales dentro del rango mencionado. Las vidas mediasy los niveles de concentración involucrados dificultan, y en algunos casos imposibilitan,la identificación de estos radioisótopos utilizando técnicas convencionalesde medición pero son fácilmente reconocibles con la técnica AMS. Uno de los radioisótopos que resulta muy interesante debido a su amplia utilizaciónes el 36Cl. Este isótopo es empleado en diversos campos de investigacióncomo: astrofísica, ciencias de la atmósfera, geofísica, etc, siendo de gran importanciaen los estudios de medio ambiente. En particular, es un excelente trazadorhidrológico con el cual, a partir de muestras de precipitación, se pueden estudiarprocesos de transporte atmosférico. Este trabajo tiene dos finalidades. Por un lado, la de desarrollar e implementarla técnica AMS en nuestro país, empleando el acelerador de iones pesadosexistente en el Laboratorio TANDAR, lo que implica la aceleración e inequívocaidentificación de los haces microscópicos de l4C y 36Cl por primera vez. El segundoobjetivo consiste en la aplicación de la técnica empleando al radioisótopo 36Cl como trazador atmosférico. Para ello se midió la concentración de 36Cl respectode cloro en muestras de precipitación recogidas entre 24° y 62° de latitudsur y los resultados fueron analizados basados en modelos teóricos ya existentes. Dichas mediciones fueron las primeras llevadas a cabo en este tipo de muestras,recolectadas en América del Sur y tratan de contribuir a extender la escasa cantidadde datos experimentales acerca de la deposición del 36Clpresente hasta el momento.

Descripción: Esta Tesis presenta la primera medición en un colisionador de hadrones de unavariable de forma, el thrust transverso de dos jets Tt2,una variable relacionada con ladistribución de jets en el plano transverso al de los haces colisionantes. Tt2 se calcula a partir de los dos jets más energéticos del evento, y toma valores entre Tt2 = 1, para el caso de dos jets en una misma dirección y sentidos opuestos, y Tt2 = √2/2para dos jets de igual energía formando un ángulo de 90°. La medición se realizócon datos tomados en el Tevatron, el colisionador pṗ del Laboratorio Fermilab. Lasección eficaz se presenta tanto en función de 1 — Tt2 como de log(1 — Tt2), queenfatiza la región de alta estadística cuando Tt2→1, para cuatro rangos de energíatotal del evento. Los resultados están en buen acuerdo con las predicciones de QCDperturbativo a orden O(α33), excepto a alto Tt2, donde se espera que la correccionespor resumación sean importantes, y por debajo de Tt2≈√3/2, donde la contribuciónde primer orden corresponde a diagramas O(α43). Los datos muestran asimismo unmuy buen acuerdo con un recientemente publicado generador de tres jets a ordensiguiente al dominante (NLO), que cubre todo el rango de la variable Tt2, excepto elcaso extremo cuando Tt2=1. Palabras claves: Cromodinámica Cuántica, Algoritmo k┴ , Variables de forma

Descripción: El detector ATLAS mide la distribución en la multiplicidad de partículas cargadas a partir de las colisiones protón-protón, con una eneria de 13 TeV desde el centro de momentos. Este análisis utiliza los datos seleccionados durante el año 2015 utilizando un sistema de trigger de sesgo mínimo. Este tipo de trigger requiere la presencia de al menos dos partículas cargadas estables con momento transverso por encima de 100 MeV y un valor absoluto de pseudorapidity menor a 2.5 (|η| < 2:5). Esta región del espacio de momentos es interesante de explorar debido a que no está exhaustivamente descrita por los modelos de soft-QCD. Las distribuciones del número de partículas cargadas por evento, el promedio del momento transverso, y la dependencia entre el número de partículas cargadas respecto de su momento transverso y pseudorapidity, son comparadas con diferentes modelos de Monte Carlo de QCD, para as poder limitar el número de parámetros libres de dichos modelos. En este trabajo también se realizó una búsqueda de resonancias localizadas en la distribución de masa di-jet para eventos con jets de baja masa producidos en asociación con un fotón de alta energía transversal (ISR-photon). Esta búsqueda utiliza más de 79.8fb1 (elevado a la menos uno) [fórmula aproximada, revisar la misma en el original] de datos recolectados desde el año 2015 al año 2017, con una energía de 13 TeV medida desde el centro de masa. Se presentan dos variantes, la primera donde no existe un requerimiento de sabor sobre los jets y la segunda donde estos deben provenir de un quark b (b-jets). Las distribuciones de masa observadas son consistentes con los procesos de múltiples jets del modelo estándar. De este modo los datos fueron utilizados para definir los límites superiores en la sección eficaz de producción para el modelo de Z', y además, para la contribución de funciones genéricas de forma gaussiana en la distribución de masa, extendiendo entonces las restricciones actuales de las resonancias di-jet a un rango de 225 GeV a 1100 GeV, en el experimento ATLAS.

Descripción: El trabajo presentado en esta tesis fue realizado en el marco de la colaboración ATLAS en el Large Hadron Collider. Se centró en el estudio de jets, sus propiedades,su medición en el calorímetro y la sección eficaz de su producción. Uno de los aspectossalientes de esta tesis es la medición de la sección eficaz diferencial de producción deeventos con muchos jets. Dicha medición utilizado el conjunto de datos colectado porel experimento ATLAS en colisiones protón-protón a √s = 8 TeV en el LHC. Laselección de eventos requiere que los cuatro jets de tipo anti-kt R = 0.4, de mayormomento transverso (pT) y por dentro del rango de rapidez │y│ < 2.8, se encuentrenbien separados entre sí (ΔRmin 4j > 0.65), tengan un pT > 64 GeV, e incluyan al menosun jet con pT > 100 GeV. La medición considera una gran variedad de variables,incluyendo distribuciones del momento de los jets, de masas invariantes, del mínimoy máximo ángulo de apertura entre los jets y otras variables cinemáticas. Asimismo,estas variables fueron subdivididas en función del momento del jet más energético yde la masa invariante con el objetivo de explorar por separado diferentes regímenescinemáticos. Las secciones eficaces medidas se presentan habiendo corregido por efectosdel detector y en comparación con algunos de los cálculos a primer orden en la teoríade perturbaciones más comúnmente usados en física experimental de altas energías,al igual que predicciones teóricas al siguiente orden en la constante de acoplamientofuerte. Otros aspectos de este trabajo contemplan la medición de la resolución en momentode los jets y la puesta a punto de nuevos detectores de centelleo en el calorímetro. Elprimer aspecto concierne estudios de propiedades de jets relacionados con su resoluciónen energía. Esta es una medición de gran importancia en el marco de los análisisque utilizan jets en el estado final. La resolución se ve afectada por las condicionesexperimentales al momento de la toma de datos, y puede empeorar considerablementeal incrementar la luminosidad instantánea del haz o la energía de las colisiones. Es porello que que la mejora de la resolución es una de las metas principales en el desarrollode correcciones aplicadas a la calibración de la energía de los jets, que a su vez debenser validadas apropiadamente a través de técnicas basadas en datos. Las tareas relacionadas con los detectores de centelleo fueron realizadas duranteel período sin toma de datos entre los años 2013 y 2014. Los detectores utilizadosdurante Run 1 e irradiados fueron removidos y estudiados, para luego realizar el dise~noy ensamblaje de sus sucesores.

Descripción: En esta tesis se presenta la medición de la sección eficaz de masa invariante entre paresde jets producidos en colisiones protón-protón a una energía de centro de masa de 13 TeV. Los datos fueron colectados por el detector ATLAS en el Gran Colisionador de Hadrones del Laboratorio CERN durante el año 2015. Las mediciones de la sección eficaz fueron comparados cuantitativamente con las predicciones teóricas del Modelo Estándar (ME) a orden siguiente al dominante (NLO) corregidas por efectos no pertubativos. Estos estudios ponen a prueba el ME por posible evidencia de nueva física. A su vez, la producción de jets contiene información acerca de la distribución partónica dentro del protón y de la constante de acoplamiento fuerte αs, lo que permite mejorar el conocimiento de QCD a una escala de energía nunca antes alcanzada. Los resultados experimentales mostraron estar en acuerdo con las predicciones teóricas, validando por primera vez el ME a 13 TeV en lo que respecta a la producción de pares de jets. Por otro lado, se describe la aplicación de técnicas de aprendizaje automático para la identificación de jets provenientes de quarks top o bosones W en medio de un fondo dominante de jets de QCD. Dicha tarea resulta fundamental para la búsqueda de partículas masivas producto de nueva física o para la mejora de precisión de las propiedades del Higgs. El modelo propuesto en esta tesis esta basado en redes neuronales adversarias, el cual permite lograr un clasificador no correlacionado con ciertos observables físicos de interés, como la masa del jet. Ciertas búsquedas de nueva física en ATLAS son sensibles a efectos no deseados introducidos por la correlación, inherente para un poder de clasificación optimo, entre la variable discriminante y la masa del jet, lo que resulta en la reducción de la significancia estadística del analisis. Esta técnica propone una solución a este tipo de problemas. Estudios basados en simulaciones Monte Carlo muestran mejoras significativas respecto a otras métodos analíticos y de multivariable utilizados tradicionalmente en ATLAS, resultando por lo tanto prometedor para futuras búsquedas de nueva física.

Descripción: La reacción 25Mg(p,γ) es el principal mecanismo de producción estelar del radioisótopo 26Al. Dada la vida media del 26Al(τ~ 10 6 a), este radioisótopo puede escapar de la estrella quelo origina y decaer en el medio interestelar. La detección de la radiación gamma generada eneste decaimiento permite rastrear los sitios de producción de 26 Al en la Vía Láctea y ajustarasí los modelos de nucleosíntesis. Para esto último es necesario, además, precisar la tasa deproducción de la reacción resonante 25Mg(p,γ)26 Al en el rango de energías estelares. Previo a este estudio, las intensidades de las resonancias de esta reacción se determinaronmediante la detección en línea de rayos gamma de desexcitación del núcleo compuesto 26Al. Sin embargo, a las energías estelares, muy por debajo de la barrera coulombiana, la reaccióntiene una producción en extremo baja y su medición se dificulta por causa del fondo gammaambiental y el fondo producido por reacciones en elementos contaminantes. Para eludir estos inconvenientes, en este trabajo se desarrolló un método de mediciónalternativo, basado en la alta sensibilidad de la espectrometría de masas con aceleradores (AMS). En este método, se bombardean blancos de MgO con un gran número de protones (del orden de 10 19)a las energías de resonancia. A continuación, estos blancos son tratadosquímicamente, agregando y homogeneizando una cantidad bien determinada del isótopoestable 27 Al y eliminando el Mg que lo componía originalmente. Las muestras así generadascontienen el 26Al producido en la reacción p + 25Mg y la cantidad de los mismos se determinamidiendo la concentración 26Al/27Al mediante la técnica AMS. La pequeña cantidad de 26Al presente en las muestras (del orden de 10 6 - 10 7 átomos) hizonecesario optimizar la eficiencia de detección. A estos efectos, las mediciones de concentraciónde las muestras se realizaron extrayendo es estas el ion molecular 26AlOˉ de la fuente de iones. Dado que el ion molecular es hasta 25 veces más prolífico que el ion atómico Alˉ utilizadousualmente, su empleo permitió incrementar la eficiencia de detección hasta un valor de 4 x 10ˉ5. Como contrapartida, el ion molecular 26AlOˉ sufre la interferencia del ion isobárico 26MgOˉ. Por lo tanto, la aplicación de este método requirió la supresión del 26Mg, la cualse efectuó mediante la técnica de imán con gas y una separación química muy selectiva. Aeste fin se desarrolló un procedimiento químico que redujo la presencia de 26Mg a niveles delorden de 5 ppm en muestras de 500 μg de Al. Esta supresión de la interferencia isobárica,conjuntamente con la eficiencia de detección lograda, permite detectar la presencia de 26Alen muestras conteniendo tan sólo 10 5 átomos de este isótopo. Mediante este nuevo método se determinó la intensidad de tres resonancias de la reacción 25Mg(p,γ)). Estas resonancias, con energías E lab p = 316,1; 389,0 y 434,5 keV dominan laproducción estelar de 26Al en novas y presupernovas (0,1 GK <~ T <~ 1,5 GK). Los resultadoslos obtenidos en este trabajo coinciden con las mediciones más recientes de estas resonancias.

Descripción: Fil: Bossio Sola, Jonathan David. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: La presente tesis describe la búsqueda de quarks top producidos de manera simple (a diferencia de la producción en pares top-antitop) a través de un vértice de la interacción electrodébil en colisiones protón-antiprotón a una energía de centro de masa de raiz cuadrada de s=1:96 TeV. El análisis utiliza un total de 2.3 fb*-1 de datos colectados con el detector DØ en Fermilab, correspondientes a dos períodos diferentes de corrida del colisionador Tevatron. En el Tevatron son dos los canales que contribuyen a la producción simple de quarks top, el canal s y el canal t. En el canal s, la aniquilación de un quark y un antiquark produce un bosón W virtual, el cual luego decae en un quark top y un quark bottom. El quark top decae casi de manera exclusiva en un bosón W y un quark bottom. Aquí se consideran los estados finales en los que el bosón W decae leptónicamente en un electrón o un muón más un neutrino. Así, a nivel del detector, el estado final que caracteriza al canal s contiene un leptón, energía faltante que da cuenta del neutrino, y dos jets correspondientes a los dos quarks bottom. En el canal t, el estado final contiene un jet adicional proveniente de un quark liviano. Claramente, una reconstrucción precisa de los eventos requiere una medición precisa de la energía de los jets. Dado que la cantidad de eventos de fondo es enorme aún después de aplicar una selección de eventos, se utiliza una técnica de multivariables, redes neuronales bayesianas, para separar la señal del fondo. Para medir la sección eficaz de quarks top simples se computa una probabilidad bayesiana. Asumiendo que el exceso observado se debe a eventos de quarks top simples, la sección eficaz de producción de quarks top simples medida es sigma(p p -> tb + X, tqb + X) = 4:70*(+1,18) pb. (-0,93) El exceso observado se asocia con un valor-p de (3.2 +/- 2.3)x10*(-8), asumiendo la hipótesis de la presencia de únicamente eventos de fondo. Dicho valor-p corresponde a un exceso sobre el fondo de 5.4 desviaciones estándar para una densidad gaussiana. El valor-p computado usando la sección eficaz del modelo estándar de 3.46 pb para la señal es (22.7 +/- 0.6)x10*(-6), correspondiente a una significancia esperada de 4.08 desviaciones estándar.

Descripción: Se presenta la medición de la sección eficaz diferencial inclusiva de jets en colisiones pp a una energía del centro de masa de √s = 1.8 TeV. La medición se realiza en función de la energía transversa del jet para seis intervalos de pseudorapidez η. El análisis se basa en una muestra de 13.1 ±1.8 pbֿ¹ tomados por el detector D0 en el Tevatrón del Fermi National Accelerator Laboratory durante 1992 - 1993 (run 1A). Esta medición es una prueba cuantitativa de la interacción fuerte, descripta por QCD. D0 ha extendido la medición de la sección eficaz diferencial inclusiva de jets a intervalos de pseudo-rapidez previamente inaccesibles. Por primera vez, se midió esta cantidad en el rango 2 < │η│ < 3, proveyendo nuevos datos experimentales para verificar las predicciones teóricas de QCD. Las mediciones fueron comparadas con los cálculos de QCD a orden NLO. Los cálculos y el experimento coinciden razonablemente para ET < 100 GeV en las regiones de pseudo-rapidez centrales (│η│ < 1) y frontales (2 < │η│< 3). El acuerdo es marginal en la región IC (1 < │η│ < 2), donde aún no existen estudios completos de los errores sistemáticos involucrados. Por encima de 100 GeV, las curvas experimentales están por encima de las teóricas. La discrepancia crece linealmente en función de ET, tendencia observada en todos los intervalos de η. Dada la magnitud del error de la medición, mayor que 30%, no es posible extraer, por el momento, información alguna que favorezca algún conjunto particular de funciones de distribución partónicas (PDF). Es necesario entender mejor las fuentes de error sistemático de manera de achicar la banda de incerteza. Eventualmente, sería posible en el futuro desechar algunos conjuntos de PDF, hacer una mejor verificación de QCD y establecer un nuevo límite inferior en la escala asociada a la estructura del quark.

Descripción: Esta Tesis presenta la primera medición de la sección eficaz inclusiva de jets reconstruídosutilizando el algoritmo k┴ en un colisionador de hadrones. La mediciónse basa en una muestra de 87.3 pb-1, recolectada por el experimento DØ enel colisionador protón-antiprotón Tevatron de Fermilab durante los años 1994 y 1995. La sección eficaz, como función del momento transverso (pT) de los jets,presenta un acuerdo razonable con las predicciones teóricas realizadas al ordensiguiente al dominante, excepto a bajo pT, donde el acuerdo es marginal. En estetrabajo también se presentan resultados de la comparación entre jets k┴ y jetsreconstruidos con el algoritmo de cono fijo. Tanto los datos experimentales comola simulación Monte Carlo indican que los jets k┴ (D = 1) son más energéticosque los jets de cono fijo (R = 0.7). Esta diferencia de energía explica la diferenciaentre las secciones eficaces de k┴ y cono.

Descripción: Fil: Aberle, Detlef A.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Esta Tesis presenta una medición preliminar de la vida media de un mesón B± a través de la reconstrucción de su cadena de decaimiento, y de la producción de quarks top en el canal de electrón mas jets, usando el método de vértices desplazados para la identificación de jets-b. Su principal contribución es el desarrollo, implementación y optimización del algoritmo de filtros de Kalman para la reconstrucción de vértices, y del método de vértices desplazados para identificar jets provenientes de la fragmentación de quarks b. Estos dos algoritmos forman ahora parte del paquete estandar de reconstrucción del experimento DØ, y explotan al máximo la tecnología de punta de los nuevos detectores de trazas recientemente instalados. El análisis está basado en datos tomados hasta abril de 2003 en el Colisionador hadrónico pp de Fermilab, correspondiente a una luminosidad integrada de 60pb^-1. La medición de τ=1.57±0.18 ps para el bosón B está de acuerdo con el valor aceptado de su vida media, y permite esperar un nivel de presición altamente competitivo para la toma de datos.

Descripción: En la presente tesis se ha estudiado un Plasma Focus de 4.7 kJ, como fuente pulsada de rayos x de alta energía y explorado sus aplicaciones en cuanto a la obtención de radiografías no convencionales. Se formuló e implementó experimentalmente un método de análisis espectral basado en la atenuación diferencial de la radiación de interés en muestras metálicas, y en el análisis densitométrico de sus radiograf ías. Como filtros se emplearon muestras de cobre, níquel, titanio y plata con espesores comprendidos entre 0.1 y 10 mm. La radiación x fue detectada empleando un sistema de película-pantalla de uso habitual en radiografía general. Los resultados muestran que las componentes más importantes del espectro se hallan comprendidas entre 40 y 150 keV. El método de análisis espectral propuesto es de sencilla aplicaci ón en otros laboratorios, no tiene costo excesivo y permite determinar el espectro x emitido en un único disparo del equipo a partir de radiografías con exposición autocalibrada. El efecto que tiene el uso de muestras de espesor finito en la medición, fue analizado mediante simulaciones realizadas usando el código MCNP, de la transmisión de fotones con energías en el rango de interés, en muestras como las empleadas. Se estudió también la reproducibilidad de las propiedades espectrales en condiciones en las que el equipo está en régimen de operación optimizada para la producción de rayos x. Los resultados demuestran que la emisión x empleada en las aplicaciones radiográficas de interés, tiene propiedades espectrales reproducibles respecto de los parámetros de operación del Plasma Focus. Se ha investigado experimentalmente el campo dosimétrico x de la fuente, empleando detectores TLD 700 (LiF:Mg,Ti). Los detectores fueron procesados empleando un equipo marca Harshaw modelo QS3500. Se obtuvo que a 53 cm de la fuente y sobre el eje de simetría de los electrodos, la dosis es de (53 +/- 3)muGy y que resulta uniforme para ángulos menores a 6 medidos respecto de dicho eje. Adicionalmente se presentan resultados de la dependencia de la dosis con la posición angular respecto del eje de simetría de los electrodos. Se exploraron distancias fuente-detector comprendidas entre 50 y 100 cm, y posiciones angulares de +/- 70º . Finalmente, se presenta una muestra de los resultados que pueden lograrse empleando un Plasma Focus como fuente de radiación pulsada para obtener radiografías de objetos metálicos, incluso cuando estos están ocultos detrás de paredes también metálicas.

