Director(a):
Rossi, Rolando Carlos
Co-Director(a):
González-Lebrero, Rodolfo Martín
Jurado:
González Flecha, Francisco - Wolosiuk, Ricardo - Garda, Horacio
Institución otorgante:
Universidad de Buenos Aires.   Facultad de Farmacia y Bioquímica
Fecha de la defensa:
2014-10-29
Tipo de documento:
tesis doctoral - info:eu-repo/semantics/acceptedVersion
Grado alcanzado:
Doctor de la Universidad de Buenos Aires en Biofísica
Editor:
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica
Formato:
application/pdf  |   kb.   |  234 p.
Idioma:
español
Area Temática:
Palabras clave:
Descripción:
La Na+/K+-ATPasa es una enzima multimérica integral de la membrana plasmática de células animales. Su función es catalizar el trasporte activo de tres iones Na+ desde el citoplasma hacia el medio extracelular y de dos iones K+ en sentido inverso, empleando la energía proveniente de la hidrólisis de una molécula de ATP. Como consecuencia de su actividad, la Na+/K+ ATPasa juega un papel esencial en la homeostasis celular y diversos procesos de transporte.nDurante su funcionamiento la enzima alterna entre dos conformaciones (E1 y E2) que exponen sitios de unión hacia los lados intracelular y extracelular de la membrana, respectivamente, y que difieren en su afinidad por el Na+ y el K+. El transporte de los iones requiere que en algún momento éstos se encuentren ?ocluidos?, es decir, que sean inaccesibles desde ambos lados de la membrana. La liberación del K+ ocluido en E2 es el paso limitante del ciclo de reacciones, y es acelerada marcadamente por la unión de ATP a un sitio de baja afinidad, sin ser hidrolizado.nLa acción moduladora del ATP sobre la desoclusión de K+ ha sido extensamente estudiada, aunque en condiciones experimentales dispares. Por otro lado, se cuenta con información escasa y contradictoria sobre el efecto del nucleótido sobre la reacción inversa, que conduce a la oclusión de K+ a través de la llamada ruta directa, ya que la elevada velocidad de las reacciones involucradas limita el espectro de técnicas aplicables a su estudio. Como consecuencia, no se han propuesto modelos cinéticos detallados que expliquen de forma integral cómo el ATP ejerce sus efectos modulatorios, y que contribuyan a describir los pasos involucrados en el transporte de K+ en presencia del nucleótido.nCon el objeto de resolver esa falencia, en este trabajo nos hemos propuesto caracterizar cinéticamente tanto la desoclusión de Rb+ (uncongénere del K+) comosu oclusión a través de la ruta directa, en un amplio intervalo de concentraciones de Rb+ y de ATP. Para ello se empleó una técnica desarrollada en nuestro laboratorio que permite el estudio de reacciones en el rango de los milisegundos. Los experimentos mencionados se complementaron con el análisis de las modificaciones que el ATP induce en la cantidad de Rb+ ocluido en condiciones de equilibrio.nLos resultados mostraron que el ATP cambia de hiperbólica a sigmoide la curva de Rb+ ocluido en el equilibrio versus , induciendo a su vez una disminución de la afinidad aparente por el catión sin alterar la capacidad de oclusión de la Na+/K+ ATPasa. La cantidad de Rb+ ocluido extrapolada a una concentración infinita del catión correspondió a 2 moles de Rb+ por mol de enzima activa independientemente de la concentración de ATP.nLas curvas de incremento en el tiempo de la cantidad de Rb+ ocluido, tanto en presencia de ATP como en su ausencia, presentaron dos fases mayoritarias y alcanzaron un valor de equilibrio en aproximadamente un minuto. De dichas fases, la más rápida fue la de mayor amplitud, siendo esto más marcado en medios de reacción con ATP, y estuvo asociada a la oclusión de más de un Rb+. El nucleótido produjo una disminución o un aumento de la velocidad inicial de oclusión cuando la concentración de Rb+ fue menor o mayor que 500 ?M, respectivamente. No obstante, en todos los casos la velocidad de la segunda fase de oclusión fue mayor en presencia de ATP.nLa desoclusión de Rb+ en ausencia de ATP se produjo a lo largo de curvas bifásicas de amplitudes similares, compatibles con una liberación secuencial y ordenada de los cationes. El ATP hizo que se perdiera esa secuencialidad y que ambos cationes fueran liberados rápidamente, independientemente del sitio de oclusión que ocupaban. Se consiguió una adecuada descripción de la información experimental con un modelo que propone que la oclusión del Rb+ puede ocurrir desde accesos intra o extracelulares. En el primer caso la unión a los sitios ocurre al azar, mientras que en el segundo es secuencial y ordenada existiendo un paso lento entre la unión de ambos cationes. La unión de ATP a la enzima promueve el cambio conformacional E2 ? E1, desfavoreciendo la oclusión y favoreciendo la desoclusión de Rb+.
Descripción completa
Calificación:
Sobresaliente (10 Diez puntos)
Dictamen:
La tesis constituye un aporte valioso en la comprensión del rol que juegan el K+ y el ATP en el establecimiento del equilibrio iónico en las celulas, mediado por la Na+/K+ -ATPasa. El trabajo de tesis fue muy bien redactado, exponiendo claramente los aspectos relevantes de los experimentos y el modelo. La presentación oral fue clara y concisa, resaltando los fundamentos que permitieron arribar al modelo propuesto. El doctorando respondió con solvencia las preguntas formuladas por los miembros del jurado.
Identificador(es):
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=posgrauba&cl=CL1&d=HWA_793
Filiación Institucional:
Fil: Spiaggi, Alejandro Javier. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Química Biológica. Instituto de Química y Fisicoquímica Biológica; Argentina
Institución aportante:
Facultad de Farmacia y Bioquímica
Biblioteca cooperante:
Biblioteca de la Facultad de Farmacia y Bioquímica
Derechos:
info:eu-repo/semantics/openAccess
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/
Licencia de uso:
Licencia Creative Commons

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Cita bibliográfica:

Spiaggi, Alejandro Javier (2014-10-29). Caracterización de los pasos involucrados en el transporte de K+ por la Na+/K+-ATPasa  (tesis doctoral). Universidad de Buenos Aires.  Facultad de Farmacia y Bioquímica. [consultado:  ] Disponible en el Repositorio Digital Institucional de la Universidad de Buenos Aires:  <http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=posgrauba&cl=CL1&d=HWA_793>