Desarrollo, estandarización y aplicación de herramientas de tipificación molecular de poblaciones de Trypanosoma cruzi en muestras clínicas, vectores y reservorios de la enfermedad de Chagas

La infección por el parásito Trypanosoma cruzi, causante de la enfermedad de Chagas, es un importante problema de salud pública, principalmente en los países endémicos de América. Con una prevalencia estimada de 8 millones de personas infectadas, esta enfermedad muestra un curso clínico variable, desde asintomática hasta fases crónicas con manifestaciones clínicas. Las poblaciones naturales de T. cruzi están compuestas por clones múltiples, distribuidos en seis unidades discretas de tipificación (UDTs TcI-TcVI), de diferente distribución geográfica y circulación en los ciclos de transmisión. La relación entre las UDTs y los diferentes patrones de infectividad y patogenicidad, susceptibilidad a agentes quimioterapéuticos y manifestaciones clínicas, es actualmente sujeto de estudio. Se han desarrollado numerosos esquemas de tipificación de UDTs, con mayor o menor grado de complejidad y sensibilidad analítica, aunque no se ha definido aún un método certero de referencia. Con el objetivo de desarrollar un esquema sencillo de tipificación molecular, que involucre el menor número posible de reacciones de PCR secuenciales, en este trabajo de Tesis se han desarrollado y validado estrategias de PCR en tiempo real multiplex con sondas TaqMan, basadas en la detección de genes polimórficos nucleares y mitocondriales del parásito, que permitieron la caracterización de las seis UDTs de T. cruzi de manera altamente específica. El método desarrollado evidenció una sensibilidad analítica comparable a la del algoritmo de tipificación por PCR convencional utilizado en nuestro laboratorio, siendo capaz de caracterizar correctamente al 100% de las cepas de referencia de T. cruzi y a un elevado porcentaje de las muestras biológicas analizadas. El esquema de PCR TaqMan identificó más eficientemente a las UDTs presentes en muestras con elevada carga parasitaria, derivadas de triatominos, reservorios, pacientes con infección aguda o congénita, o con reactivación de la enfermedad de Chagas, mientras que evidenció limitaciones en la tipificación de muestras provenientes de pacientes crónicos. Una de las estrategias del nuevo algoritmo fue adaptada para la cuantificación de ADN genómico o carga parasitaria en forma específica de UDT. Por otro lado, se ha diseñado y validado una metodología de PCR en tiempo real dúplex para el diagnóstico diferencial de T. cruzi y T. rangeli, potencialmente aplicable en las regiones co-endémicas para ambos tripanosomátidos. Las nuevas metodologías de PCR en tiempo real, como así también las estrategias tradicionales de PCR convencional, fueron aplicadas en la caracterización de las UDTs de T. cruzi y en el diagnóstico diferencial con T. rangeli en distintos escenarios eco-epidemiológicos y clínicos de las regiones endémicas. Por otra parte, se realizó un estudio sobre la diversidad genética dentro de las Udas TcI y TcIII. En este sentido, y en base a estudios previos realizados en Colombia utilizando la secuencia intergénica del miniexón (SL-IR), se extendió la caracterización de los genotipos de TcI a muestras procedentes de trece países del continente americano. El aporte principal del trabajo consistió en la identificación de un nuevo grupo de genotipos, no descripto hasta el momento, TcIe, y la realización de un análisis detallado de la distribución de los grupos TcIa-TcIe en los diferentes ciclos de transmisión y regiones geográficas. El estudio de aislamientos y clones de TcIII confirmó la variabilidad de secuencia en el gen multicopia SL-IR dentro del genoma de T. cruzi.

Natural populations of Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease, are composed of multiple clones, classified into 6 discrete typing units (DTUs TcI-TcVI), with different distribution in geographical regions and transmission cycles. In certain areas of South America, T. cruzi and Trypanosoma rangeli (related trypanosome specie) infections frequently overlap, and differential diagnosis by conventional techniques is often complicated. In this work, new real time PCR algorithms for the identification of the six T. cruzi DTUs, and the differential detection of T. cruzi and T. rangeli, directly in biological samples using TaqMan probes, have been developed and validated. These methods, which involve one or two sequential PCR reactions, depending on the DTU being analyzed, showed a high specificity and an analytical sensitivity comparable with conventional typing methods used in our laboratory. The new methods were used for the characterization of strains and samples derived from different eco-epidemiological and clinical scenarios. Furthermore, we have studied the genetic diversity within TcI and TcIII using the intergenic sequence of the miniexón gene.