Descripción: Esta Tesis estudia la medición de neutrinos cósmicos ultra energéticos mediantedetectores de superficie. Básicamente existen dos mecanismos a través de los cualeslos neutrinos en el rango del EeV pueden inducir señales distinguibles a nivel desuperficie. El primero consiste en la interacción de un neutrino en la atmósfera,via corrientes cargadas o neutras, y la subsiguiente producción de una cascadaatmosférica extendida descendente. El segundo se basa en la interacción de unneutrino tau en la corteza terrestre al atravesarla de manera rasante. Este procesoda lugar a un leptón tau capaz de escapar hacia la atmósfera e iniciar en sudecaimiento una lluvia extendida ascendente de alto ángulo. En ambos casos,cuando la cascada se inicia cerca del detector, existen características en la señalproducida, relacionadas con la presencia de componente electromagnética en lalluvia, que permiten discriminar este tipo de eventos del fondo dominante debidoa rayos cósmicos de origen hadrónico. Este trabajo se divide en dos partes, que abordan dos tecnologías diferentespara estudiar las lluvias atmosféricas producidas por neutrinos. La primera partetrata la búsqueda de neutrinos basada en la interacción de las partículas de lalluvia con el Detector de Superficie del Observatorio Pierre Auger. En particular sedescribe el procedimiento de identificación, las posibles fuentes de fondo, el métododesarrollado para calcular la exposición y sus incertezas sistemáticas asociadas enla búsqueda. Asimismo, se presenta por primera vez la integración de los distintosanálisis complementarios desarrollados en Auger, que incluyen dos criterios dereconocimiento de neutrinos descendentes y uno de neutrinos rasantes, en un únicoresultado, así como la inclusión del envejecimiento del detector en el cálculo de laexposición. Ningún candidato a neutrino fue encontrado en los datos adquiridosentre el 1 de enero de 2004 y el 20 de junio de 2013. Suponiendo un flujo diferencial típico ϕ(Ev) = k * Ev^-2 y una relación entre sabores de 1 : 1 : 1, se fijó un límitesobre el flujo de neutrinos de cada sabor, de k < 6,4*10^9 GeV cm^2 s^-1 sr^-1con un nivel de confianza del 90% en el rango de 1,0*10^17 eV - 2,5*10^19 eV, elmás estricto hasta la fecha. En la segunda parte de este trabajo se estudia el potencial de la detecciónde las ondas de radio producidas por lluvias atmosféricas para identificar aquellasproducidas por neutrinos, y se investigan las capacidades y limitaciones de unarreglo de antenas de radio a la hora de detectar neutrinos ultra energéticos rasantes. Para ello se utilizaron simulaciones que incluyen la interacción del neutrino en la Tierra, el decaimiento del leptón tau en la atmósfera, el subsiguiente desarrollode la lluvia atmosférica extendida con producción de radiación electromagnéticaen frecuencias de radio, y la generación de la señal en las antenas del detector. Apartir de estas simulaciones se desarrollaron algoritmos de reconstrucción e identificación que permiten distinguir eventos iniciados por neutrinos de los generadospor el fondo de lluvias hadrónicas. Se utilizaron estos criterios para calcular laexposición que podrían alcanzar detectores de diferentes tamaños y topologías,concluyendo que la técnica puede ser competitiva para la siguiente generación dedetectores de neutrinos.

Descripción: 1. Se describe dos métodos para determinación de espectros de neutrones, incluyendo el cálculo completo de las correcciones por escape, y dos métodos para determinar intensidades totales por recuento de protones. 2. Fueron medidos los espectros de neutrones (de 5 a 15 MeV) de la reacción Li7(d,n)Be8 producida en el acelerador en cascadas (IMV) de la C.N.E.A.- Se determinó así mismo la distribución angular de la intensidad total de neutrones rápidos (1 a 15 MeV) alrededor del blanco (0-150°). 3. Los resultados del cálculo del Q de la reacción para los espectros medidios evidencian la existencia de los niveles de exitación del Be8: 2,8; 4,2 y 5 y el nivel 3,4 MeV todavía no resuelto antes en experiencias similares.

Descripción: Fil: Chilla, Juan Luis Alberto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Los meteoritos contienen en su interior el registro de parte de la historia del Universo. En su viaje por el espacio son alcanzados por las partículas energéticas que componen laradiación cósmica, básicamente protones y partículas alfa. Estas partículas penetran en lamateria extraterrestre e inducen reacciones nucleares cuyos productos son isótoposcosmogénicos, estables o radiactivos. La presencia de este tipo de radioisótopos o lasconcentraciones anómalas de los nucleidos estables pueden ser utilizadas para el estudio de laintensidad de los rayos cósmicos en el pasado, su espectro de energía, la dosis de radiaciónacumulada sufrida por los meteoroides y el tiempo durante el cual han estado sometidos aella. Por otra parte, una vez que los cuerpos celestes han caído a la Tierra, la medición de lasconcentraciones de ese tipo de elementos es útil para la estimación del tiempo transcurridodesde la caída a nuestro planeta y de la posición preatmosférica de las muestras, lo cualpermite inferir el tamaño de los meteoritos antes de penetrar en la atmósfera terrestre. Las vidas medias de los radioisótopos cosmogénicos cubren un amplio rango detiempos, los cuales pueden ser muy pequeños, fracciones de segundos o extremadamentelargos, del orden de 10(10) años. En general, los meteoritos que se estudian han sido recogidosvarios cientos o miles de años luego de su caída. Por ello sólo es posible medir aquellosradioisótopos con vidas medias largas. La técnica de espectrometría de masas con aceleradores de partículas (AMS) esparticularmente útil para medir la concentración de isótopos cuyas vidas medias oscilan entre 10(3) y 10 (8) años. Los productos de decaimiento de esta clase de nucleidos no pueden serdetectados en períodos ordinarios y por medio de técnicas usuales de detección. Por otraparte, su concentración es del orden de 10(-12) o menor, por lo que no es posible detectarlos pormedio de Ia espectrometría de masas convencional. AMS posee la sensibilidad adecuada paralograr mediciones confiables mediante el conteo individual de átomos del radionucleido encuestión. Las muestras, que pueden ser tan pequeñas como l mg de material, deben pasar porun proceso químico previo el cual sirve para disminuir las contaminaciones y convertirlas auna forma apta para ser colocadas en la fuente de iones de los aceleradores de partículas. El objetivo del presente trabajo es el estudio de parte de la historia del meteoritocaído en Campo del Cielo, Argentina. Para ello, se aplica la técnica de AMS a la medición dela concentración de cinco radioisótopos cosmogénicos de vida media larga: 10Be, 26Al, 36Cl, 41Ca y 59Ni, en muestras provenientes de dos fragmentos de dicho meteorito. Uno de ellos es,a su vez, parte de un fragmento expuesto en varios museos del mundo, El Taco, mientras queel otro fue levantado del suelo en las cercanías de los cráteres. Los resultados obtenidos y sucomparación con los modelos teóricos existentes para las tasas de producción deradioisótopos cosmogénicos permitieron extraer conclusiones acerca de la edad terrestre delmeteorito, de la posición de las muestras en el meteoroide madre y en consecuencia deltamaño del mismo antes de caer a la Tierra.

Descripción: La forma del pico de Captura Electrónica al Continuo (ECC) constituye una informaciónimportante para estudiar la evolución de un electrón en dos centros coulombianos. A partir de la introducción del desarrollo paramétrico y el metodo estándarde procesamiento por Meckbach, Nemirovsky y Garibotti en 1981, se realizaron numerososesfuerzos para caracterizar cuantitativamente la asimetría del pico de ECCcon dispares resultados. En este trabajo estudiamos los problemas que involucra laaplicación del método estándar. Realizamos mediciones de la emisión electrónica en colisiones de H+ y He2+ sobreun blanco gaseoso de He con energías entre 50 y 200 keV/amu. Relevamos exhaustivamentela estructura de la sección eficaz doblemente diferencial en las proximidadesdel pico de ECC (v' < 0.3 au, —1.5° ≤ Ө ≤ 10°) poniendo especial cuidado en lanormalización angular de los espectros. Para analizar la estructura del pico de ECC proponemos un método que consisteen (i) desarrollar la sección eficaz en término de funciones angulares, (ii) aplicar unmétodo para determinar la velocidad del proyectil v1,(iii) remover la divergencia dividiendola medición por una función apropiada, y (iv) ajustar el resultado obtenido porrectas. Demostramos que este enfoque resuelve los problemas que presenta el métodode procesamiento estándar. En los resultados de nuestras mediciones distinguimos la existencia de dos regímenespara la ionización según que el módulo de la velocidad electrónica sea mayor o menorque la velocidad del proyectil. Finalmente, comparamos los resultados experimentales con los cálculos de las aproximaciones CDW y CDW-EIS. Ambas teorías subestiman la asimetría divergente. Elcálculo de CDW describe cualitativamente bien la parte no divergente del pico de ECC.

Descripción: En esta tesis se estudia un modelo probabilístico sobre el espacio de permutaciones deun conjunto discreto e infinito de puntos siguiendo el enfoque de la mecánica estadística. Concretamente, una permutación σ es sorteada de forma proporcional al pesoexp{−α Ʃ V (σ(x) − x)}, (1)donde α > 0 representa la temperatura y V es un potencial no negativo y continuo. Desdeel punto de vista físico el caso más relevante es V (x) = ǁxǁ2, ya que está relacionado conuna representación del fenómeno de la condensación de Bose-Einstein introducida por Feynman en los 50’. Los pesos (1) definen una medida de probabilidad cuando el conjuntode puntos es finito, pero obtener una construcción consistente cuando el conjunto depuntos es infinito no es trivial y requiere de hipótesis adecuadas. El primer problemade este modelo, es encontrar condiciones bajo las qué se puede obtener una medida deprobabilidad cuando el conjunto de puntos es infinito. Establecida la existencia, interesasaber si es única y cómo es la estructura de ciclos de una permutación típica bajo estamedida. Las preguntas anteriores se analizan en el régimen de alta temperatura cuando el conjuntode puntos viene dado por un proceso puntual de Poisson en Zd con intensidad ρ ∈ (0, 1/2),y el potencial V verifica algunas condiciones de regularidad. En particular, se prueba quesi α es suficientemente grande, para casi toda realización del proceso puntual, existe yes única la medida de Gibbs asociada a las distribuciones finito dimensionales de peso (1). A su vez se demuestra que bajo la medida de Gibbs anterior, una permutación típicacontiene solamente ciclos finitos. Los resultados anteriores se extienden al contexto continuo, es decir, cuando el conjuntode puntos es una realización de un proceso puntual de Rd con baja densidad.

Descripción: Cuando en un gas binario se produce un gradiente de alguna o detodas las variables que determinan su estado, es decir, P, T y N, seoriginan en el gas, fenómenos de transporte totales o parciales. Asípara un gradiente de N, se produce un transporte parcial de masa, caracterizado por un coeficiente de difusión. Para un gradiente de T seorigina un transporte de calor, que está relacionado con un coeficientede conductividad térmica. Para un gradiente de P, se produce un transporte de masa total,el cual tiene relación con el coeficiente de viscosidad de un gas. Seobserva que un gas que fluye a lo largo de un capilar experimenta unaresistencia al flujo, la cual aumenta del centro, hacia las paredes deltubo, llegando a ser cero la velocidad de la capa del gas en contactocon estas. La fuerza que se opone al movimiento es proporcional al gradiente de velocidad transversal, siendo el coeficiente de proporcionalidad,la viscosidad especifica del gas. Se puede explicar la existenciadel coeficiente de viscosidad específica, como debido al intercambiode impulso entre moléculas de una capa mas lenta y una mas rápidadel gas, durante el choque. Esta viscosidad se designa con . Para la primera aproximación sólo se consideran choques binarios. El coeficiente de viscosidad resulta así función de los parámetrosde choque, y de las fuerzas intermoleculares. Tanto los primeros comoestas últimas dependen del modelo molecular elegido; por lo tanto obtendremos expresiones distintas para la viscosidad según el tipo de moléculas consideradas. Inversamente, según los valores de la viscosidadobtenidos a distintas temperaturas, será posible calcular los parámetrosde choque y el potencial intermolecular, que definen un modelo. En este trabajo se ha medido el coeficiente de viscosidad por elmétodo de transpiración. Este consiste en medir el tiempo (t) que tardaun gas en escurrir a través de un capilar. Se verifica que el cociente η/t es igual a una constante, si el gas se puede considerar ideal. De no ser así, será necesario multiplicar este producto por un factorde corrección (γ) que depende del segundo coeficiente virial del gas. Comparando dos gases en iguales condiciones experimentales se verificaque:η/ηˈ=t/tˈ (1+ξ) ( ) El método de transpiración resulta así un método relativo ya, que conocidala viscosidad de un gas, y medidos los tiempos de escurrimiento,puede calcularse la viscosidad desconocida del "gas-problema". Se imponen sin embargo algunas precauciones en las condiciones detrabajo, para que la aplicación de la fórmula anterior sea válida. Estas son: a) el flujo debe ser isotermo b) el flujo debe ser laminar. Esto significa que la velocidad linealdel gas, debe ser tal que, el valor del número de Reynoldscalculado a partir de la misma, debe ser inferior a 2100. c) El flujo debe ser suficientemente pequeño como para no hacer necesarias correcciones por pérdida de energía cinética a la salida del capilar. d) La presión no debe ser tan baja, como para que el libre caminomedio de las moléculas sea del orden del diámetro del tubo ypredominen así los choques con las paredes, en lugar de los choques binarios. Habiéndose comprobado que ninguna de estas condiciones adversas ala aplicación de la fórmula (*) se cumple, de determinaron los tiemposde escurrimiento del vapor de H2O y de D2O a 74,4°C; 80,4°C y 89,9°Ctomándose como viscosidad standard la del aire a 23°C. Se hicieron dosseries de 60 medidas cada una, para cada sustancia y cada temperatura. Se tomó el valor mas probable del tiempo de escurrimiento, t, como elpromedio de cada serie de 60 determinaciones. Para todas las series de medidas se calculó el error cuadrático medio, el error medio del promedio y el error mas probable del promedio,y se estudió la distribución de los errores, en base a los momentos primero, segundo, tercero y cuarto de la función de distribución. Calculando el factor de corrección (1+ξ) se comprobó, que su omisiónintroduce un error, inferior al error experimental, por lo que sedespreció. Con la fórmula (*) se calculó la viscosidad de los vaporescitados a las temperaturas indicadas. Si la sustitución isotópica en las dos moléculas no cambia fundamentalmente el modelo molecular, debe cumplirse, aún aproximadamenteque:η(D2O)/η(H2O) = √[M(D2O)/M(H2O)] = 1,054 (**)siendo M(D2O) y M(H2O) pesos moleculares. Otros experimentadores han medido esta relación para las moléculas H2 y D2; y para el H2O y D2O a temperaturas levemente superiores alas muestras. (ver citas (1)(25)). Para el H2 y D2 la relación (**) se cumple al estado gaseoso y alestado líquido. Para el H2O y D2O ésta se cumple al estado gaseoso sólode una forma aproximada, obteniéndose valores diferentes de 1,054 para el estado líquido. Los valores de la relación (**) calculados en base a los datos experimentales obtenidos, confirman que esta se cumple aproximadamente para los vapores estudiados a todas las temperaturas experimentadas. Sin embargo, se observa que a los 80°C esta relación se cumple exactamente, obteniéndose en esta zona de temperaturas, un valor mínimo difícilde explicar en base a la teoría. La falta de datos en la regiónde temperaturas inferiores, impide hacer un estudio mas detallado de lacurva. Debido a las dificultades experimentales esto puede ser objetode otro trabajo. Se ha intentado el cálculo del diámetro de colisión (σ) y delpotencial de atracción (λ12) para el modelo de Lennard-Jones, sinéxito, con lo cual puede asegurarse, que el comportamiento de estas 2moléculas no se puede describir con este modelo. Una expresión que permite obtener valores correctos para el 2° coeficiente virial del vapor de H2O, fué calculada por Rowlinson (citasa partir del potencial de Stockmayer para moléculas polares. Por faltade datos numéricos en la literatura para moléculas de la polaridad del H2O, fué imposible calcular constantes moleculares, para este potencial. Por lo antedicho se supone, sin embargo que este potencial puede describir correctamente el comportamiento de las 2 moléculas estudiadas. Se han calculado los valores de los diámetros de colisión (σ)del potencial de atracción (λ12) y de la constante S, para elpotencial de Sutherland, obteniéndose valores que pueden considerarseiguales para ambas moléculas.

Descripción: Fil: Molter, Ursula María. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: La determinación de bacterias coliformes, mediante siembradirecta del agua en medios de cultivo sólidos no ha alcanzado grandifusión a pesar de las ventajas que reporta este método de examen. Ello se debe fundamentalmente a la falta de un medio de cultivo sólidoque permita diferenciar con certeza bacterias que fermentanlactosa con producción de ácido y gas, propiedad esta última característicade las bacterias coliformes. Las ventajas que se obtendrían si se dispusiera de un medioaltamente selectivo y desprovisto de acción inhibitoria paralas bacterias coliformes, serían apreciables, pues la cuenta de coloniasen agar es un método más exacto que el de las diluciones sucesivasen medio líquido. Por otra parte sería posible conocer ladistribución relativa de los distintos tipos coliformes en la muestra,dato que no es posible establecer usando medios líquidos, debidoa la diferencia de velocidad con que desarrollan las distintasespecies. La rapidez con que se obtienen los resultados finales ylo innecesario de realizar numerosas diluciones para la siembra,son otras ventajas adicionales. El medio que es objeto de este trabajo, presenta a nuestrojuicio ventajas sobre los que se han propuesto para este fin y sebasa en la observación que el ion fosfato (Ferramola) (') influyefavorablemente en la viabilidad y reproducción de las bacterias coliformes. Esta observación ha sido aprovechada por Leiguarda paramejorar el medio líquido de Mac Conkey, incorporándole fosfato desodio, con lo que se logra disminuir su ligero poder inhibitoriosobre bacterias coliformes, sin alterar su alta selectividad. Las experiencias se realizaron partiendo de un medio basalconstituído por agar-peptona-extracto de carne-tornasol y lactosa. Este medio, desprovisto de sustancias inhibitorias, pudoser mejorado notablemente agregándole una cantidad apropiada defosfatos alcalinos, lo que permitió el desarrollo de mayor númerode colonias en siembras con suspensiones puras de bacterias coliformes. Posteriormente, se investigó el comportamiento de agentesselectivos con el fin de eliminar en lo posible los organismos nocoliformes y finalmente se estudió la influencia de la concentraciónde los componentes del medio (peptona, extracto de carne, lactosa)como también de la temperatura de incubación. Una serie deensayos comparativos, efectuados con aguas de distinto origen permitiócomprobar su eficiencia. El medio definitivo tiene la siguiente composición: peptonal g., extracto de carne 0,6 g., fosfatos alcalinos 0,6 g.,taurocolato de sodio 0,4 g., lactosa l g., agar 2 g., eosina amarilla (solución acuosa al 2%) 2 ml., azul de metileno (soluc. acuosaal 0,325%) 2 ml., agua destilada 100 ml. Para la determinación de bacterias coliformes en una muestrade agua, se siembra una porción adecuada de ésta (5 ml, 1 ml.o el mismo volumen de una dilución decimal en agua esteril), sedistribuye sobre la superficie del medio previamente solidificadoen una caja de Petri y después de evaporar el exceso de agua a 37°C., se incuba durante 48 horas a la misma temperatura. En el nuevo medio Esch. coli produce colonias de aproximadamente 0,5 cm. de diámetro (48 hs/ a 37°C.), chatas, secas de colorvioleta oscuro en toda la superficie y con reflejos metálicos. El Aerobacter aerogenes en cambio, origina colonias elevadas, mucoides,confluentes, de tamaño similar al anterior y de color violetaen el centro, pero blanquecinas en la periferia. Los tipos intermediarios son de diferenciación incierta. La distinta morfología que presentan las colonias de Esch. coli y A.aerogenes permite determinar en forma aproximada la distribuciónrelativa de estos tipos coliformes en la muestra examinada. La simplicidad de la preparación del medio y de la técnicade siembra son ventajas adicionales del nuevo medio. ('): Comunicación personal.

Descripción: El análisis formal de especificaciones de software suele atacarse desde dosenfoques, usualmente llamados: liviano y pesado. En el lado liviano encontramoslenguajes fáciles de aprender y utilizar junto con herramientasautomáticas de análisis, pero de alcance parcial. El lado pesado nos ofrecelograr certeza absoluta, pero a costo de requerir usuarios altamente capacitados. Un buen representante de los métodos livianos es lenguaje de modelado Alloy y su analizador automático: el Alloy Analyzer. Su análisis consisteen transcribir un modelo Alloy a una fórmula proposicional que luego seprocesa utilizando SAT-solvers estándar. Esta transcripción requiere que el usuario establezca cotas en los tamañosde los dominios modelados en la especificación. El análisis, entonces, esparcial, ya que está limitado por esas cotas. Por ello, puede pensarse queno es seguro utilizar el Alloy Analyzer para trabajar en el desarrollo deaplicaciones críticas donde se necesitan resultados concluyentes. En esta tesis presentamos un cálculo basado en álgebras de Fork que permiterealizar demostraciones en cálculo de secuentes sobre especificaciones Alloy. También hemos desarrollado una herramienta (Dynamite) que loimplementa. Dynamite es una extensión del sistema de demostración semiatomático PVS, método pesado ampliamente utilizado por la comunidad. Así, Dynamite consigue complementar el análisis parcial que ofrece Alloy,además de potenciar el esfuerzo realizado durante una demostración usandoel Alloy Analyzer para detectar errores tempranamente, refinar secuentes yproponer términos para utilizar como testigos de propiedades cuantificadasexistencialmente.

Descripción: En un mundo en el que a los robots se les asignan periódicamente tareas cada vez más cruciales, es esencial proporcionar capacidades de mapeo y localización eficientes, sólidas y precisas. Una plataforma robótica móvil que opera en un entorno desconocido o impredecible requiere localizarse adecuadamente y, simultáneamente, construir una representación útil del entorno, con el fin de emitir respuestas lo suficien- temente robustas para la toma de decisiones que no comprometan la seguridad o recursos. Este problema se conoce como localización y mapeo simultáneo (Simultaneous Localization and Mapping, SLAM), el cual es un requisito previo fundamental para lograr la navegación autónoma y representa uno de los principales temas de investigación en la comunidad de robótica. En la presente tesis de investigación se presenta una versión extendida del exitoso sistema de Visual SLAM, S-PTAM (Stereo Parallel Tracking and Mapping), especialmente diseñado para hardware embebido con recursos computacionales limitados. Se introduce una política de segmentación de mapas que mejora la concurrencia de los módulos y permite trabajar de manera eficiente en áreas no conflictivas. Los algoritmos propuestos permiten seleccionar de manera eficiente partes relevantes del mapa a nivel local y ejecutar varias operaciones críticas con complejidad computacional que no dependa del tamaño total del mapa, otorgando así, una mayor escalabilidad al sistema SLAM. Para una experimentación realista y repetible, el sistema resultante se evalúa sobre el dataset EuRoC MAV disponible públicamente, empleando un dispositivo de cómputo embebido de bajos recursos. Se propone, además, un novedoso enfoque SLAM con capacidades de estimación de la incertidumbre. La solución permite reducir la cantidad de variables de estado consideradas durante el proceso de estimación, manteniendo una consistencia aproximada tanto en los valores estimados como en las incertidumbres con respecto a la formulación probabilística. Se proporciona una metodología para construir un prior en tiempo acotado, independientemente del área del grafo seleccionado. Este prior servirá para contextualizar una optimización local, dando como resultado estimaciones consistentes en términos de incertidumbre. Por último, la tesis presenta una aplicación de exploración y planificación de trayectorias multi-robot utilizando métodos SLAM capaces de mantener estimaciones consistentes de incertidumbre. De esta forma, se demuestran los beneficios existentes de los enfoques SLAM desarrollados, logrando ser empleados para tareas de navegación autónoma eficientes.

Descripción: Comparando las intensidades de radiación beta y gamma de sandwichesde oro, se ha encontrado que para la aplicación del método del sándwich ala medición de espectros de neutrones, es preferible usar las intensidadesde la radiación beta. Se midieron las intensidades de radiación gamma y beta de sandwichesde espesores entre 0,06 y 1,2 g/cm2. Ios resultados experimentales se compararon con los valores teóricos calculados. La activación producida por los neutrones cuya energía correspondea la resonancia principal y a la parte l/v de la sección eficaz del Au197,se ha calculado teniendo en cuenta el efecto Doppler y la absorción en lacápsula de cadmio. Además, se ha calculado la contribución a la activaciónpor neutrones que fueron dispersados una vez. Las integraciones sobre energía y espacio se hicieron en forma numérica. La activación debida a las resonancias secundarias se ha calculado con unmétodo aproximado. La autoabsorción de la radiación gamma se calculó usando la función F2 (µjX). La intensidad de la radiación beta se obtuvo calculando la autoabsorcióncon la ley exponencial de absorción de la radiación beta y sumando la contribución de los electrones secundarios. Finalmente se ha mostrado que se puede disminuir la discrepancia entrelos valores experimentales y teóricos calculando la activación debidaa las resonancias con el método más exacto usado para la resonancia principal.

Descripción: Los métodos de prospección geofísica Radar de Penetración Terrestre o Georadar (GPR), Geoeléctrico e inducción electromagnética espira-espira (EMI), permiten obtener información precisa de las propiedades eléctricas del subsuelo, a partir de mediciones realizadas en superficie. Los mismos son no invasivos y no destructivos, y relativamente rápidos en campo. Por estas razones, son ampliamente utilizados en numerosas aplicaciones asociadas a problemáticas que involucran profundidades someras. En la presente Tesis se proponen desarrollos innovadores para estos métodos geofísicos, que mejoran sus capacidades para caracterizar la estructura de los primeros metros del subsuelo y detectar en el mismo objetos de interés en ingeniería y arqueología. En las aplicaciones de GPR usualmente se adquieren grandes volúmenes de datos. En estos casos, el procesamiento de los mismos y, muy especialmente, su inspección en busca de las señales correspondientes a las estructuras objetivo, la cual se realiza de manera no automática, implican cantidades considerables de tiempo y esfuerzo humano, lo que a su vez incrementa la posibilidad de errores de interpretación. De lo expuesto resulta clara la relevancia de implementar métodos confiables para realizar dicho proceso de manera automática, pues su uso aliviaría notoriamente el trabajo del analista y contribuiría a la confiabilidad de las interpretaciones. Empleando métodos de aprendizaje supervisado, en particular, Redes Neuronales Artificiales (ANN), y Máquinas de Vectores de Soporte (SVM) en combinación con los descriptores de características de imagen Patrones Binarios Locales (LBP) e Histograma de Gradientes Orientados (HOG), se obtuvieron, respectivamente, tres algoritmos de detección automática de señales de bridas de tuberías en secciones de datos de GPR con offset constante (CO). Los mejores desempeños correspondieron a los algoritmos basados en ANN y SVM combinado con HOG, los cuales brindaron resultados muy satisfactorios en su aplicación a datos reales adquiridos sobre un mineraloducto ubicado en la Pcia. de Catamarca. SVM con LBP dio resultados algo más pobres. Por otra parte, utilizando clasificadores en cascada de Viola-Jones en conjunción con los descriptores LBP, HOG y Haar, y datos GPR-CO de sitios arqueológicos pre-Incaicos e Hispano-Incaicos ubicados en la zona Andina de Catamarca, se implementaron algoritmos de detección automática de señales de paredes de adobe y tapia, comunes en los sitios arqueológicos de toda esta región. El descriptor LBP brindó resultados malos. Por el contrario, los mejores algoritmos obtenidos con HOG y Haar proporcionaron tasas de detección altas para paredes bien conservadas y tasas aceptables para paredes deterioradas, con un bajo número de predicciones espurias. Inclusive, estos algoritmos exhibieron cierta capacidad de detectar paredes colapsadas y fragmentos desprendidos de ellas. Los mapas 3D obtenidos en base a estas detecciones delinearon en detalle la mayoría de las estructuras presentes en cada sitio. Estos resultados son notables ya que, por sus características, esta clase de paredes son difíciles de detectar aún mediante metodologías convencionales. Es importante destacar que todos los métodos de detección automática descriptos fueron implementados y pueden ser utilizados en computadoras personales de gama mediaalta, siendo su aplicación extremadamente rápida. Una ventaja fundamental de estas metodologías es que una vez obtenido un algoritmo para determinada aplicación, el mismo puede ser utilizado de forma directa en otros sitios con características similares. Estimar adecuadamente los errores de los datos geoeléctricos es complejo. Por este motivo, generalmente, los mismos no son considerados al aplicar los métodos de inversión que brindan los modelos de resistividad del subsuelo. La manera actualmente aceptada de estimar los errores se basa en la realización de mediciones reciprocas, pero esto prácticamente duplica los tiempos de adquisición y sólo provee resultados adecuados para algunas configuraciones de electrodos. En esta Tesis se presentan métodos numéricos, alternativos a ese procedimiento, que proveen estimaciones bastante aproximadas de los errores. Estos métodos sirven para cualquier arreglo de electrodos y, al ser numéricos, no incrementan los tiempos de medición. Al considerar estos errores para las inversiones, se reducen las anomalías espurias en los modelos de suelo. En esta misma línea, también se desarrollaron un procedimiento numérico y uno de campo que permiten estimar los errores de los datos EMI (los que usualmente no son informados por esos instrumentos). El segundo procedimiento además incrementa la relación señal-ruido. Al igual que en el caso de geoeléctrica, el uso de los mismos mejora apreciablemente los modelos de subsuelo obtenidos. Para los datos geoeléctricos, existen métodos eficientes de inversión 1D, 2D y 3D. En el caso de EMI, principalmente debido a que el modelado directo es más complejo, aún hoy en día, todavía se utilizan mayoritariamente métodos de inversión 1D. Una vez implementados los procedimientos de adquisición y procesado de datos descriptos en el párrafo precedente, se desarrolló una solución alternativa para el problema de inversión 1D de datos EMI e inversión conjunta 1D de datos EMI y geoeléctricos, basada en ANN. La inversión conjunta de ambos tipos de datos puede aportar información relevante, especialmente en aquellos casos donde las respuestas del terreno a las fuentes empleadas por cada método (campos magnéticos inductores cuasi-estacionarios y corrientes continuas, respectivamente) son diferentes. El método desarrollado, junto con los procedimientos de adquisición y procesado de datos antes mencionados, se aplicó exitosamente para estudiar un sitio con suelo arcillo limoso, próximo a un arroyo, en la zona sur del Gran Buenos Aires y contaminación por barriles enterrados en el terreno trasero de una industria, también ubicada en la zona sur del Gran Buenos Aires.

Descripción: Fil: Rosenstein, Ruth Estela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Objeto: El objetivo principal es la descripcióndel proceso de obtención de materiales filtrantes en formade placa a partir de polvos metálicos y como objetivosecundario la fabricación de un elemento de escriturade punta porosa. Introducción Histórica: El proceso de sinterizado era ya conocidoantes de Cristo, los egipcios habían obtenido objetosde hierro reduciendo su óxido y luego compactándolo porcalentamiento y golpeado. Más modernamente, el platino,en 1800 se obtenía por sinterizado, lo mismo el tungsteno. Pero recién en 1927 comienzan los métodos modernoscon una patente en EEUU. Teoría: Un buen filtro debe reunir las siguientescaracteristicas: 1) resistencia a la corrosión; 2) facilidad de limpieza; 3) retener un gran volumen de filtrado sin disminuir su capacidad; 4) alta permeabilidad 5) resistencia mecánica; 6) bajo costo de producción. Experimentalmente se sabe que los mejoresfiltros se obtienen con polvos de partícula esféricapor ello describiremos someramente las distintas maneras de agrupar esferas todas en contacto y del mismotamaño: Cada una de las orientaciones recuerdaa un sistema cristalino donde las esferas del polvo metálicoreemplazan a los átomos en el cristal dando lugara una conformación parecida de esferas en contactomecánico. Las distintas orientaciones o conformacionesson: Cúbica, Ortorrómbica, Tetragonal y Romboédrica y acada una de ellas corresponde la siguiente porosidad,respectivamente: 47,6 - 39,5 - 30,2 y 26,0 por ciento. La forma más estable es la romboédrica. Trabajo Realizado: Descripción del equipo utilizado: paradeterminar granulometría se usaron tamices convencionales. Para prensar fué utilizada una pequeña prensa del0 toneladas de fuerza le cual fué recalibrada. Se construyeron dos tipos de matrices para prensar pastillasen frio y en caliente de 20 y 10 mm de diámetro, respectivamente. La matriz de prensado en caliente requirió 1a construcción de un pequeño horno eléctrico reguladoautomáticamente con una termocupla y un termoreguladorelectromecánico. Para los tratamientos térmicos de laspastillas fué construido un horno de tubo de cuarzo conregulación automática de temperatura y posibilidad decircular por su interior un gas protector. La medicióndel caudal a través de los filtros se hizo con un dispositivo que permite medir la presión de entrada y evaluar el caudal de salida midiendo el tiempo que tardaen pasar un volumende líquido, conocido. Para conocerla presión a la cual el filtro se destruye, se diseñóy construyó un aparato parecido a las matrices de prensado el cual es comprimido en la misma prensa de sinterizado, el fluido de compresiónes una grasa mineral. Ensayos de Sinterizado: Se estudiaron tres materias primas deplaza, la No.1 polvo de latón obtenido por molido en molinode bolas, no sirvió pues la pastilla obtenida noera suficientemente porosa. La No.2 polvo de aluminioobtenido por soplado en estado líquido padecía del mismodefecto de la anterior. 1a muestra No.3 de polvo debronce obtenido por soplado en estado de fusión fué conla que realizamos todo el trabajo. Los ensayos de aglomeradoen frío para luego sinterizar en caliente no dieronresultado pues era imposible consegiir pastillascompactas a bajas presiones, las obtenidas a muy altasno eran, prácticamente, porosas. Decidimos prensar encaliente y si bien obtuvimos algún resultado la tecnicaera muy laboriosa y de elevado costo. Los ensayosde "fritage" es decir, de calentamiento en moldes de lospolvos sin prensar fueron los más promisorios. Despues de algunos ensayos usando gas natural o hidrógenocomo atmósfera protectora encontramos que el añadidode burbujeo de metanol al gas natural daba una excelenteatmósfera de sinterizado, esta idea se la consideróvaliosa y ha sido objeto de una patente nacional actualmente en trámite. Las condiciones óptimas de sinterizadopara las cuatro mallas de polvo utilizado 50, 70,100y 150 fueron: temperatura 800°C y tiempo de calentamientomedia hora. Consideramos satisfactorios los filtrosasí obtenidos y pasamos a medir sus propiedades: con losresultados de medir el caudal de agua que pasa altravés de los mismos en función de la presión de entradafueron confeccionadas curvas para cada malla. La medición de la resistencia a la rotura dió como resultadoaproximadamente de 60 a 70 kg/cm^2 de área filtrantey por milímetro de espesor. La observación al microscopiomostró con toda claridad el proceso de sinterizado,en las tres primeras fotomicrografías se detalla un tratamiento térmico excesivo con gran reducción del númerode poros, las fotos subsiguientes muestran filtros debuena calidad a distintos aumentos, una de las fotos, la No.1 muestra dos mallas de polvo sin tratar en 1a cualse puede apreciar 1a uniformidad y 1a esfericidad. En ladeterminación del tamaño de poro máximo se observa queel calculado teóricamente es 40% del diámetro de 1a partícula, contra el medido que es sólo de 15 a 25%. En la medición de 1a densidad aparentey el porcentaje de poros encontramos aproximadamente 35%de porosidad. Los ensayos para obtener un elemento deescritura de punta porosa al través de la cual pasaralatinta, dieron resultado negativo. Fueron ensayadosvarios tipos de puntas permeables con el siguiente resultado:al ser cargados con tinta suficientemente viscosacomo para que no goteara, la velocidad de escrituraresultaba extremadamente lenta.

Descripción: Se presenta una generalización del modelo de red neuronal de Little-Hopfield paramemorias asociativas que considera el caso de un continuo de unidades de procesamiento. El espacio de estados corresponde a un espacio euclideo de dimensión infinita. Se proponeuna dinámica que minimiza una funcional de energia que es una extensión natural del casodiscreto. Se analiza el caso en que la matriz de pesos sinápticos es definida mediante la reglade autocorrelación (regla de Hebb) con memorias ortogonales, incluyendo estabilidad de lasmemorias, tamaño de sus cuencas de atracción y estados espurios. También se considera elcaso en que las memorias no son ortogonales, demostrando que es posible imponer “resoluciónfinita” a las memorias almacenables con una limitación del tamaño minimo de las áreas o “patches” de actividad; también indicamos dos formas posibles de hacerlo. Finalmente, sediscute la generalización de la dinámica no deterministica con temperatura finita no nula,mostrando que el modelo continuo puede ser extendido al caso en que la ley de evolución noes deterministice, del mismo modo que el modelo discreto de Hopfield se extiende de manerade incluir los efectos de temperatura finita a través de la dinámica de Glauber.

Descripción: Las memorias resistivas están entre los principales candidatos a ser utilizadoscomo elementos en una nueva generación de memorias no volátiles. Esto se debe asu bajo consumo energético, una alta velocidad de lectura/escritura y a la posibilidadde lograr memorias de alta densidad compatibles con los procesos de la tecnología CMOS actual (por sus siglas en inglés: Complementary Metal–Oxide–Semiconductor). El funcionamiento de estas memorias se basa en la conmutación resistiva (CR), que consiste en el cambio controlado de la resistencia de una interfase metalóxidoa través de estímulos eléctricos. Si bien hasta el presente no se ha podidodeterminar con certeza el mecanismo físico que controla la CR, se piensa que estábasado en el movimiento de vacancias de oxígeno que formarían de manerareversible zonas de alta/baja conducción dentro del óxido. La presente tesis tiene como objetivo principal entender los mecanismosfísicos que gobiernan a la CR y poner en evidencia algunos de los aspectos esencialesque pueden contribuir a lograr dispositivos útiles desde el punto de vista tecnológico. Para ello se han realizado estudios de las características principales de la CRpara distintas interfases metal-óxido a distintas condiciones de temperatura. Se hanutilizado Au, Pt y Ag como metales y los siguientes óxidos complejos YBa2Cu3O7–δ (YBCO), La0.67Sr0.33MnO3 (LSMO) y La0.7Sr0.3CoO3 (LSCO). Se han elegido estos óxidoscomplejos debido a que presentan características similares, como ser materialesfuertemente correlacionados con una estructura cristalina tipo perovskita y una altamovilidad de oxígenos, lo que afecta muchas de sus propiedades físicas, ya quedependen fuertemente de la estequiometría. Nuestros resultados han demostrado la existencia de una CR bipolar en todosestos sistemas. Ésta es explicada satisfactoriamente a través de un modelo dedifusión de vacancias de oxígeno asistidas por campo eléctrico. Se han caracterizado las interfases como dispositivos de memoria, estudiandosus mecanismos de conducción, encontrándose una conducción dominada por unmecanismo del tipo Poole-Frenkel para la muestra de YBCO y una conducción del tipo SCLC para el LSCO y el LSMO. Adicionalmente, se ha conseguido una alta durabilidady repetitividad en el funcionamiento de estas junturas como dispositivos de memoria, gracias a la optimización en el protocolo utilizado para escribir/borrar, lográndosemás de 103 conmutaciones consecutivas sin fallas en dispositivos bulk. También se ha estudiado el efecto de la acumulación de pulsos idénticos enlas interfases obteniéndose una relación entre la amplitud de la CR y el número depulsos aplicado a amplitud y temperatura fijas. Luego de someter la interfase a ciclosde fatiga eléctrica, se ha encontrado una similitud entre la evolución de la resistenciaremanente en esta con la propagación de defectos en un metal sometido a pruebasde fatiga mecánica. Esta relación puede ser usada como base para generar unalgoritmo de corrección de errores y para mejorar la efectividad y el consumo deenergía de estos dispositivos de memoria. Finalmente, se han realizado estudios sobre la evolución temporal de cadaestado de resistencia. Hemos demostrado que sigue una ley exponencial estirada conun exponente cercano a 0.5 y un tiempo característico dado, que depende tanto dela temperatura como de la potencia utilizada. Estos resultados implican que laevolución temporal no está dominada por un proceso estándar de difusióntérmicamente activado. La difusión de vacancias de oxígeno ocurre en una superficiecon una densidad de trampas que depende de la temperatura, donde dicha superficiecorrespondería físicamente a los bordes de grano del óxido.

Descripción: Fil: Bianco, Ana María. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: En esta tesis se sintetizan por medio de un metaanálisis las principales causas que explican la distribución de la ocurrencia de floraciones de cianobacterias potencialmente tóxicas en la Argentina, un gran territorio con climas que van desde el tropical húmedo al templado frío. Se analizó en detalle la literatura académica publicada y la información disponible en informes técnicos desde 1945 hasta 2015; además se incorporaron datos de estudios no publicados. Las floraciones, definidas como eventos que superan las 5.000 células/ml, se registraron en lagunas, ríos, arroyos, embalses, estuarios y reservorios de agua. Se relacionaron la intensidad de la floración (abundancia máxima registrada para un sitio definido), las especies y las estrategias ecológicas (con dispersión homogéneas, formadoras de cúmulos y fijadoras de nitrógeno) responsables de cada evento con las características geográficas y climatológicas correspondientes a las localidades de los sitios de estudio, y con el tipo y el origen de los cuerpos de agua. Se registraron y georreferenciaron 122 sitios correspondientes a cuerpos de agua afectados por floraciones de cianobacterias planctónicas. La Puna y la región de la Patagonia Andina estuvieron libres de floraciones, con la excepción de una laguna en esta última área. Las lagunas y embalses de todas las eco-regiones fueron los sistemas acuáticos más propensos a experimentar floraciones (46% y 24%, respectivamente). No existen informes de floraciones en lagos; los ríos fueron principalmente afectados en los tramos con embalses (24 %) y los tramos ubicados debajo de las represas (15 %). El 74,5 % de las floraciones reportadas en Argentina excedieron el nivel 2 de alerta de la OMS para agua potable y aguas para baño (100.000 células / ml). Basados en el enfoque taxonómico polifacético de Komárek se identificaron 39 morfoespecies planctónicas potencialmente tóxicas responsables de las floraciones. Microcystis aeruginosa, Dolichospermum spiroides, Dolichospermum circinale, Raphidiopsis mediterranea y Cylindrospermopsis raciborskii se encontraron participando frecuentemente en las floraciones de especies mixtas o de una sola especie dominante. La distribución de especies difirió de acuerdo con la eco-región y el tipo de sistema acuático; las ecoestrategias están más fuertemente asociadas a estos factores. Por otra parte, las características limnológicas de los sistemas también parecieron estar relacionadas con la ecoestrategia de las especies formadoras de floraciones dominantes.

Descripción: Se investigó el metabolismo de fosfato en deficiencia de a-tocoferol. Los estudios fueron integrados por: I - Experiencias de distribución de 32P enel espacio de fosfato de conejo. II - Experiencias de intercambio de 32P en lasangre de conejo. III- Propiedades de las ATPasas de eritrocito de conejo. IV - Propiedades de alosterismo que presentan las ATPasas de eritrocito deratas alimentadas con distintas dietas. I) En deficiencia de a-tocoferol se encontró las siguientes alteracionesen la distribución del 32P en el espacio de fosfato: a) La velocidad do dilucióndel 32P en el plasma es más alta. b) Los tiempos medios de las fases de dilucióndel 32P son menores. c) Las constantes de dilución del 32P de las dosfases estan incrementadas. d) Los espacios relativos que integran el sistemaen el cual se realiza el proceso de dilución del 32P son iguales. e) El espaciode fosfato está incrementado. f) La retención de 32P por el espacio extraplasmáticose lleva a cabo más rápidamente, este aumento se interpreta como unincremento en la incorporación del 32P a Po. II) En deficiencia de a-tocoferol se hallaron las siguientes alteracionesen el intercambio de 32P en la sangre: a) La concentración del Pi esta incrementadaen el eritrocito. b) La entrada de 32P está aumentada en el eritrocito;a esta conclusión se arribó por medio de la utilización de la actividad específicamedia del plasma y la consideración del aumento de la concentracióndel Pi en el eritrocito. c) Entre 30 y 240 minutos la actividad específica de Pise mantiene anormalmente constante. d) Entre 30 y 240 minutos la actividadespecífica de Po aumenta a 100 %, en este caso, además de la interpretaciónbasada en el intercambio de fosfato, se postuló la alteración de determinadasenzimas en la glicólisis o el aumento de la velocidad de glicólisis por el incrementodel Pi. III) En estas experiencias se intentó relacionar alteraciones del metabolismode fosfato en el glóbulo rojo con las ATPasas. En deficiencia de a-tocoferolse describieron las siguientes propiedades: a) Las ATPasa basal y ATPasatotal tienen más alta actividad. b) La activación por Na+ y K+ de la ATPasa basalesta disminuída. c) No existen alteraciones en las enzimas solubles deleritrocito estudiadas, esto pone énfasis en que los daños en deficiencias estánlocalizados en las membranas. d) No se encontró influencia del tocoferolsobre las actividades de las ATPasas y no hay peroxidación "in vitro" en elghost o glóbulo rojo. e) El Km de la ATPasa basal es más bajo, esto concuerdacon el incremento de la actividad de esta enzima. f) El pH óptimo de la ATPasa basal es mas bajo. g) La inhibición de la ATPasa basal por p-cloro-mercuribenzoatoes igual, esto revela que los grupos SH involucrados en estainhibición no se encuentran alterados. IV) Por último se relacionó las alteraciones de las ATPasas en deficiencia,con cambios de las propiedades alostéricas de las ATPasas de glóbulosrojos de ratas. A estos efectos se presentaron algunos resultados que muestrandiferencias en el comportamiento alostérico de las ATPasas de eritrocitode ratas alimentadas con dieta básica suplementada con a-tocoferol y dietacomercial. Se sugirieron relaciones o paralelismos en las alteraciones entre las ATPasas de eritrocito en deficiencia y las ATPasas de eritrocito de rata, frentea la inhibición por F-.

Descripción: Se ha sugerido que algunos xenobioticos utilizados en losprocesos de quimioterapia podrian ejercer su efecto tóxico através de un aumento en la producción de especies deoxigeno activo. Los resultados obtenidos a traves de lasobservaciones realizadas sobre celulas de carcinoma de mamahumano (MCP-7) muestran que el efecto de las antraciclinas (adriamicina) en concentraciones de 19^-7 M durante 9 díasejercen claramente efectos citotoxicos sobre las celulastumorales, generando una situacion caracterizada por unaumento del 41% en el consumo de oxigeno, un aumento del 71% en los niveles intracelulares de peroxido de hidrógenoen el estado estacionario y un aumento del 91% en losniveles de produccion de sustancias reactivas con ácidotiobarbiturico (malondialdehido). Estas alteracionesmetabolicas tuvieron como consecuencia un aumento del 91% enla quimioluminiscencia y una serie de modificacionesbioestructurales en las celulas sometidas al estresoxidativo generado por la adriamicina. Algunas de lasalteraciones morfológicas observadas, además de unainhibición de la proliferación celular, fueron: a) unamarcada tumefacción de las células y sus organelas, lo cualse tradujo en un aumento del 50% del volumen celular; b) unamayor captación de colorantes y c) una marcada condensaciónde la cromatina. La presencia de adriamicina no tuvo ningúnefecto sobre los niveles de las enzimas antioxidantesmientras que la ausencia de suero indujo una disminución enlos niveles de la enzima qlutation peroxidasa dependiente deselenio (2±0.3 mU/mg de proteina), los cuales senormalizaron (3.8±0.4 mU/mg de proteína) por la adición de 10% de suero fetal bovino al medio de cultivo. El seleniopor otro lado mostró un efecto inhibitorio sobre laproliferación celular en concentraciones de 10-50 nM sobrelas células de carcinoma de mama. Los resultados obtenidoscontribuyen con la hipótesis de que las especies de oxigenoactivo generados durante el ciclo redox de la adriamicinason los responsables de gran parte de los efectoscitotóxicos debidos a esta droga. Las células de melanoma maligno cultivadas en monocapapresentan en la fase estacionaria del cultivo niveles demelanina (11.3±0.6 ug/10^6 células) mayores, comparados conlos niveles presentes en la fase exponencial del cultivo (4.2±0.3 ug/10^6 células). De las observaciones realizadassobre las células de melanoma humano con alto contenido demelanina podemos concluir que los niveles de peroxido dehidrógeno en el estado estacionario determinados porequilibrio difusional fueron menores (2.1±0.2 uM) encomparación con los obtenidos en el estado exponencial (3.3±0.2 uM) se encontró una relación similar en losvalores de quimioluminiscencia espontanea obtenidos durantela rase estacionaria (78±24 cps/10^6 células) y la faseexponencial (169±27 cps/10^6 células). La citotoxicidad delperóxido de hidrógeno generado extracelularmente por elsistema glucosa-glucosa oxidasa, determinado despues de 60min de exposicion, determinó valores de ICse encontradospara las cultivos en fase estacionaria y exponencial de 0.9y 2.4 mU/ml de glucosa oxidasa respectivamente. Estosresultados diferenciales entre las dos fases de cultivo seinterpretan como consecuencia de la mayor actividad decatalasa en los cultivos en fase estacionaria. Se realizaron una serie de observaciones in vitro sobre elefecto de preparaciones de melanina sintetica y tumoralobtenida apartir de tumores melanoticos, sobre diferentessistemas de lipoperoxidacion. Las observaciones realizadaspermiten concluir que la melanina puede actuar como eficazatrapador de radicales alquilo (R-) y peróxilo (ROO-)coninhibición de 90% y 80% en los procesos de lipoperoxidaciónespontaneos para la melanina sintética y tumoralrespectivamente. En los sistemas de lipoperoxidacióniniciados con hidroperóxido de ter-butilo las preparacionesde melanina sintética produjeron una disminucion de laproducción de sustancias reactivas con ácido tiobarbitúricodel 43%, mientras que las preparaciones de melanina tumoralno mostraron ningun tipo de efecto. Cuando se inició lalipoperoxidación con 2,2,azo,bis-amidinopropano, el cualgenera radicales por efecto de la temperatura, laspreparaciones de melanina sintética y tumoral produjeron unainhibición del proceso de lipoperoxidación de 73% y 84%respectivamente. Estos efectos sobre diferentes sistemas puedenexplicarse dada la capacidad de la melanina de reaccionarcon radicales del tipo RO- y ROO-, dando reacciones deadición-terminación y a la capacidad de quelar ionesmetálicos (Fe²+, Fe³+, Cu²+) catalizadores del proceso delipoperoxidación, metales impidiendo así la propagación dela cadena de reacción. La determinación de los niveles de las enzimasantioxidantes en la corteza adrenal de rata y en las celulasprovenientes de cultivos primarios de células de zonaglomerulosa de corteza adrenal de rata, permiten sugerir quelas condiciones de cultivo en presencia de 1 uM de ácidoascórbico no afectan los niveles de las enzimas superóxidodismutasa y catalasa, pero sí afectan los niveles de laenzima glutation peroxidasa y que el cultivo en ausencia desuero, así como la adición de selenio son capaces demodular los niveles de esta enzima, sin tener ningún efectosobre la superóxido dismutasa y la catalasa.

Descripción: Fil: Egidy, Giorgia Anna Rosa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Apartir de los resultados obtenidos en nuestro laboratorio sobre la modulación dela motilidad de los epimastigotes de Trypanosoma cruzi a través de los distintosefectores de la ruta metabólica del óxido nítrico, se planteó la necesidad de estudiaren forma más amplia el metabolismo del sustrato de la óxido nítrico sintasa, la L-arginina. Inicialmente se describió el transporte de este aminoácido en epimastigotes de T.cruzi en fase logaritmica de crecimiento. Se determinaron los parámetros cinéticos ysus características bioquímicas, siendo algunas de las más relevantes, las que sedetallan a continuación: - El transportador presenta una alta afinidad por el sustrato (Km = 4.16 μM) encomparación con otros sistemas similares. - Es sumamente específico ya que no se inhibe competitivamente en presencia deaminoácidos naturales como así tampoco por análogos estructurales de la arginina. Sólo se observó una disminución significativa en la incorporación de L-arginina enpresencia de homoarginina, canavanina y D-arginina. - Es saturable por sustrato, independiente de Na+,pero dependiente de ATP. - Es afectado en forma específica por el tiempo de "ayuno"de L-arginina. Cuando se estudió el destino de la arginina incorporada a las células en 30 minutos,se observó que el 4.3% se incorpora a proteínas, el 68.6% queda formando partedel conjunto de aminoácidos libres y un 27.1% se identificó como fosfoarginina. La presencia de fosfoarginina como fosfágeno involucrado en la regeneración del ATP,hidrolizado principalmente en el flagelo del parásito, explica probablementela necesidad de un transportador específico de las caracteristicas descriptas. La relevancia de esta actividad biológica como posible blanco terapéuticotripanosomicida está dada por ser éste un sistema diferencial entre el parásito y elhospedador humano, quien carece de esta enzima pues utiliza la creatina comofosfágeno. Estas evidencias nos llevaron a centrar el interés del trabajo en el sistematransportador de arginina y la enzima arginina kinasa. En la segunda parte del trabajo se caracterizó bioquímicamente la enzima argininakinasa. Se midió la actividad enzimática tanto in vivo como In vitro, se determinó sulocalización subcelular y sus parámetros cinéticos (Km para arginina, 0.33 mM ypara ATP 0.31 mM). Se purificó parcialmente la actividad arginina kinasa en dospasos cromatográficos, uno de intercambio iónico y el segundo de filtraciónmolecular. También se estudiaron sus requerimientos de ATP y cationes bivalentes. Se ensayaron in vitro inhibidores potenciales de la enzima, siendo los másrelevantes,el análogo natural canavanina, la homoarginina y la histidina. Se analizó también la presencia de la arginina kinasa en otros organismos,encontrándose dicha actividaden otras cepas y especies del género Trypanosomay también en los denominados “trypanosomátidos inferiores" como Herpetomonas y Leptomonas. Finalmente se clonó el gen que codifica para la arginina kinasa de T. cruzi utilizandotécnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)y rastreo en bibliotecasgenómicas. El gen de 1074 pb codifica para una proteína de 357 aminoácidos y unpeso molecular de 40 kDa (GenBank # AF070451),el cual probablemente seencuentre como copia única dentro del genoma. El análisis de la secuencia obtenida demuestra un alto grado de conservaciónevolutiva. El gen completo de la enzima se expresó en un sistema heterólogo (Escherichia coll) demostrándose actividad arginina kinasa de la proteínarecombinante.

Descripción: Trypanosoma cruzi es el agente causal del “Mal de Chagas”, enfermedadendémica en América Latina. Este parásito unicelular, al igual que otros parásitos tripanosomátidos,presenta un complejo ciclo de vida a través de diferentes hospedadores (insectovector - hospedador vertebrado). A lo largo de su ciclo el parásito pasa por distintosestadios celulares, sufriendo profundos cambios morfológicos, fisiológicos ybioquímicos que le permiten adaptarse a los distintos ambientes. Uno de losestadios, el epimastigote, no es infectivo para el hospedador vertebrado y presentauna capacidad proliferativa que permite su cultivo en el laboratorio sin mayoresdificultades. Trypanosoma cruzi presenta numerosas características metabólicas que lodiferencian de otros organismos incluso del mismo orden. Describir estasdiferencias permitiría conocer más detalladamente al parásito aportando datos deutilidad taxonómica y evolutiva y contribuiría al posible desarrollo de tratamientosquimioterapéuticos más específicos y eficientes que los disponibles hasta elpresente. Un punto clave en el metabolismo de los tripanosomátidos está asociado alas poliaminas. Estos policationes alifáticos (putrescina, esperrnidina yespermina) están presentes en la mayoría de los organismos, tanto procariotascomo eucariotas, cumpliendo funciones celulares esenciales tales como asistir lasíntesis de ácidos nucleicos y proteínas, estabilizar macromoléculas y estructurascelulares y participar en la proliferación y diferenciación celular. La biosíntesis de poliaminas comienza por la conversión de ornitina enputrescina por acción de la ornitina decarboxilasa (ODC). Esta enzima esfundamental en la regulación de la síntesis de poliaminas y su actividad estarigurosamente controlada a distintos niveles. Además, se ha descripto un inhibidorespecífico e irreversible, difluorometilornitina (DFMO), que ha facilitado el estudiode dicha enzima. Una vía alternativa de síntesis de putrescina actúa a través de la argininadecarboxilasa (ADC) cuyo sustrato es el aminoácido arginina. Esta enzima fueinicialmente descripta en plantas y bacterias y recientemente ha sido encontrada enciertos tejidos de mamíferos. En parásitos protozoarios existen controversias con respecto a la existenciade las enzimas que catalizan el primer paso de la síntesis de poliaminas,especialmente la ADC. La discutida carencia de dichas actividades es suplida porun transporte activo constitutivo de poliaminas desde el medio extracelular. A lo largo de este trabajo confirmamos que los epimastigotes de distintascepas de T. cruzi son auxótrofas para poliaminas. Esta auxotrofia esta ocasionadapor la falta de la actividad enzimática de ODC y de ADC que, a su vez, se da por laausencia de los genes correspondientes. Además, se transfectaron epimastigotes de T. cruzi con un vector deexpresión recombinado con el gen de ODC de Crithidia fasciculata (clonado en estelaboratorio). De este modo, caracterizamos al cultivo transfectado con el genheterólogo de ODC a nivel fisiológico (capacidad proliferativa), bioquímico (síntesisy concentración intracelular de poliaminas y caracterización de la actividadenzimática heteróloga) y molecular (ubicación del gen heterólogo, determinacióndel número de copias, etc.). El cultivo transfectado se volvió autótrofo para poliaminas y sensible alinhibidor de la ODC, el DFMO. Sin embargo, luego de un cierto tiempo de cultivo enpresencia del inhibidor se seleccionó una subpoblación resistente a DFMO. Este cultivo también fue caracterizado comparándolo con los cultivossensibles. Finalmente, el parásito transfectado con el gen heterólogo de ODC contribuyócon los estudios sobre el metabolismo de las poliaminas en T. cruzí y podría ser útilen futuras investigaciones acerca de la relación poliaminas - diferenciación atripomastigote (metaciclogénesis) y poliaminas - infectividad en células demamíferos.

Descripción: Las especies del género Lotus (Fabaceae) se encuentran dentro de las leguminosas forrajeras más cultivadas mundialmente, luego de Medicago spp. y Trifolium spp. Su alto valor nutricional y su capacidad para adaptarse a diferentes condiciones ambientales han favorecido su utilización en sistemas ganaderos ubicados en áreas marginales para la agricultura. Sin embargo, la producción de materia seca y capacidad de rebrote de Lotus spp., al igual que lo observado en otras leguminosas forrajeras, se ven drásticamente reducidas durante las estaciones frías. Con el objetivo de estudiar el efecto del estrés por bajas temperaturas en el género Lotus, se evaluó la respuesta bioquímica, transcripcional y fisiológica de diferentes ecotipos de la especie modelo L. japonicus cultivados bajo estas condiciones de estrés. En particular, estos estudios fueron profundizados en los ecotipos MG-1 y MG-20, seleccionados por su respuesta contrastante durante la germinación en frio. Metabólicamente se observó una alteración en el contenido de poliaminas en las plantas tratadas, siendo los niveles de putrescina más elevados en el ecotipo tolerante (MG-20) en comparación con el ecotipo sensible (MG-1). Se realizaron estudios mediante el agregado exógeno de la diamina putrescina en L. japonicus MG-1, y también se evaluó la respuesta de la línea transgénica pRD29A:oatADC (acumuladora de putrescina bajo condiciones de estrés) de L. tenuis en estrés por frío. Mediante estos ensayos, si bien no se logró determinar el rol de la putrescina en los mecanismos de respuesta a las bajas temperaturas de Lotus spp., se observó que el nivel de este metabolito podría utilizarse como indicador de tolerancia bajo estas condiciones en L. japonicus. A nivel transcripcional, se clasificaron 1.077 genes diferencialmente expresados al comparar plantas cultivadas bajo condiciones óptimas con respecto a plantas tratadas. Este perfil transcriptómico permitió identificar diferentes vías metabólicas involucradas en la aclimatación al frío, que fueron evaluadas en la respuesta de los ecotipos MG-1 y MG-20 de L. japonicus. Los resultados obtenidos evidenciaron una alteración en la relación NADPH/NADP+, sugiriendo un desbalance redox inducido por el frío. A su vez, se determinóla actividad de diferentes enzimas antioxidantes, observándose contrastes entre ecotipos y tratamientos para la superóxido dismutasa, en particular, en la isoforma cloroplástica. A nivel fisiológico, el estrés por frío provocó fotoinhibición en ambos ecotipos, sin embargo las plantas MG-1 se vieron más afectadas que las MG-20. Nuestros resultados sugieren que los niveles de la proteína D2 del fotosistema II (PSII) estarían involucrados en este proceso. Por último, con el objetivo de profundizar en el estudio de la fotoinhibición en L. japonicus sometido a estrés por frío, se realizó un estudio del perfil de proteínas cloroplásticas en MG-1 y MG-20. Los cambios observados en sus abundancias relativas confirman una respuesta de aclimatación diferente entre ambos ecotipos. El presente trabajo de tesis permitió identificar distintos mecanismos implicados en la aclimatación al frío en L. japonicus, en los cuáles la respuesta de los cloroplastos se encontraría fuertemente vinculada. Nuestros resultados abren la posibilidad de futuros estudios y aplicaciones en otras especies de Lotus utilizadas actualmente como forrajes.

Descripción: 1) La levadura Saccharomyces Cerevisiae incorpora al formato-C^14. El agregado de un segundo sustrato aumenta la radioactividad fijada; el más efectivo es la glucosa, y le siguen en orden el acetaldehído, ácido pirúvico y ácido acético. En la fracción metanólica la sustancia más radicactiva es la serina (40-70%), salvo en la incubación con formato-C^14 sólo. Se marcan también las bases púricas de los ácidos nucleicos y las proteínas; en el hidrolizado de estas últimas, la serina contiene el mayor porcentaje del C^14 incorporado. El formato C^14 se oxida en parte a C^14O2, mucho más en ausencia de otro sustrato. 2) La incorporación del formato-C^14 medida por el C^14 fijado depende de la concentración y actividad específica del mismo; una mayor concentración la favorece, y se traduce en un aumento de la radioactividad en los metabolitos solubles en metanol y en los ácidos nucleicos. 3) Las cinéticas realizadas con células de levadura en reposo y proliferativas, con y sin el agregado de otro sustrato, demuestran que la incorporación de formato aumenta con el tiempo de incubación. La distribución del C^14 en las distintas fracciones a lo largo del tiempo cambia. Inicialmente el mayor porcentaje corresponde a las sustancias solubles en metanol, el que va disminuyendo a medida que aumenta la incorporación de C^14 en los ácidos nucleicos y en las proteínas, en las que se acumula. 4) En iguales condiciones, la levadura fija más formato-C^14 que carbonato-C^14. Con el primero la sustancia soluble en metanol más marcada es la serina, que no aparece en cambio con el segundo. En presencia de glucosa la serina mantiene el porcentaje de radioactividad incorporada a la fracción soluble en metanol. En ausencia de ésta, desciende al mismo tiempo que aumenta en el ácido glutámico. El bicarbonato-C^14, asimismo, no marca los ácidos nucleicos ni las proteínas. 5) Durante la incorporación de formato el carbono β de la serina concentra la casi totalidad del C^14. Con el tiempo se marca tambien el α. La serina sería el primer compuesto de condensación del formato-C^14 dentro de la célula producido por formilación de la glicina. 6) Ka seruba-3C^14 es incorporada en mayor proporción que el formato-C^14, y se traduce en una mayor radioactividad en todas las fracciones. En presencia de glucosa y seruba-3C^14, la incorporación de C^14 a la serina, que es inicialmente el metabolito soluble en metanol más marcado, desciende para dar lugar a un aumento en el porcentaje de C^14 en el ácido glutámico. 7) La presencia de glucosa acentúa el efecto de inhibidores enzimáticos y antibióticos sobre la incorporación del formato-C^14 por la levadura. La azida, el fluoruro y la hidroxilamina producen disminución en la fijación de C^14. La azida y el fluoruro afectan notablemente la incorporación a proteínas. El dinitrofenol y la antimicina afectan tanto a las proteínas como a los ácidos nucleicos. El actidione inhibe totalmente la incorporación a las proteínas.

Descripción: La Terapia Fotodinámica del cáncer (TFD) es un tratamiento que se basa en la acumulación selectiva de un fotosensibilizante en las células tumorales. Este, luego de ser excitado por acción de la luz roja, desencadena una serie de reacciones mediadas por radicales libres, que finalmente destruyen el tejido. El empleo del ácido 5-aminolevúlico (ALA) como precursor de la síntesis de porfirinas, ha cobrado especial interés en los últimos años tanto en la TFD usando las porfirinas como fotosensibilizantes, como en la fotodetección de tumores, empleando la propiedad de estos pigmentos de fluorescer con la luz UV. Por otra parte, se ha observado que algunos tejidos neoplásicos acumulan porfirinas, por lo cual se ha postulado que el camino biosintético de los tetrapirroles se encuentra alterado en los pacientes con neoplasias. En el presente trabajo se caracterizaron las actividades de algunas de las enzimas del camino biosintético del hemo en un adenocarcinoma mamario de ratón y en el hígado de los animales portadores de dicha neoplasia. Se estudió la biosíntesis de porfirinas in vitro a partir de ALA en tumor y otros tejidos, empleando para ello la técnica de explantes tisulares, y se encontró que la acumulación de porfirinas se hace más selectiva para el tumor cuando el precursor se administra encapsulado en liposomas o cuando se agrega cinc en el medio de incubación. Se desarrolló un modelo in vitro-in vivo para estudiar la efectividad de la acción fotodinámica de las porfirinas sintetizadas endógenamente a partir de ALA, en el cual se monitorea el crecimiento de los tumores irradiados, luego de su reimplantación en animales receptores. Se encontró que los explantes incubados 2 hs con ALA, y que por lo tanto sintetizaron 4,6 (g de porfirinas/g tej., al ser irradiados sufrieron una reducción desde un 60% de la masa tumoral, hasta la falta completa de crecimiento del tumor en el ratón receptor. Además se observó una correlación entre el nivel de porfirinas acumuladas y el daño celular. El mismo modelo fue utilizado para investigar la efectividad del daño fotodinámico inducido por ALA en combinación con los antineoplásicos 5-Fluorouracilo, Ciclofosfamida y Doxorubicina.. Se encontró un aumento en la eficacia de la TFD, cuando se emplearon Ciclofosfamida y Doxorubicina; no así cuando se usó 5-Fluorouracilo. Con nuestro modelo in vitro-in vivo se ha demostrado que ocurre una importante y hasta una completa destrucción de las células tumorales mediante la combinación de la síntesis endógena de porfirinas a partir de ALA y un tratamiento lumínico de baja potencia. Los resultados presentados en este trabajo indican que el empleo del ALA en la detección temprana de las células alignas y en la TFD es sumamente prometedor. Nuestros hallazgos plantean también la posibilidad del uso combinado de antineoplásicos con la TFD inducida por ALA.

Descripción: La levadura Saccharomyces cerevisiae puede utilizar una gran variedad de compuestos como fuente de nitrógeno. En presencia de fuentes ricas de nitrógeno los genes de las vías de utilización de las fuentes pobres no se expresan. Dicho mecanismo es conocido como Nitrogen Catabolite Repression (NCR). Últimamente se han obtenido evidencias de que también hay una jerarquía dentro del uso de las fuentes pobres. El factor de transcripción Dal81 participa en la regulación de genes involucrados en varias vías de utilización de fuentes pobres de nitrógeno. Para activar la transcripción dependiente del factor Dal81 de cada gen (o grupo de genes), también es necesaria la participación de otro factor (específico de inductor) que sería el responsable de la especificidad de la respuesta. Así, para el catabolismo de fuentes pobres de nitrógeno, como alantoína y leucina, son necesarios el factor de transcripción pleiotrópico Dal81 y otro factor específico de cada fuente (Dal82 y Stp1/Stp2) para que se produzca la activación transcripcional de los genes que codifican para permeasas tales como Dur3, Agp1, Bap2 y Bap3. Por otra parte, para que ocurra la inducción de los genes de la utilización del GABA en respuesta a este compuesto, Dal81 actúa en conjunto con el factor de transcripción específico Uga3. La existencia de un factor de transcripción compartido entre estas vías inducibles, podría permitir una activación jerarquizada de las mismas y la regulación de otros procesos biológicos sincrónicos, cuando varias de las fuentes de nitrógeno antes mencionadas se encuentran disponibles simultáneamente. El objetivo general de este trabajo fue estudiar los mecanismos moleculares a través de los cuales se determina la regulación coordinada de genes involucrados en el uso de fuentes de nitrógeno pobres. En este trabajo, demostramos que Uga3, conocido hasta ahora como un factor específico de la vía del GABA, regula al gen BAP2, responsable de la incorporación de aminoácidos ramificados a las células. Encontramos también que Uga3, además de afectar la utilización de GABA y leucina, promueve la tolerancia a estrés térmico y oxidativo. Además, mediante co-inmunoprecipitación de diferentes factores de transcripción, encontramos que Dal81 se encuentra unido al factor de transcripción Uga3 aún en ausencia de GABA y de manera independiente de la secuencia UASGABA de los genes UGA. Por otra parte, también detectamos una interacción independiente de inductor entre Leu3 y Uga3. Mediante el análisis global del proteoma de células deficientes en UGA3, identificamos 17 proteínas sobre-representadas en esta mutante, mientras que otras 50 se encuentran sub-representadas. A través de análisis in sílico de las 67 proteínas expresadas diferencialmente, encontramos que 8 de ellas participan del metabolismo de fuentes pobres de nitrógeno o son permeasas de aminoácidos. Demostramos que Arg5,6, está regulado por Uga3 a nivel de su transcripción, y que la represión por arginina de este gen depende de Uga3. Sin embargo, no detectamos interacción entre Uga3 y la región regulatoria de ARG5,6. Por último, demostramos que la ausencia de Uga3, así como también la de Dal81, también produce cambios significativos en el contenido de varios aminoácidos. Encontramos correlaciones entre estas modificaciones y la expresión diferencial de proteínas asociadas al metabolismo de fuentes de nitrógeno y permeasas. La mutante uga3 tiene un alto contenido de arginina intracelular. Se sabe que la acumulación intracelular de arginina promueve la tolerancia a estrés por etanol, por lo que podría relacionarse al menos parcialmente, con los efectos de tolerancia a estrés observados. Sin embargo, en nuestras condiciones de trabajo, no encontramos cambios significativos en la tolerancia a etanol entre esta mutante y la cepa wild type [fórmula aproximada, revisar la misma en el original].

Descripción: La primera parte de este trabajo de tesis es de caracter bibliográfico yconsiste en una puesta al día acerca de los estudios realizados sobreporfobilinógeno (PGB) y porfiria experimental, desde las primeras observaciones de Sachs, hasta los trabajos de los grupos de Watson; Aldrich de Labbe; Rimington; Bénard, Gajdos & Gajdos-Torok y otros laboratorios en el período que va desde 1931 hasta los primeros meses de 1960 (1 al 74).- En la segunda parte del segundo trabajo, se ha realizado un estudio experimental exhaustivo de la metodología relacionada con el PBG. Se ha adaptado el método de aislamiento de PBG de orina porfirica descripto por Cookson & Rimington (24), así como distintas técnicas de identificación y valoración cuantitativa de PBG (forma cristalina, cromatografía en papel, determinaciones espectrofotométricas y comportamiento frente a resinas de intercambio iónico). Se determinaron coeficientes de extinción molar específica con distintos reactivos de Ehrlich y con material cristalino aislado de orina porfírica;los valores obtenidos coínciden con los de la literatura (27 y 28). Se han estudiado las condiciones óptimas de absorción, elución y recuperaciónde soluciones puras de PBG, o mezclado previamente , con orinas normales y porfíricas; en columnas de resina de intercambio Dowex 2, empleadas en latécnica de Mauserall & Granick (28). Se ha encontrado como dato interesante que, aún con cantidades del orden de 1 mg de PBG absorbido en la columna, no se llega al punto de saturación, trabajando las condiciones descriptas por los autores arriba citados. En la tercera parte se han realizado estudios relativos al dosaje cuantitativo de ácido delta amino leválico (δAL), PBG y porfirinas en orina de ratas y conejos sometidos a la porfiria experimental, mediante el suministro de alil isopropil acetamida (AIA) o Sedormid (Alil isopropil acetil carbamida) y en orina de una paciente afectada de porfiria aguda. Para tal fin se han aplicado técnicas descriptas por Mauzeral & Dranick (28), Schwartz, Zieve & Watson (75)y otros autores (76, 77, 78). Además se ha efectuado una identificación de los distintos tipos de porfirinasurinarias que se excretan en porfiria experimental y aguda, aplicando técnicas cromatográficas en columna y papel descriptas por Watson, Falk & Benson y otros autores con algunas modificaciones introducidas en nuestro laboratorio (37, 78, 79, 80, 81 y 82). En estos estudios se han obtenido los siguientes resultados: 1°: Tanto en las ratas como en los conejos llama la atención la gran desproporción en los aumentos de δAL y PBG, con respecto a los uro- y coproporfirina, aunque la excreción de δ AL en los conejos estuvo por debajo de la de las ratas. Además en los primeros se notó una mayor excreción de uroporfirinas que en las segundas. 2°: El cuadro químico ofrecido por la administación de AIA en ambas especies de animales, resultó prácticamente similar al producido por Sedormid. 3°: La medición comparativa de PBG por el método de Vahquist (6), con la técnica de las recisas descriptas por Mauserall & Granick (28), ha demostrado que los resultados obtenidos por el método directo pueden dar errores por exceso hasta de un 100%. Además conviene hacer notar que los estudios realizados en la fracción "uroporfirina" fueron hechos en orina sin precalentar, a diferencia de los efectuados por otros autores. Los resultados obtenidos son coincidentes con los comunicados por Abbet y Rudolph (94) en 1961 y discrepan con los de Stich (73) que sugiere una diferencia entre la porfiria aguda humana y la porfiria experimental, basada en los distintos niveles de excreción de δAL. Con respecto al tipo de las distintas porfirinas encontradas en la orina, tanto porcedentes de porfiria experimental como del caso humano se ha demostrado que la mayor parte de la uro-y coproporfirinas de 7, 6 y 5 carboxilos. La de siete carboxilos fue identificada como firiaporfirina III (37) cuyo porfirinógeno se considera precursor metabólico de la protoporfirina IX según Batlde & Grinstein (95) Todo este conjunto de resultados pueden ser interpretados mediante una hipótesis que considera la biósintesis exagerada de δAL, como responsable de la mayor producción de compuestos pirrólicos observada en la porfirina aguda. La acumulación de δAL favorecería una mayor formación de PBG, através de unmecanismo de la actividad enzimática; en este caso sobre la dehidrasa del δAL. Esto se realizaria por un mecanismo similar al que se distingue como "feed back"positivo (Davidson, 1960) (107). Los aumentos registrados en la escreción de porfirinas podrían de acuerdo con los resultados de Gibson (1955) (96), que encuentran una mayor actividad de la dehidrasa de δAL en hígado de conejo tratado con Sedormid, y de Scott (1955) (97), que constata que en porfirias agudas humanas la transformación de δAL en PBG es más rápida. Las variaciones que se pueden observar en uro. y coproporfirinas pueden deberse a diferencias de actividad de las enzimas que regulan su aparición o a diferentes niveles de su velocidad de excreción. En una rata porfirica a la que se le suministro glicocola, ácido sucéinico y algunos cofactores, entre los que se encontraba ATP, se hallo una disminución en la eliminación de porfirinas y precursores. Este hecho no tiene una explicación muy clara pero como los últimos tiempos se ha encontrado AMP (Bénard, Gajdos-TOROK & Gallistin) (98) y la inosina (Lottafeldt, Labbe & Aldrich) (99) producen un descenso en los niveles de excreción de porfirina y precursores; esta disminución podria explicarse como un efecto del ATP. En la cuarta parte de este trabajo se han efectuado determinaciones de actividad enzimática de cítrico deshidrogenasa, málico deshidrogenasa, glutámatico deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa en polvos acetónicos de hígado de ratas y plasma de conejos normales y sometidos a la porfiria experimental, no encontrándose alteraciones significativas de las mismas (85 al 93). Esto aparentemente excluiría la posibilidad de que una formación anormal de succinil CoA fuera la responsable de la biosisntesis exagerada de δAL y PBG. Por otra parte como conclusión general, se confirma una vez más la similitud de la porfiria experimental con la porfiria aguda humana, como ya fuera señalado en anteriores trabajos.- Finalmente, en el apéndice, se hace una puesta al día de las últimas investigaciones en el campo de la porfiria experimental en los últimos dos años (98 al 106)

Descripción: Fil: Stoppani, Andrés Oscar Manuel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: El ácido delta amino levúlico (ALA) es un precursor metabólico, intermediario natural en la biosíntesis de porfirinas. En este trabajo de tesis se analizan detalladamente los antecedentes metabólicos de la biosíntesis del ALA a partir de los trabajos de Shemin y Rittenberg en 1945 con glicina marcada N^15, mencionando las experiencias principales mediante las cuales se conocieron los primeros pasos metabólicos de la biosíntesis de porfirinas, hasta que Shamin y Russell en 1953 demuestran que el ALA es un paso obligado en el camino de la biosíntesis de estos compuestos tetrapirrólicos. Se analiza también el curso metabólico del ALA vía porfobilinógeno (PBG), como así también su posible conversión en purinas a través del denominado ciclo glicina-succinato de Shemin. La biosíntesis del ALA se realiza a partir de glicina y succinil Co A, o de glicina y ácido succínico con la presencia de diferentes factores necesarios para el proceso como ser fosfato de pyridoxal, Mg^++, Co A, oxígeno, etc. El mecanismo por el cual se realiza este proceso, también es comentado en este trabajo. La enzima encargada de llevar a cabo esta reacción es la ácido delta amino levúlico sintetasa (ALAS) y se encuentra presente en la fracción mitocondrial de los eritrocitos y de otras células, como así tambien en la fracción sobrenadante de centrifugar a 100.000 x g las partículsubcelulares de las bacterias fotosintéticas Rhodopseudomonas spheraides. Se hace mención a algunos metabolitos activadores e inhibidores de esta enzima. La ácido delta amino levúlico dehidrasa (ALAD), es la enzima responsable de la conversión del ALA en PBG; es una enzima sulfhídrica típica y parece realizar los dos pasos necesarios para la unión de dos moléculas de ALA. El ciclo succinato-glicina es otro cacmino metabólico del ALA; dirigido por la ácido delta amino levúlico transaminasa (ALAT) enzima ésta que parece ser limitante de la síntesis de hemo, y que está presente en las células de los tejidos con altas velocidades de metabolismo de ácidos nucleicos, como los eritroblastos de la médula ósea. En 1952 comienzan a publicarse los primeros trabajos sobre porfiria experimental en los Estados Unidos, bajo la dirección de Watson. Desde entonces, distintos grupos de investigadores han encarado el estudio de este tópico desde enfoques diferentes, que son comentados en este trabajo. Con el acopio de ideas que estos grupos de investigación exponen hasta 1960, en la Cátedra de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales se plantea un trabajo sobre porfiria experimental, para estudiar en detalle el cuadro químico correspondiente a las porfirinas y precursores. Utilizando métodos más exactos y específicos que en los trabajos anteriores, se estudia la excreción urinaria de ALA (por primera vez hasta entoncesen porfiria experimental), PBG y porfirinas en animales sometidos a la porfiria experimental. También se encara el estudio comparativo de la incorporación de glicocola 2-C^14 en proteínas de homogenatos de hígados normales y porfíricos, basándonos en observaciones de Schwartz y colaboradores sobre la disminución de la catalasa hepática en animales porfíricos. Se realiza el estudio experimental de los métodos de valoración del ALA. Se estudia exhaustivamente el método de las resinas de intercambio iónico que permite separar PBG y ALA de orina, pasando ésta simultáneamente por una resina aniónica Dowex 2 que retiene el PBG y una catiónica fuerte, Dowex 50 que retiene el ALA. Este es eluído de la resina y convertido en el compuesto 2 metil-3 acetil-4 (3 ácido propiónico) pirrol mediante una síntesis de Knorr con acetil acetona a pH 4,6. Este derivado pirrólico se reconoce luego colorimétricamente mediante el reactivo de Ehrlich con para dimetil amino benzaldehido (DMAB) en medio fuertemente ácido. Se ensayan distintos tipos de reactivos de Ehrlich, adoptandose el llamado reactivo de Ehrlich modificado con DMAB y ácido perclórico (2N) en medio acético glacial. La reacción de Ehrlich se produce con todos los derivados pirrólicos con una posición alfa libre, y se comenta su mecanismo y los distintos factores que influyen para lograr condiciones óptimas de reacción. Se determina la curva de absorción para el compuesto coloreado resultante de la reacción de Ehrlich con el 2 metil-3 acetil-4 (3 ácido propiónico) pirrol y se calcula su coeficiente de extinción molar. Se estudian las características y preparación de las resinas especialmente de Dowex 50, determinándose las curvas de saturación y de elución del ALA frente a esta resina. Se realizan ensayos de recuperación de ALA de soluciones standard de concentración conocida y de orinas normales y porfíricas. De soluciones standard se recupera alrededor del 90% y de orinas humanas y de conejos porfíricos alrededor del 80% y 90% respectivamente. El ALA puede ser valorado también mediante una reacción con pricato alcalino, con el que forma un compuesto coloreado hasta hoy desconocido. Se estudia el método original debido a Shuster, y las posteriores modificaciones introducidas por otros autores, determinándose el coeficiente de extinción molar para el compuesto resultante de una de las modificaciones al método. El ALA fue identificado por dos métodos diferentes de cromatografía sobre papel. Las experiencias de porfiria experimental fueron realizadas sobre ratas Wistar machos, de un peso aproximado a los 400 g y sobre conejos de ambos sexos cuyo peso oscilaba entre los 1700 y 2700 g. Los animales fueron drogados diariamente por vía intragástrica o parenteral según se describe, con Sedormid (alil isopropil acetil carbamida) o con ALA (alil isopropil acetamida). Mediante el suministro de estas drogas de indujo a los animales un estado que mimetiza a la porfiria aguda. Se describen los métodos de identificación y dosaje de porfirinas, como la purificación de las mismas por cromatografía de adsorción sobre carbonato de calcio de sus ésteres metílicos. Se emplean métodos de cromatografía sobre papel de ésteres metílicos de porfirinas y de porfirinas libres, previa hidrólisis y descarboxilación de los primeros. Se aislan profirinas de algunos órganos de estos animales. Se encara también, como ya se mencionó el estudio comparativo de la incorporación de glicina -2-C^14 en las proteínas de hígados normales y porfíricos, con el objeto de determinar si la disminución de la catalasa hepática es debida o no a una síntesis disminuida de las proteínas totales del hígado en los casos de porfiria experimental. De los estudios relacionados con la porfiria experimental puede inferirse los siguiente: a) Las ratas porfíricas registran una excreción urinaria ALA grandemente incrementada con respecto a las uro- y coproporfirinas. Los conejos porfíricos, en cambio, presentan un gran ALA, y cantidades significativas de uroporfirina. b) El cuadro químico presentado por ambas especies de animales en el mismo, ya sea que hayan sido tratados con A.I.A o Sedormid. Los resultados obtenidos coinciden con los de otros autores. La mayor parte de las uro- y coproporfirinas excretadas son del tipo isomérico III y también se han encontrado cantidades proporcionales de porfirinas hepta, hexa y pentacarboxílicas. La totalidad de la fracción heptacarboxílica está formada por firiaporfirina III. Con estos resultados podría explicarse la elevada producción de compuestos pirrólicos producidos en la porfiria experimental, postulando una hipótesis que considera la biosíntesis exagerada de ALA como responsable de la mayor producción de pirroles. La acumulación de ALA, por un mecanismo de "Feed back" positivo originaría un incremento en la biosíntesis de PBG Y PORFIRINAS. De los estudios relacionados con la biosíntesis de proteínas marcadas en animales normales y porfíricos no se puede sacar mayores conclusiones, pues presentan resultados algo inciertos. Ello podría deberse a la existencia de un pool diferente de glicina en los homogenatos individuales de cada experiencia. Esta glicina podría preexistir o sintetizarse durante la experiencia. En definitiva, se concluye que existe gran similitud entre la porfiria experimental y la porfiria aguda humana y que el principal error metabólico se debe a una biosíntesis exagerada de precursores. Aclaración- La mayor parte de estas experiencias fueron realizadas en colaboración con el Dr Horacio Tigier y figuran en parte en su trabajo de tesis titulado "Metabolismo del porfobilinógeno".

Descripción: En este trabajo, se han caracterizado distintos aspectos del metabolismo de poliaminas en el parásito tripanosomátido Crithidia fasciculata, poniendo especial énfasis en la enzima ornitina decarboxilasa (ODC), que cataliza el primer paso en la síntesis de estas sustancias. El transporte de poliaminas al interior del parásito es muy bajo, y solo se ve aumentado cuando se expone a los cultivos a un inhibidor de la ODC, como es el difluorometilornitina (DFMO). Este dato indicaría que en condiciones normales, la maquinaria biosintética del parásito es suficiente para satisfacer sus requerimientos, pero que al someter a C.fasciculata a un ayuno de poliaminas por bloqueo de su biosíntesis se produce una marcada inducción de la entrada de estas sustancias desde el medio externo. La enzima fue ampliamente caracterizada dsde el punto de vista bioquímico y molecular. Se clonó y secuenció en su totalidad, determinandose a partir de estos datos su PM y las zonas que podrían ser importantes desde el punto de vista de su regulación "in vivo". Por último se estudió la resistencia a DFMO del parásito, y se determinó que este fenómeno no produce diferencias sustanciales en la expresión del gen de ODC. Todas estas observaciones nos llevan a pensar que la enzima ODC de este parásito tiene propiedades que la hacen distintiva entre las estudiadas hasta el momento en otras células, y abren un nuevo capítulo en el estudio general de la estabilidad enzimática.

Descripción: Síntesis de poliaminas en T. cruzi. Tripanosoma cruzi es el agente causante de la enfermedad de Chagas. En la actualidad no existen vacunas y las drogas disponibles solo son efectivas durante la etapa aguda y producen serios efectos colaterales. Las poliaminas son esenciales para la supervivencia, proliferación y diferenciación celular en todos los organismos, incluyendo T. cruzi. El metabolismo de poliaminas es un buen blanco para el diseño de drogas, ya que es muy diferente en parásitos y mamíferos. T. cruzi no sintetiza poliaminas a partir de ornitina por la vía de Ornitina decarboxilasa; sin embargo existen opiniones contrapuestas sobre la ruta alternativa de arginina decarboxilasa. (ADC) en el parásito. El objetivo de este trabajo es investigar si T. cruzi es capaz de sintetizar poliaminas a partir de arginina. Epimastigotes de T. cruzi cultivados en medio libre de poliaminas dejan de proliferar luego de 15 días por agotamiento de los niveles endógenos de poliaminas. Ensayos in vivo con L-[U -14C] arginina muestran que T. cruzi no sintetiza poliaminas a partir de arginina. Epimastigotes transgénicos que expresan ADC de avena solo sintetizan agmatina y tampoco se multiplican en medio sin poliaminas, demostrando la ausencia de la actividad enzimática de agmatinasa. En el genoma de T. cruzi no se encontraron secuencias con identidad significativa con las ADC conocidas. Trasporte de poliaminas en C. fasciculata. Al inhibir la síntesis de poliaminas en Crithidia fasciculata aumenta el transporte de putrescina y se induce la expresión de un gen de función desconocida que podría estar involucrado en la regulación del transporte de poliaminas en parásitos tripanosomátidos.

Descripción: Las poliaminas son compuestos esenciales para el crecimiento yla proliferación celular: por este motivo se realizan grandes esfuerzospara la búsqueda de inhibidores selectivos de la biosíntesis de estassustancias con el objeto de detener el crecimiento de célulastumorales, así como de los microorganismos causantes de infecciones. Estudios recientes han propuesto el empleo de inhibidores de labiosíntesis de putrescina como una herramienta terapéutica útil paracontrolar el crecimiento de parásitos intracelulares. Por esta razón sedecidió estudiar el metabolismo de poliaminas en Trypanosoma cruziy Leishmania mexicana con el fin de encontrar diferencias en labiosíntesis de estos policationes entre el protozoo y la célula delmamífero huesped con el objeto de encontrar blancos específicos queal ser inhibidos determinen el bloqueo de la proliferaciónpermitiendo desarrollar nuevas estrategias quimioterápicas contra el Mal de Chagas y la Leishmaniasis. Se ha observado que los niveles intracelulares de poliaminas en T.cruzi en su forma epimastigote correlacionan con la fase decrecimiento. La putrescina, espermidina, espermina y cadaverinaalcanzan los valores máximos en la etapa logarítmica y luegodisminuyen hacia la fase estacionaria de crecimiento. En L. mexicanase observó un resultado similar pero en este parásito sólo se detectóputrescina y espermidina. La captación de poliaminas y sus probables precursores (ornitina, arginina y lisina) por T. cruzi y L. mexicana, como laconversión in vivo de dichos aminoácidos en poliaminas sugierenque en los tripanosomas la mayor parte de estas sustancias sontransportadas al interior de las células desde el medio externo,mientras que en Laishmania parece prevalecer la biosíntesis de lospolicationes a partir de ornitina. Se determinó que los extractos de L. mexicana poseen una altaactividad de Ornitina decarboxilasa (ODC). Se caracterizaron losrequerimientos para la máxima actividad catalítica, así comodiferentes propiedades de la enzima en relación a su estructura y laregulación de su actividad. La adición de cicloheximida y de poliaminas a los cultivosmostraron que la ODC de L. mexicana es estable y que su degradaciónno es regulada por poliaminas. La ODC es inhibida tanto in vivo comoin vitro por la adición de a DFMO. Se observó que la actividad enzimática es fuertementedependiente de la presencia de su coenzima, el piridoxal 5'-fosfato. La enzima preparada en presencia de concentraciones saturantes de PLP es más resistente a la inactivación por efecto de la temperaturay es menos sensible a la acción de inhibidores. Por otra parte, se observó que la enzima obtenida en ausenciadel cofactor contiene PLP endógeno, ya que la remoción total de lacoenzima por tratamiento con hidroxilamina produce la apoenzimainactiva, la cual requiere PLP para recobrar su actividad enzimáticamediante una unión que parece inducir cambios conformacionales dela proteína. Probablemente, la ODC no presenta homología estructural ensus regiones antigénicas con la enzima aislada de células animales, yaque no se observó reacción cruzada cuando se inmunoprecipitó la OCDdel parásito con un anticuerpo policlonal contra ODC de riñón deratón. La enzima se purificó parcialmente a partir de promastigotesde L. mexicana mediante la precipitación con acetona ycromatografías de intercambio iónico en DEAE Sepharosa, dehidroboficidad en Phenyl Superosa, de exclusión molecular en Superosa 6 y en fase reversa con una columna C4, lográndose unapurificación de 2300 veces. Los análisis en geles desnaturalizantcs de poliacrilamida y decromatografía en Sephacryl S-200 indican que la subunidad proteicao el principal producto de su proteólisis tendría un peso molecularaparente de 60 kDa, mientras que el de la proteína nativa sería deaproximadamente 200 kDa. listos resultados sugirirían que la ODCestaría formada por tres o cuatro subunidades.

Descripción: En los estados de intoxicación por plomo se observa una serie detrastornos metabólicos relacionados con la biosíntesis del hemo. Losprincipales son : a) elevada concentración de ácido delta-amino levúlico en suero yconcomitante excreción por orina. b) elevados niveles de Coproporfirinógeno III en todo el sistemaeritropoyético, que luego deriva en una excreción aumentada de este metabolitopor orina. c) gran cantidad de Protoporfirina IX en el sistema eritropoyético,excreción posterior por materias fecales. A fin de aclarar los mecanismos responsables de estas anomalías,procedió a estudiar sistemáticamente los pasos metabólicos que medianentre Glicocola y Hemo, empleando para ésto sistemas de incubación "invitro" derivados de sangre de conejos con saturnismo y distintos sustratos. La secuencia de operaciones fué como sigue: se drogaban conejoscon (AcO)2Pb durante 7 - 15 dias y a los 20-30 días de la última inyecciónse los sangraba a blanco. La sangre se recogía sobre heparina y seefectuaban luego los pasos necesarios para obtener un sistema adecuado anormales o conejos con anemia post-hemorrágica, con alta reticulocitosis. Este estado se lograba con 2-4 punciones cardíacas de 15 - 30 ml cada unaespaciadas 3 - 5 días. Las incubaciones se efectuaron entre 37 y 38°Cen baño termostatizado, con agitación constante, a tiempos variables quese consignarán en cada experiencia. Una vez terminadas las incubaciones,se procedía a aislar los productos biosintetizados. Las porfirinas libreseran extraídas de las mezclas originales, purificadas, separadasen sus componentes e identificadas por cromatografía en columna de CaCO3y/o cromatografía sobre papel. Se efectuaban luego dosajes cuantitativosde los productos aislados y se hallaban las proporciones relativas delos distintos componentes dentro de las mezclas. También se aisló Protoporfirina IX a partir de hemo, al trabajarcon compuestos marcados y se dosó su actividad. Podemos esquematizaren esta forma las experiencias y los resultados. A. Incorporación de Glic-2-C14 en hemo de reticulocitis de conejos: Se efectuaron experiencias con sangre total en presencia de Glic-2-C14 e iones de Fe, agregados como SO4Fe.7H2O. Se incubó durante 4 horas, en aerobiosis. En todos los casos se aislaron las escasasporfirinas libres y la Protoporfirina X a partir de hemo. Los resultadosindican que los reticulocitos de los conejos con saturnismoconservan algo de capacidad de biosintetizar hemo "in vitro" a partirde hierro y glicocola. Como se esperaba, los reticulocitos de conejos con anemia posthemorrágicaposeen una capacidad elevada para sintetizar hemo "de novo". Hemos controlado los métodos de trabajo con la incubación de sangre deconejos normales, sin reticulocitos y observamos la escasa neoformaciónde hemo. Creemos que además de la inhibición, ya reconocida y documentada,de la incorporación de Fe al anillo protoporfirínico para dar hemo,existiría algún otro bloqueo en la cadena biosintética de Protoporfirina IX. Uno de esos pasos podría ser la conversión enzimática de Glicocolaa ALA. B. Biosíntesis de porfirinógenos a partir de ácido delta-amino levúlico (ALA): Se incubó sobrenadante de hemolizado de glóbulos rojos de conejoscon saturnismo en presencia de ALA como sustrato. Se trabajó durante 90′en anaerobiosis. Los resultados de estas experiencias permiten concluir que en lossistemas provenientes de intoxicados por plomo, la capacidad de biosintetizar "in vitro" PBG y porforinógenos, a partir de ALA, está muy disminuída. Las fracciones de Uroporfirinógeno III y Firiaporfirinógeno IIIse encuentran marcadamente disminuídas y sólo se observa una acumulaciónde Coproporfirinógeno III. Nótese que al trabajar con sistemas libres departículas y en anaerobiosis, no hay conversión de Coproporfirinógeno III a Protoporfirina IX ni a hemo. Creemos que este freno de la cadena biosintéticaes la causa de la acumulación semejante de Copro-G-III en ambossistemas, el intoxicado y el normal. C. Incorporación de Acido delta-amino levúlico marcado (ALA-4-C14) en profirinógenos y en hemo de reticulocitos de conejos: Este tipo de experiencia difiere del anterior en que se trabajó consuspensión de glóbulos rojos en solución fisiológica, en presencia de ALA-4-C14 y de iones ferrosos. Además, el tiempo fué de 4 hs y en condicionesaerobias. Con sistemas provenientes de glóbulos rojos de conejos con saturnismose obtuvo una sintesis total de porfirinas muy inferior a lo hallado enel sistema control, como también una incorporación muy pobre enhemo. De las series B y C de experiencias "in vitro" se deduce que la enzima ALA-dehidrasa presenta una inhibición marcada de su actividad enlos estados de intoxicación por plomo. Suponiendo que el proceso "in vitro" sea representativo de lo quesucede "in vivo", tendríamos una explicación satisfactoria del origende la elevada cantidad de ALA en suero y en orina de conejos y pacientesson saturnismo. D. Biosíntesis de porfirinógenos a partir de Porfobilinógeno (PBG) Se incubaron sobrenadantes de hemolizados de conejos con saturnisno,en presencia de PBG, durante 90' y en anaerobiosis. De estas experienciasse deduciría que los sistemas enzimáticos capaces de transfornar PBG en Uroporfirinógeno III y Firiaporfirinógeno III, no se encuentranalterados; ahora el pasaje de Firiaporfirinógeno III a Coproporfirinógeno III parecería algo disminuído. Cuantitativamente, los porfirinógenosbiosintetizados son del mismo orden en ambos sistemas. E. Conversión enzimática de Uroporfirinógeno III C14 (URO G III-C14)en otros porfirinógenos intermediarios en la biosíntesis del hemo: Se incubaron sobrenadantes de hemolizados de conejos en presenciade URO G III-C14, durante 30 y 60' respectivamente, en anaerobiosis. Los resultados de estas experiencias nos dicen que, a los 30', parecehaber una menor velocidad de transformación de URO G III en FIRIA G IIIy COPRO G III en los sistemas provenientes de conejos con saturnismo. Esta diferencia no es muy notoria en la experiencia de 60'. En estaúltima se observa una transformación menor de FIRIA G III a COPRO G III. Notemos que en ningún paso se observa aceleración de procesos enzimáticos. F. Conversión enzimática de Coproporfirinógeno III-C14 (Copro G III-C14) en Protoporfirina IX C14 libre e incorporación en hemo de reticulocitos de conejos: Se trabajó durante 4 horas, en aerobiosis, con hemolizados totales de conejos, en presencia de COPRO G III-C14, como sustrato. Los resultados de estas experiencias nos indican que no habría una hipersíntesis de Proto IX a partir de Copro G III, más aún, se cree que hay una cierta disminución de la actividad del complejo enzimático CPG-decarboxilasa-CPG oxidasa, lo que llevaría a una acumulación de Copro G III en el sistema eritropoyético y a su posterior excreción por orina. La acumulación de Proto IX, por su escasa incorporación al hemo de glóbulos rojos de conejos con saturnismo causaría el aumento de Copro G III, como resultado de un mecanismo de autoregulación enzimática de tipo represivo. Descartaríamos así toda similitud del saturnismo con estados de porfiria, como fuera sugerido por algunos autores, estados aquéllos donde hay un exceso de síntesis de porfirinas y precursores. La anemia saturnina sería causada por bloqueo de la incorporación de Fe al anillo protoporfirínico para dar hemo y por una inhibición principal de la biosíntesis de Proto IX a la altura de la ALAD, aunque no podemos descartar que haya otros bloqueos secundarios.

Descripción: Fil: Carrizo, Patricia H.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Las bacterias sintetizan y acumulan diferentes polisacáridos de tipo α y β,los cuales cumplen funciones relevantes en la adaptación a los distintosentornos ambientales y en la interacción de las mismas con otrosorganismos. Los estudios que realizamos se refirieron especificamente almetabolismo de los glucanos cíclicos y del glucógeno en bacterias del sueloque interaccionan con plantas. Una parte del trabajo estuvo orientada aconocer el tipo de glucano que producen los rizobios que establecensimbiosis con el género Lotus. En dichos estudios se estableció que losglucanos cíclicos producidos por la cepa B. loti NZP 2309 tienen el mismotipo de unión y estructuras estrechamente relacionadas con los descritospreviamente en B. japonicum USDA 110, aunque la estructura de laespecie mayoritaria de cada cepa es diferente. La cepa B. loti NZP 2309produce una mezcla de glucanos cíclicos con uniones β(1-3), β(1-6), queestán formados por especies neutras, no sustituidas, con DP= 10, 11 y 12,y la especie cíclica mayoritaria esta ramificada, tiene un DP=11 y estáformada por un anillo de 10 residuos de glucosa con un único residuoterminal que forma la rama. La proporción de enlaces glucosidicos quetiene este glucano cíclico es 3:7:1 para las uniones β(1-3), β(1-6)y β(1-3, 6)respectivamente. La comparación de los glucanos cíclicos producidos porlas cepas de B. loti NZP 2309 y B. japonicum USDA 110, sugiere que dichasmoléculas tienen propiedades hidrofóbicas diferenciales y distintacapacidad de unión con flavonoides de leguminosas. Por otra parte, seobservó que ambas cepas de Bradyrhizobium sintetizan in vitro, glucanoscíclicos β(l-3), β(1-6) por mecanismos similares y que dichos glucanosestán estructuralmente relacionados. En B. loti NZP 2309 se identificó unaproteína de membrana interna de 85 kDa que podría estar involucrada enla sintesis de glucanos solubles β(1-3) y β(1-6); insolubles β(1-3) tipolaminarina, o en la sintesis de ambos compuestos. Las moléculassintetizadas in vitro están formadas principalmente por enlaces β(1-3),mientras que las moléculas producidas in vivo tienen mayor proporción deenlaces β(1-6). Nuestros resultados sugieren que la síntesis de glucanoscíclicos β(1-3), β(1-6)en Bradyrhizobium sp podria involucrar la formaciónde un glucano cíclico con uniones β(1-3), al que posteriormente seintroducen uniones β(1-6)por transglicosilación, a través de la proteína NdvC Además, determinamos y comparamos el tipo de glucano quesintetizan y acumulan dos cepas de colección de M. loti, y evaluamos si laestrucutra de los mismos está relacionada con la capacidad que tienendichas cepas para nodular distintas espcecies de Lotus. Se determinó quelas cepas M. loti NZP 2213 y NZP 2037 producen glucanos cíclicos neutrosy sustituidos con residuos aniónicos y uniones β(1-2), los que sonsimilares a los reportados en otros rizobios de crecimiento rápido. Lasintesis de los glucanos de M. loti se realiza a través de una proteínaintermediaria que tiene una masa molecular similar a la proteína de 319kDa reportada en otros rizobios que sintetizan glucanos cíclicos β(1-2).Seestableció que el tipo de glucano producido por las cepas M. loti NZP 2213, NZP 2037 y B. loti NZP 2309 no está relacionado con el rango dehospedante, ya que se determinó que las dos especies de M. loti producenglucanos similares con el mismo tipo de unión y presentan distinto rango de nodulación. Además, se observó que dos cepas con distinto tipo deglucano forman nódulos efectivos en una misma especies de Lotus. Otra parte de la tesis se centró en el metabolismo del glucógeno en bacteriasque interaccionan con plantas. Se clonó y caracterizó un fragmento de ADNgenómico de B. loti que tiene homologia con el genes de la síntesis deglucógeno y que contiene gran parte del gen glgC y el gen glgA completo, quecodifican para las enzimas ADPGlc PPasa y GS, respectivamente. Elfragmento clonado es similar a una región presente en el genoma de B.japonicum, indicando que la organización de los genes estructurales delmetabolismo del glucógeno en el género Bradyrhizobium está conservada y esdiferente a la reportada en otras bacterias. Las secuencias aminoacidicas dela ADPGlc PPasa y GS de B. loti presentan un grado de homologia mayor conlas enzimas de B. japonicum que con otras enzimas homólogas de rizobios. La ADPGlc PPasa de B. loti pertenece al grupo V de ADPGlc PPasas que estánaltamente reguladas ya que se activan por Fru 6P, Fru 1,6 bisP y piruvato. La actividad de esta enzima en nódulos reveló que la ADPGlc PPasa debacteroides de B.japonicum aumenta con la maduración del nódulo, cuandolos mismos todavía tienen actividad reductora de acetileno. Por otra parte, serealizaron experimentos de mutagénesis sitio-dirigida con la ADPGlc PPasade A. tumefaciens, que se tomó como modelo experimental, para determinarel rol que tienen los residuos de arginina que están conservados y ubicadosen la región N-terminal de las ADPGlc PPasas reguladas positivamente por Fru 6P y piruvato. Se determinó que una carga positiva en la posición 32sería necesaria para mantener la afinidad aparente de las ADPGlc PPasasactivadas por hexosas-fosfato y/o piruvato y cualquier modificación dearginina por otro aminoácido que altere el tamaño o la hidrofobicidad, reducela afinidad aparente por Fru 6P. El comportamiento de las mutantes en laposición 33 respecto a los activadores fue diferente, afectándose de maneramás drástica la activación por Fru 6P que la activación por piruvato. Lapresencia de arginina en la posición 33 es muy importante para la activaciónde la ADPGlc PPasa de A. tumefaciens y no podría ser reemplazada por otroaminoácido. La presencia de arginina en la posición 45 es importante para laactivación de la enzima por Fru 6P pero es poco probable que desempeñe unrol directo en la unión de un efector particular, ya que está completamenteconservada entre todas las ADPGlcPPasas bacterianas analizadas.

Descripción: Fil: Cataldi, Angel Adrián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Las poliaminas son policationes orgánicos nitrogenados de bajo peso molecular,ampliamente distribuidos en todos los seres vivos, que participan en numerosos procesos metabólicos yfisiológicos. Si bien estos compuestos tienen una importante participación en la proliferación celular,no se conoce su papel fisiológico exacto. Una de las tres estrategias fundamentales para determinar las posibles funciones de laspoliaminas en los seres vivos es el estudio de las alteraciones que se producen en celulas u organismosque carecen o tienen disminuido el contenido endógeno de poliaminas, siendo por diversas razones lamejor estrategia. Se han desarrollado dos sistemas para disminuir el contenido endógeno de estospolicationes: 1.-la utilización de inhibidores dc la biosíntcsis de poliaminas y 2.- la obtención demutantes auxótrofas para estas bases orgánicas. El uso de las mutantes constituye una muy buenaherramienta de trabajo y ha permitido determinar algunos de los papeles fisiológicos de las poliaminasen los seres vivos. La levadura Saccharomyces cerevisiae es un excelente modelo para el estudio de labioquímica y de la biología celular y molecular en eucariotes. En los últimos años se han aisladomutantes de este organismo auxótrofas para poliaminas^21,32,33,116, pero han sido poco estudiadas ynos permitirían determinar los papeles fisisológicos de estos compuestos en la proliferación celular. Estas mutantes crecen deficientemente^32,33,116, no pueden esporular^32, no mantienen el plásmido "killer"^118 y tienen alterado el transporte de colina^33. En el presente trabajo se utilizó la cepa de levaduras S.cerevisiae 179-5 auxótrofa parapoliaminas obtenida por Hosaka et al^33. El estudio de las alteraciones que se producen en ausencia deestos policationes permitió asignarles nuevas funciones en este organismo. Hemos encontrado que seproducen una serie de deficiencias en ausencia de poliaminas, además de las descriptaspreviamente^32,33,116,118. a.- La síntesis de macromoléculas, ADN, ARN, y proteínas está disminuida, recuperándose primero lasíntesis proteica por reagregado de poliaminas. b.-Los ribosomas se encuentran disociados, siendo el índice de asociación dependiente del grado deayuno; muestran además una mayor sensibilidad al efecto disociante de la presión hidrostática durantela corrida. Además, responden menos al efecto asociante del catión Mg²+; el catión monovalente K+,por el contrario, los disocia más facilmente. El agregado in vitro de poliaminas no altera el equilibriode subunidades ribosomales. También se observan alteraciones en los polisomas, hay una menorproporción de monosomas involucrados en la síntesis proteica y aparecen estructuras denominadas "halfmers" que son acúmulos de la subunidad 40S sobre el ARNm. Todas estas evidencias demuestranpor primera vez un papel fisiológico de las poliaminas en el ensamblado y/o biogénesis del ribosomaeucariótico, previamente hallado en procariotes. c.- La pared celular se vuelve más resistente al ataque de diversas enzimas líticas, dependiendo delgrado y tiempo de ayuno de los cultivos. La lisis producida por estas enzimas aumenta parcialmente poragregado de distintos agentes que favorecen su acceso al sustrato, que es la capa más interna de glucanoβ1-3. La composición química de la pared se encuentra alterada, pues disminuye drásticamente lacantidad de glucano β1-3, aumentan ligeramente las manoproteínas y se incrementa moderadamente elglucano β1-6. La estructura de la pared celular, analizada por microscopía electrónica, no eshomogénea, es de mayor espesor y aparecen microcuerpos electrodensos dentro de la misma deprobable origen ciloplasmático. Por lo tanto, se pudo ver que las poliaminas participan en la síntesisy/o estructura de la pared celular, siendo la primera vez que se describe este papel para estoscompuestos. d.- Se observaron por microscopía de contraste de fase y electrónica una serie de cambios morfológicosen la célula que sugieren que las poliaminas participan y/o regulan algunos de los eventos específicosdel ciclo celular. Los cultivos se arrestan en fase G1, como organismos no brotados, pero un porcentaje (5-15%) posee multibrotaciones, algunas de ellas en sitios anormales. Las células son más grandes, loque se confirmó por análisis de los tamaños de poblaciones celulares con un Coulter Analyzer. Además, utilizando un colorante fluorescente específico para ADN que tiñe los núcleos celulares, seobservaron alteraciones en la mitosis. La septación también se encuentra alterada como se observa pormicroscopía electrónica.

Descripción: Fil: Cozza, Eduardo Néstor. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: Las plantas de sauce pertenecen al género Salix que comprende varias especies leñosas de las cuales muchas han sido mejoradas con fines comerciales. Los diferentes genotipos de sauce muestran diversos grados de susceptibilidad al ataque de insectos herbívoros. Esto se debe, al menos en parte, a que el contenido de metabolitos especializados asociados con las defensas está determinado principalmente por la genética de la planta. Siendo la avispa sierra del sauce Nematus oligospilus, un insecto especialista que representa una de las principales amenazas para las plantaciones de sauces en la zona del Delta del Paraná, es importante estudiar su comportamiento frente a las defensas químicas de Salix spp. Esta interacción se abordó desde una perspectiva que abarque tanto los rasgos intrínsecos de la planta como las características comportamentales del insecto. El objetivo general de esta tesis fue evaluar el perfil fitoquímico de Salix spp y su rol en la interacción con la avispa sierra durante las tres etapas del proceso de selección de la planta hospedera: Evaluación por contacto, oviposición y herbivoría. Por lo tanto, se analizó el perfil constitutivo e inducido por el daño de N. oligospilus de los metabolitos especializados asociados típicamente a las defensas en salicáceas: compuestos fenólicos (salicinoides y taninos condensados) y orgánicos volátiles (COVs). Esto fue realizado en distintos genotipos comerciales exóticos y en S. humboldtiana, la única especie nativa de Sudamérica, amenazada por la invasión de sauces exóticos. Los resultados muestran que la susceptibilidad de los sauces comerciales a N. oligospilus correlaciona fuertemente con la concentración de salicinoides presentes en la superficie foliar y sugieren que podrían ser las claves de contacto que desencadenan el comportamiento de oviposición de la avispa sierra. Luego, se demostró que el sauce comercial S. babylonica var sacramenta respondió frente a la oviposición per se mediante la activación de la señalización de defensas a través de la vía del ácido jasmónico. A su vez, se alteró el perfil de emisión de COVs y se afectó negativamente el desempeño del insecto, a través de un incremento en la proporción de individuos que retrasan su transición a pupa. Por último, se compararon las respuestas de defensa constitutivas e inducidas por el daño de N. oligospilus en el sauce comercial S. babylonica var sacramenta y en el sauce nativo S. humboldtiana, y sus efectos sobre este insecto plaga. El análisis de salicinoides, taninos condensados y COVs tanto en forma constitutiva como inducida por el daño, mostró un perfil propio para cada especie de sauce. En S. humboldtiana, se observó un nivel de salicinoides mayor que en S. babylonica, aunque este último mostró una inducción significativa frente al daño. Pese a la mayor proporción de salicinoides, S. humboldtiana resultó ser un hospedero más susceptible a la avispa sierra, ya que favoreció su desempeño y preferencia de oviposición. El efecto opuesto se observó en Spodoptera frugiperda un insecto generalista modelo, cuyo desarrollo y supervivencia disminuyó al alimentarse de S. humboldtiana. Esto sugiere que los salicinoides en altas concentraciones afectan negativamente a los insectos generalistas, pero no tendrían un rol defensivo contra la avispa sierra que, al ser especialista posee tolerancia a estos compuestos. Esta tesis aporta más evidencia sobre el rol de los metabolitos especializados en plantas leñosas, un modelo muy poco explorado en relación con las plantas herbáceas. Se demostró la importancia de estudiar varios genotipos para determinar la susceptibilidad a los insectos herbívoros a través de la caracterización de los metabolitos especializados y del comportamiento de los insectos plaga. Esto sugiere una posible explotación de los rasgos defensivos de las plantas contra los insectos herbívoros en los programas de mejoramiento e incluso en programas de rescate de especies de árboles amenazadas como S. humboldtiana.

Descripción: En el presente trabajo de Tesis se describe el aislamiento, elucidaciónestructural y actividad biológica de los metabolitos secundarios presentes en losextractos etanólicos de dos especies nativas: Cordia americana (L.) Gottschling & J. S. Mill e Hyalis argentea D. Don ex Hook & Arn var. latisquama Cabrera. Tambiénse detalla la obtención de derivados semisintéticos a partir de productos naturalesabundantes. Cordia americana (L.) Gottschling & J. S. Mill es un árbol madereroampliamente distribuido en el norte argentino. A partir de la corteza de este árbol seaislaron seis neolignanos nuevos que poseen en su estructura un particular biciclo [2.2.2] octeno, muy poco común en otros productos naturales. Se investigó laactividad antifúngica, antibiótica y antioxidante de dichos compuestos. A partir del extracto etanólico del arbusto costero Hyalis argentea D. Don ex Hook & Arn var. latisquama se aislaron e identificaron veintiséis terpenoides y unacumarina. Cuatro de estos compuestos son nuevos. Tanto los extractos crudos de laspartes aéreas y rizomas, como los compuestos puros fueron ensayados frente a loshongos patógenos Candida albicans y Cryptococcus neoformans. Además, unaalícuota del extracto polar de las partes aéreas fue incluida en pinturas de matrizsoluble, a fin de evaluar su capacidad antifouling en ensayos de campo realizados enel Puerto de Mar del Plata. Con la intención de adicionar residuos que tuvieran actividad antifoulingreconocida, se obtuvieron diez derivados a partir del ácido abiético, uno de losmayores constituyentes de la resina colofonia. Cuatro de estos compuestos sereportan por primera vez. Con el mismo objetivo, se adicionó un residuo oxazólico a ácidos biliaresobteniéndose siete derivados nuevos. También se sintetizó el oxazol que se utilizópara modificar a los ácidos biliares. Tanto este compuesto, como los derivados de losácidos biliares y los ácidos biliares de partida fueron utilizados en ensayos deactividad antifúngica frente a Candida albicans. Además, algunos de los derivadosfueron incorporados en pinturas antifouling. Palabras clave: plantas superiores, metabolitos secundarios abundantes, Cordiaamericana, neolignanos, Hyalis argentea var. latisquama, terpenoides, ácido abiético,ácidos biliares, modificaciones sintéticas, oxazoles, actividad antifúngica, actividadantifouling, actividad antioxidante.

Descripción: Esta tesis consiste de dos partes, en cada una estudiamos la estabilidad bajo pequeñasperturbaciones de ciertos modelos probabilísticos en diferentes contextos. En laprimera parte, estudiamos pequeñas perturbaciones aleatorias de un sistema dinámicodeterminístico y mostramos que las mismas son inestables, en el sentido de que los sistemasperturbados tienen un comportamiento cualitativo diferente al del sistema original. Más precisamente, dado p > 1 estudiamos soluciones de la ecuación en derivadas parcialesestocástica ∂tU = ∂xx^2 U + U|U|^p−1 + εW (ver formula en el original)con condiciones de frontera de Dirichlet homogéneas y mostramos que para ε > 0 pequeñoséstas presentan una forma particular de inestabilidad conocida como metaestabilidad. Enla segunda parte nos situamos dentro del contexto de la mecánica estadística, dondeestudiamos la estabilidad de medidas de equilibrio en volumen infinito bajo ciertas perturbacionesdeterminísticas en los parámetros del modelo. Más precisamente, mostramosque las medidas de Gibbs para una cierta clase general de sistemas son continuas conrespecto a cambios en la interacción y/o en la densidad de partículas y, por lo tanto,estables bajo pequeñas perturbaciones de las mismas. También estudiamos bajo quécondiciones ciertas configuraciones típicas de estos sistemas permanecen estables en ellímite de temperatura cero T → 0. La herramienta principal que utilizamos para nuestroestudio es la realización de estas medidas de equilibrio como distribuciones invariantes delas dinámicas introducidas en [16]. Referimos al comienzo de cada una de las partes parauna introducción de mayor profundidad sobre cada uno de los temas.

Descripción: Fil: Dassen, Claro Cornelio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: El tratamiento biológico de efluentes domésticos o industriales por lodos activados sebasa en la actividad de poblaciones microbianas capaces de autoensamblarse paraconstituir una comunidad dinámica de alta diversidad. Revelar los factores quedeterminan la estructura de las comunidades microbianas y los mecanismos queconducen a su ensamblado es crítico para mejorar la gestión del proceso de tratamientoy para proveer un marco conceptual que pueda ser aplicado a comunidades microbianasen otros procesos de biotecnología ambiental. Varios estudios previos realizados enplantas de tratamiento de lodos activados municipales, de diferente configuración yprovenientes de sitios geográficamente distantes, sugerían la presencia de taxonesbacterianos de alto rango (filos) comunes a todos los sistemas estudiados. En base aestos antecedentes, se planteó la hipótesis de que los determinantes ecológicos delproceso de tratamiento relacionados con la formación del agregado biológico (floc), quepermite la retención de la biomasa en el sistema, serían los principales responsables dedefinir la composición de la comunidad bacteriana en lodos activados. Los objetivos de esta tesis fueron: 1) comprobar si existe un grupo común (core) detaxones bacterianos y funciones en plantas de tratamiento de efluentes municipales eindustriales, y 2) determinar cuáles son las variables ambientales y operacionalesrelevantes en la estructuración de las comunidades bacterianas de los lodos activados. Se realizaron estudios de metagenómica comparativa, utilizando técnicas depirosecuenciación de amplicones de las regiones variables V1-V3 del gen de ARNribosomal 16S (ARNr 16S), y secuenciación al azar de ADN metagenómico. Seanalizaron lodos activados de 9 plantas de tratamiento de efluentes ubicadas en Argentina, dos municipales y siete industriales, cada una muestreada en dosoportunidades, separadas por períodos de hasta 4 años, conjuntamente con los datosmetagenómicos de 12 plantas de tratamiento industriales y municipales localizadas en China, India, Singapur y Corea del Sur, generados en otros laboratorios. Se determinó que la diversidad taxonómica y funcional es significativamente mayor enlodos activados municipales que en industriales. Cada sistema de lodos activados quetrata un efluente industrial particular presentó una composición bacteriana característica,reproducible en el tiempo, y marcadamente distinguible del patrón de filos y clasesbacterianas observado en plantas municipales. A pesar de los cambios a nivel de génerodentro de cada planta, se observó una conservación de los perfiles de contenido de GCen los metagenomas. Se detectó una preferencia particular de ciertos grupos bacterianosconsistente con diferencias subyacentes en las abundancias de categorías funcionalesparticulares, que a su vez se relacionaron con la metabolización de constituyentesespecíficos de los efluentes. Se concluye que las características del efluente son elprincipal determinante de la estructuración de las comunidades bacterianas en sistemasde lodos activados. Asimismo, se sugiere que el aumento en la variedad de sustratos queingresan a los procesos de tratamiento, por ejemplo combinando efluentes de diferentesorígenes en parques industriales, permitiría la conformación de comunidadesmicrobianas más robustas en términos de resistencia y resiliencia frente aperturbaciones. Los modelos mecanicísticos como el ASM1 o el ASM3, que son herramientas valiosaspara la representación de procesos biológicos que ocurren en biorreactores, soncalibrados utilizando parámetros derivados de plantas de tratamiento municipales. Losresultados obtenidos en esta Tesis resaltan la importancia de considerar las diferenciastaxonómicas y funcionales entre lodos activados industriales y municipales, ya que lasmismas podrían reflejar cambios en la cinética de consumo de sustratos y en laformación de productos de almacenamiento.

Descripción: El Problema de Ruteo de Arcos Capacitados (CARP) es un problema de optimización combinatoria que consiste en satisfacer demandas de servicios/productos sobre determi- nadas calles de una red vial mediante una flota homogénea de vehículos, minimizando el costo total de recorrido involucrado. Ha sido aplicado a casos reales como recolección de residuos, mantenimiento de calles, lectura de medidores eléctricos, entre otros. CARP es un problema de optimización combinatoria de tipo NP-Hard. A tal efecto, en la literatura se han propuesto algoritmos exactos y heurísticas. Los primeros, basados en su mayoría en las técnicas Branch and Bound y Cutting Plane, obtienen soluciones óptimas sobre instancias de datos de tamaño reducido. Los segundos, en general, alcanzan soluciones cercanas a las óptimas y a bajo costo computacional. El objetivo de esta tesis es el desarrollo de algoritmos heurísticos que contengan ca- racterísticas salientes de metaheurísticas tales como Honey Bee Mating Optimization (HBMO), Biased Random Key Genetic Algorithm (BRKGA), Greedy Randomized Adaptive Search Procedure (GRASP), Variable Neighborhood Search (VNS), entre otras. Los resultados computacionales obtenidos por los algoritmos propuestos usando diferentes instancias de la literatura, muestran que los mismos son competitivos y robustos.

Descripción: Fil: Di Marco, Alejandro Carlos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: En el presente estudio hemos evaluado los niveles y la actividad de las metaloproteinasas de la unidad feto-placentaria a mediados de la gestación en ratas sanas y diabéticas, etapa en la cual se instaura la función de transporte materno-fetal, y ambas entidades están sufriendo activos procesos de remodelación y de reestructuración tisular en los cuales estas proteasas están implicadas. Nuestros resultados muestran que los niveles y la actividad de las metaloproteinasas 2 y 9 son más altos en las placentas y los fetos de ratas diabéticas. Asimismo señalan que el medio ambiente materno diabético genera un incremento en los niveles placentarios y fetales de las especies reactivas del oxígeno y nitrógeno los cuales ocasionan una sobreactivación metaloproteásica. Nuestros resultados también determinan que la 15-deoxy-Δ12,14-prostaglandina J2 (ligando endógeno de los receptores PPARγ) es un modulador negativo de la expresión y de la actividad de metaloproteinasas 2 y 9 fetales y placentarias, y que la producción de dicho prostanoide es menor en los tejidos provenientes de animales diabéticos con respecto al grupo control. Los presentes resultados permiten concluir que las alteraciones evidenciadas en la expresión y actividad de las metaloproteinasas en la unidad feto-placentaria de ratas diabéticas, posiblemente vinculadas con la generación de lesiones placentarias y dismorfogénesis embrionaria características en esta patología, son inducidas, al menos en parte, por desbalances en la producción de agentes moduladores como las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, y agonistas endógenos de PPARγ.

Descripción: Fil: Butti, Matías Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Descripción: El presente trabajo tiene como principal objetivo el desarrollo de una metodología para la identificación de cultivos agrícolas de verano en Uruguay, a partir del uso de imágenes satelitales y aprendizaje automático. Para ello, como insumo se utilizaron bases de datos con información georreferenciada de campo, e imágenes satelitales de libre acceso. De las bases, dos fueron proporcionadas por organizaciones de productores agropecuarios y son de chacras con agricultura, y otras del Ministerio de Ganadería, Agricultura y Pesca de Uruguay (MGAP). Una con información de coberturas y usos del suelo, y otra de chacras con planes de uso para conservación del suelo por erosión. Los cultivos agrícolas presentes en las bases son maíz, soja y sorgo. Las imágenes utilizadas provienen de los satélites de tipo óptico, Sentinel 2 y Terra, y de Sentinel 1, que tiene un sensor radar de apertura sintética. De estos satélites, en particular de Sentinel 1 y 2, se obtuvieron series temporales de varias bandas del espectro electromagnético. El procesamiento de los datos se hizo a través del uso combinado de algoritmos de clasificación no supervisada, supervisada y de reducción de la dimensionalidad. De los no supervisados se evaluaron Gaussian Mixture Model (GMM), K-Means, Learning Vector Quantization (LVQ), Self Organizing Map (SOM) de Kohonen y Spectral Clustering. De los supervisados se evaluaron AdaBoost, Gradient Tree Boosting, Random Forest, Support Vector Machine (SVM) y XGBoost. El algoritmo de reducción de la dimensionalidad utilizado fue t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE). Una de las herramientas utilizadas para el procesamiento de los datos georreferenciados y las imágenes satelitales es la moderna y potente plataforma de análisis geoespacial en la nube Google Earth Engine (earthengine.google.com). Con el uso de esta herramienta se generaron mapas a nivel nacional clasificados pixel a pixel. Combinando clasificación no supervisada con el algoritmo de t-SNE se desarrolló una técnica para identificar y depurar datos mal etiquetados, así como zonas sin agricultura dentro de las chacras. Para la clasificación supervisada se generaron modelos que en la dimensión espacial trabajan clasificando puntos georreferenciados, o a nivel nacional, pixel a pixel, y a nivel de cultivo estos indican si hay agricultura o no (modelos binarios) y el tipo de cultivo específico (maíz, soja o sorgo). De los algoritmos supervisados, Random Forest y XGBoost fueron los de mejor desempeño. Para los modelos de clasificación binaria, el mejor desempeño fue 98,5 de F1-Score. Para los modelos de cultivo a nivel de chacra, en maíz y sorgo, el mejor desempeño fue 75,3 y 77,5 de F1, y en soja 98,5, siendo este último superior al obtenido en varios trabajos internacionales. Otro de los objetivos específicos de este trabajo fue poder realizar el seguimiento de la condición de los cultivos en la chacra durante la zafra. Para ello se desarrolló una metodología que utilizando K-Means realiza la zonificación de la chacra en dos o más zonas de acuerdo con la evolución temporal del índice NDVI desde la siembra. Además, a partir de la firma fenológica mediana de la chacra, suavizada a paso diario, y con análisis de derivada primera, se extrajeron las métricas fenológicas de mínimo, punto de inflexión, máximo, días desde mínimo a máximo, amplitud de NDVI entre mínimo y máximo, entre otras. A partir de estás métricas se puede caracterizar una chacra y hacer comparaciones con otras.

Descripción: Se desarrolla en este trabajo una metodología experimental para el análisis estructural de regiones sometidas a esfuerzos compresivos, investigando la influencia que ejercen ciertos rasgos previos del material involucrado sobre su comportamiento. Se utilizan modelos análogos para contrastar hipótesis y avanzar en el entendimiento de la evolución de los procesos deformativos estudiados, ponderando la importancia de las diversas variables involucradas. Se presenta el software GEODEF 1.1, diseñado para lograr un monitoreo detallado en 2D de los campos de deformación que atraviesan los experimentos durante su evolución a partir de fotografías digitales sucesivas; se parte para ello de los campos vectoriales asociados, obtenidos a partir de una técnica de correlación óptica de imágenes (PIV: Particle Image Velocimetry). Su aplicación permite resolver pasos incrementales de deformación, identificando dónde ésta se concentra antes que sea reconocible sobre su superficie formando escarpas. Además el programa calcula y mapea las componentes de la deformación registrada: rotación, dilatación, cizalla simple, y grafica los ejes de las elipses en cada zona. A partir de dos series de modelos análogos se reproducen y analizan procesos estructurales de dos escalas diferentes: i) la reactivación oblicua de sistemas extensionales, y ii) la generación de curvaturas en planta en fajas plagadas y corridas. De la primera serie fue posible extraer un modelo evolutivo que explica consistentemente la coexistencia de fallas parcialmente invertidas oblicuas a los esfuerzos, y nuevos corrimientos independientes del sistema extensional reactivado, así como también la formación de corrimientos fuera de secuencia. Estos resultados fueron comparados con prototipos naturales, aportando analogías útiles para inferir la arquitectura extensional pre-compresiva que condicionó la evolución estructural de cada uno de ellos y explicar su geometría. En particular, en el sector sur de la faja plegada y corrida de Malargüe fue posible interpretar la presencia de trenes de extensión de orientación NO-SE desarrollados durante el Jurásico. A partir de la segunda serie de experimentos, se determinó la relevancia del espesor de cobertura sedimentaria, la existencia de un nivel de despegue regional, y la presencia de un obstáculo en el antepaís, para definir la configuración regional de una faja plegada y corrida en relación con el desarrollo de curvaturas estructurales. Se adoptó como caso testigo a la faja plegada y corrida del Agrio y su prolongación hacia el sur en la cuenca Neuquina, reproduciendo a escala su configuración pre-terciaria. Se deduce mediante este enfoque que el dominio externo de la faja del Agrio define una saliente estructural, inducida fundamentalmente por las variaciones de espesor de la cobertura mesozoica involucrada en la deformación, y que la inflexión identificada en el sector sur de la faja respondería a la interacción entre la estructuración andina y la Dorsal de Huincul.

Descripción: El objetivo del presente trabajo es el estudio y la optimización de metodologías analíticas combinadas para la evaluación de arsénico total y sus especies inorgánicas a nivel de vestigios en aguas naturales. Las distintas estrategias se basaron en sistemas de inyección en flujo (FI) acoplados a generadores de hidruros (HG) y detectores atómicos (AAS) con atomizador de tubo de cuarzo (QT). Las metodologías para la "especiación" elemental de arsénico en aguas naturales desarrolladas en este trabajo fueron optimizadas en condiciones no usuales para FI-HG-QT-AAS con el objetivo de mantener la distribución original de especies existente en el momento del muestreo. En el Capítulo 1 se presenta un panorama actualizado del problema sanitario ocasionado por la presencia de arsénico en las aguas subterráneas utilizadas para consumo humano en diferentes regiones del planeta, la relación existente entre las características hidrogeológicas de los reservorios naturales y la especie arsenical predominante, los avances aportados por recientes estudios toxicológicos y epidemiológicos como así también, el estado de la reglamentación sobre el tema a nivel nacional e internacional. Las metodologías analíticas más utilizadas en la determinación de arsénico y sus especies son también presentadas y discutidas en este capítulo. En el Capítulo 2 se realiza una revisión detallada de las diferentes estrategias mencionadas en la literatura para la preservación de las especies metálicas a nivel de vestigios en muestras acuosas. Se presenta un muestreador para la extracción de agua subterránea destinada al análisis de "especiación", el que fuera diseñado y construido en ocasión de este trabajo, con el objetivo de conservar la integridad de las muestras y las especies arsenicales durante las operaciones de muestreo. Las tareas de muestreo realizadas han involucrado la separación de las especies de arsénico inorgánico en campo mediante la utilización de resinas de intercambio aniónico fuertes y la recolección de las muestras para su análisis en laboratorio utilizando métodos en línea. Se discuten aquí, las ventajas y desventajas de la adición de preservantes en campo cuando el objetivo es el análisis de "especiación", justificándose de esta forma la modalidad adoptada en este trabajo.En el Capítulo 3 se presenta la optimización de una metodología FI-HGAAS para la determinación selectiva de As(III) mediante discriminación por pH en muestras de agua no acidificadas, en decir, sin preservar. Se presentan los mecanismos de transferencia de masa del analito desde el generador al detector y se postulan mecanismos de generación de átomos en tubos de cuarzo. Se analiza la bondad del diseño del sistema en flujo en términos de control de la dispersión (física y química) del bolo de muestra en el volumen total del manifold. Se muestran los resultados obtenidos en condiciones optimizadas y se hace una evaluación crítica de la influencia de las distintas variables operativas en la respuesta analítica ya que, la valoración en un medio de baja acidez, es atípica para el sistema FI-HGAAS empleado. En el Capítulo 4 se presenta un segundo método para la "especiación" de arsénico basado en un proceso de extracción en fase sólida (SPE) en columna para la separación de As(III) y As(V) a través de intercambio de iones, acoplado a un sistema de generación de hidruros y detección por espectrometría atómica. Las variables del sistema SPE-FI-HG-QT-AAS desarrollado para la determinación de As(III) en línea, se optimizaron mediante la aplicación de diseño experimental. En el Capítulo 5 se muestran los resultados del análisis de especiación de As(III) y As(V) inorgánicos en muestras de agua subterránea. Se realiza un estudio de interferencias ocasionadas por mecanismos de competencia en el proceso de extracción y se proponen alternativas para su eliminación. Se presentan aquí los estudios de validación de las metodologías analíticas desarrolladas en ocasión del trabajo utilizando como alternativa la espectrometría de masa con plasma inductivo acoplada a cromatografía líquida de alta performance (HPLC-ICPMS). Se comparan críticamente los resultados obtenidos. El Capítulo 6 se dedica a detallar los reactivos, materiales y métodos utilizados a lo largo del trabajo. El último capitulo está dedicado a las principales conclusiones. Las referencias bibliográficas son presentadas al final del trabajo.

Descripción: El objetivo consistió en utilizar la capacidad sinóptica de las imágenes satelitales NOAA-AVHRR,y las variables físicas medidas mediante éstas, para efectuar análisis espacio-temporales que permitan asociar las variables satelitales con procesos oceanográficos e información biológico-pesquera. Se desarrollaron metodologías de procesamiento que permiten el uso de la información AVHRR para la generación estandarizada y confiable de imágenes de TSM (utilizando las bandas 3 a 5 del infrarrojo térmico) e imágenes de reflectancia del agua como indicadoras del grado de turbidez superficial en zonas costeras (empleando las bandas ópticas 1y 2). Se generó una metodología para derivar imágenes de gradientes a partir de las imágenes de TSM, las cuales son utilizadas para la identificación de frentes oceanográficos. Finalmente, se generaron distintos procedimientos para analizar la coherencia y calidad de una serie de 800 imágenes de TSM para el ASO, las cuales abarcan un período de 11 años (1985-1995) de información AVHRR de TSM. La serie temporal de 11 años de datos de TSM se utilizó para describir las condiciones medias de esta variable en el ASO, la amplitud térmica del ciclo anual y las fechas de ocurrencia de las TSM máximas y mínimas, análisis que complementan y refuerzan trabajos previos efectuados. Sin embargo, debido al mayor grado de detalle en relación con mapas climatológicos preexistentes, las distribuciones mensuales y estacionales medias de TSM, pueden ayudar a comprender con mayor detalle el patrón anual de la TSM, el cual resulta de suma importancia para la interpretación de muchos eventos biológicos en esta extensa región. La serie temporal permitió identificar y caracterizar temporalmente las zonas de ocurrencia de frentes oceanográficos en el ASOa partir de imágenes de gradientes de TSM. La considerable extensión espacial de las imágenes permitió una perspectiva a gran escala de los frentes imposible de obtener mediante campañas oceanográficas. Los datos AVHRR de turbidez se utilizaron en la zona del Río de la Plata. Se estableció una metodología que permite estimar la distribución de sedimentos superficiales a partir de la correlación entre la concentración de sedimentos en superficie y los valores de reflectancia. Por otro lado, se analizó la importancia relativa de la distribución de los frentes de salinidad y turbidez en relación con el patrón de distribución de clases de edades de corvina rubia (Micropogonias furnierü en el estuario. La TSM se asoció con las capturas de caballa (Scomberjaponicus) en la zona costera marplatense (38°S) y merluza de cola (Macruronus magellanicus) en la zona del talud continental. La TSM obtenida a partir de datos AVHRR mostró ser útil para analizar la relación entre esta propiedad y las capturas, sugiriendo que metodologías de análisis de la capa superficial de temperatura mediante información satelital AVHRR pueden ayudar en el ahorro de tiempos de búsqueda del cardumen y costos de navegación.

Descripción: The main objective of this Thesis is to carry out studies on multi-offset (MO) methodologies of reflection Georadar (GPR) to: 1) improve the signal-to-noise ratio and the continuity of the primary reflections in soils and structures that show low response levels and 2) evaluate the potential of these methodologies in relation to new GPR applications. We investigated the use of MO methodologies to study cylindrical structures with significant curvature, such as trunks and pillars. These structures produce abundant multiple reflections that, in single-offset (SO) data sections, cannot be distinguished from the primary reflections of interest and that can hide them due to their relatively high intensities. We have solved that ambiguity through the simultaneous acquisition of MO profiles, and the modeling and adjustment of theoretical curves, which allowed identifying the multiples. This adjustment, made also possible to increase the precision in the calculation of the velocity of propagation, which in turn allows better positioning the reflectors. By adapting migration and visualization procedures commonly used in prospecting of low-curvature air-ground interfaces, it was possible to generate final images of the sections of the structure. As an application of this methodology, the internal structure of the cylindrical pedestal of a monument was investigated. The objective of the study was to detect and position possible reinforcement elements along the pedestal, in a reliable and precise way. This was important to design a safe disassembly and relocation plan by the specialists. Due to the aerial and downtown location of the monument, the ambient noise predominated over the GPR signals. This noise could be eliminated from the data sections by an iterative adjustment of sinusoidal waves on the traces, and the subsequent subtraction of them. The application of the joint SO-MO methodology allowed identifying numerous primary reflections at reinforcement elements of the structure, inhomogeneities of its material, multiples, and reflections external to the structure, with high reliability and in detail. The final images of the pedestal sections showed the distribution of the reflectors inside, clearly and precisely, thus solving the continuity/discontinuity of the reinforcement elements along the pedestal. Second, we studied the joint application of a MO methodology, the one-dimensional Emitter Synthetic Arrays (SEA-1D) method and rotation properties of the scattering matrix (PRMS) to improve the calculation of the orientation of linear structures, such as pipes and poor junctions, from data acquired along a single survey line. This is important in cases where it is not possible to prospect the terrain using 2D grids, due to obstacles on the soil surface, such as fixed objects and significant uneveness of the terrain, and a greater precision in the result is required than that obtained from the preceding SO-PRMS method. In this sense, the use of the SEA method is aimed at reducing the fluctuations of the primary reflection, which is produced by the interference of clutter and noise, and then to increase the precision in the result. As an initial step, the characteristics of the SEA-1D wave fronts that are necessary for an effective improvement of the SO reflections were analyzed, in particular, their continuity and amplitude level with respect to the noise and clutter were analized, as functions of the main parameters of the arrays, that is, the number of emitters, and the distance and time shift between them. A procedure for optimizing the SEA results was defined through indicators of the improvement, which made the results independent of the interpreter's criteria. Regarding the previous SO-PRMS methodology, the SEA-1D-PRMS implementation significantly reduced the fluctuations in the resulting azimuth distributions. An implementation of the Common Midpoint and PRMS methods (CMP-PRMS) was also evaluated. The comparison of numerical and experimental results has shown that the SEA-PRMS methodology leads to azimuth values that are more accurate than those of the other methods. Finally, the SEA-1D method has been extended to 2D arrays. The objective of this extension was to combine the beneficial effects produced on the primary reflections by 1D arrays oriented along the survey line (1Dx) and transversally to it (1Dy). Array structures and relationships between the components that allow simple and efficient acquisition of data and optimization of results were analyzed. The effects of varying the most relevant parameters of the array were studied. The SEA-2D results were compared to those of the SEA-1Dx, SEA-1Dy, CMP and SO. In particular, two fundamental soil models, that includes a large reflector and a small diffractor, respectively, were analyzed. It was demostrated that the SEA-2D arrays significantly improve the results of the other methodologies, both in relation to the continuity of the signals and the signal-to-noise level.

Descripción: En este trabajo se estudió la capacidad de algunas especies de Trichoderma, en particular T. harzianum, como antagonistas del patógeno vegetal Sclerotinia sclerotiorum. En las pruebas de antagonismo "in vierto" se comprobé dicha capacidad en términos de la disminución del crecimiento de la colonia del patógeno y la reducción tanto de la viabilidad de los esclerocios como del desarrollo de otros nuevos. También se describió el proceso del micoparasitismo por parte del antagonista Trichoderma spp. sobre dos fases somóticas del patógeno: sus esclerocios y el micelio. En el primer caso se observó, con microscopía óptica, la colonización de los tejidos de los esclerocios infectados por parte del antagonista, comprobándose la total destrucción de la médula de los mismos. En el segundo, se observaron las interacciones hifales entre el micoparásito (T. harzianum BAFC cult. N§ 742) y el hospedante, tanto en cultivo dual como en un suelo estéril, con microscopía óptica y de barrido. En los cultivos duales, las hifas de T. harzianum crecieron hacia las de S. sclerotiorum enrollándose alrededor de ellas. En los últimos estadíos del proceso micoparasítico, se observaron enrollamientos o "coilings" muy densos y una degradación parcial de las paredes celulares de las hifas del patógeno. En suelo estéril, los conidios de T. harzianum germinaron y el micelio en desarrollo alcanzó al de S. sclerotiorum. Trichoderma formó ramificaciones cortas y cuerpos similares a apresorios los cuales podrían contribuir con la penetración de la pared del hospedante. Por otro lado se comprobé la capacidad del aislamiento de T. harzianum BAFC cult. N§ 742 para producir enzimas extracelulares que degradan las paredes celulares de S. sclerotiorum. Paralelamente se verificó la presencia de lectinas en una medio de cultivo líquido de S. sclerotiorum. En este trabajo se estudió además, la supervivencia de esclerocios de S. sclerotiorum en un suelo inoculado con T. harzianum en función de la concentración de inóculo del antagonista, de la temperatura y del pH. Posteriormente se llevaron a cabo pruebas preliminares sobre control biológico. Primero se desarrolló un sistema "in vierto" para evaluar la habilidad de Trichoderma para controlar la marchitez producida por S. sclerotiorum en plantas de pepino y lechuga: el recubrimiento de semillas con conidios de T. harzianum result¢ en reducciones del efecto de S. sclerotiorum sobre la emergencia y post-emergencia de las plantas de ambos hospedantes. Luego se realizó una búsqueda o "screening" en invernadero, con lechuga, en el cual se ensayaron varios aislamientos de Trichoderma spp. algunos de los cuales aumentaron los porcentajes de semillas germinadas y la supervivencia de las plantas, aunque no significativamente desde el punto de vista estadístico. Uno de estos aislamientos, T. harzianum BAFC cult. N§ 742, indujo además un incremento significativo en el peso seco del vástago de las plantas. Se realizaron dos ensayos independientes con lechuga en los cuales se empleó el aislamiento mencionado anteriormente como antagonista, obteniéndose, en uno de los ensayos, una reducción no significativa en la incidencia de la enfermedad. Sin embargo, se observaron aumentos en la mayoría de los parámetros de crecimiento de la planta medidos, todos estadísticamente significativos. Se efectuaron otros dos ensayos empleando plantas de soja como hospedante, uno en invernadero y el otro a campo. En ambos se verificó un control significativo de la enfermedad en los tratamientos con la aplicación de T. harzianum BAFC cult. N§ 742. En cambio, no se registraron diferencias significativas en el desarrollo de las plantas en ninguno de los dos casos. Se realizaron dos ensayos de biocontrol más, empleando girasol como hospedante, de los cuales se extrajeron resultados significativos referentes al aumento en el desarrollo de las plantas y la reducción de la incidencia de la enfermedad producida por S. sclerotiorum. Los resultados se discuten en forma independiente por capítulos y finalmente en forma global.