Rol de los ARN no codificantes en la respuesta al estrés oxidativo en condiciones fisiológicas y en el cáncer

ARNs no codificantes largos transcriptos a partir de los telómeros, conocidos como TERRA (telomeric repeat-containing RNA), se asocian a la estabilidad telomérica y genómica. Están aumentados en tejidos tumorales humanos y murinos, aunque poco se sabe sobre los mecanismos que subyacen dicho aumento y las funciones que cumplen. El estrés oxidativo daña biomoléculas y activa vías de señalización asociadas a la proliferación celular, angiogénesis, apoptosis y metástasis. Los telómeros son regiones del genoma especialmente susceptibles a sufrir daño oxidativo y se ha reportado que la inflamación crónica in vivo induce disfunción telomérica por sobreproducción de ROS vía COX-2, lo cual es revertido por tratamiento antiinflamatorio ó antioxidante. Consecuentemente, los objetivos de este trabajo de Tesis fueron caracterizar la expresión de los TERRA frente al estrés oxidativo, determinar los mecanismos involucrados y evaluar su relevancia en la progresión tumoral. Se observa que los TERRA se inducen a las 4 h de tratamiento con los agentes oxidantes H2O2, NaAsO2 ó butionina sulfoximina en células renales embrionarias humanas HEK-293T. El uso del antioxidante N-acetil-L-cisteína previene dicho aumento. Se ha demostrado que hay aumento de ROS en el tejido adiposo pardo de ratones expuestos al frío, pero no en el blanco. En el presente trabajo se reporta que los TERRA se inducen sólo en el tejido adiposo pardo de ratones C57BL/6J luego de 4h de ser expuestos al frío, siendo esta la primer evidencia experimental que los TERRA se inducen in vivo en una condición fisiológica que cursa con aumento de ROS. Por ChIP se evidenció que el H2O2 induce aumento de las marcas de histonas y proteínas asociadas a activa transcripción en la región subtelomérica de las HEK-293T, donde se hallan los promotores de los TERRA. Ensayos de RIP muestran que los TERRA interactúan con las proteínas HP1?/?, ambas reclutadas al subtelómero. Ensayos de inmunoprecipitación para estas proteínas sugieren que sólo HP1? interactúa con la maquinaria transcripcional. Se encuentra descripto que las proteínas del poro nuclear (Nups) se asocian a genes transcripcionalmente activos, desconociéndose los factores que median su interacción con la cromatina. En este trabajo se evidenciaron a las Nups presentes en complejo con HP1? y reclutadas al subtelómero tanto antes como después de la exposición al H2O2, sugiriendo que intervienen en la expresión de los TERRA por medio de HP1?. La inducción de los TERRA se revierte 1-2 h luego de haber quitado el H2O2 del medio de cultivo. Esta expresión dinámica de los TERRA sugiere que ejercen un rol protector. En línea con esta idea, se observa una rápida inducción de TERRAs frente a un segundo desafío con H2O2. Ensayos de ChIP sugieren que esto es posible gracias a que se conservan en la región subtelomérica las marcas epigenéticas que favorecen la transcripción luego de la primera exposición transitoria al H2O2, dejándolos ?preparados? para que sean transcriptos. H89, un inhibidor de la PKA, bloquea la inducción de los TERRA por exposición al H2O2, sugiriendo que PKA controla su expresión. El uso de drogas que alteran la estabilidad de los microtúbulos modula los niveles de los TERRA, al igual que ocurre cuando se cultivan células sobre superficies de diferente rigidez para modificar la disposición del citoesqueleto. También se observa modulación de TERRAs durante la miogénesis, proceso en el que hay una reorganización dramática del citoesqueleto. De hecho, los rearreglos del citoesqueleto en células NMuMG que atraviesan la transición epitelio-mesenquimal (TEM) por tratamiento con TGF?1, se asocian a inducción de TERRAs y a ausencia de respuesta al H2O2, tal como ocurre en las células de adenocarcinoma mamario T47D que presentan disfunción telomérica, evidenciado por microscopía confocal. En su conjunto, los resultados aportan evidencias que los TERRA se inducen por estrés oxidativo y durante la TEM, señalando su potencial utilidad como marcadores tempranos de progresión tumoral.

Long non-coding RNAs transcribed from telomeres, known as TERRA (telomeric repeat-containing RNA), are associated with telomere and genome stability. TERRA expression is elevated in human cancer tissues, however little is known about their function. Oxidative stress damages biomolecules and activates signaling cascades involved in cell proliferation, apoptosis, and metastasis. Since telomeres are prone to oxidative damage leading to their dysfunction, the objective of the present work is to characterize TERRA expression in oxidative stress, the mechanisms involved and its relevance in EMT. H2O2 induces TERRA expression in HEK-293T cells, and is prevented by antioxidant treatment. It was reported ROS are increased in brown (BAT) but not in white adipose tissue of mice exposed to cold. Importantly, we found increased TERRAs only in BAT of mice exposed to cold. In HEK-293T cells exposed to H2O2, ChIP shows that chromatin landscape is modified favoring telomere transcription. TERRAs interact with HP1?/?, both proteins found recruited to subtelomeres. HP1? interacts with transcriptional machinery and nuclear pore complex proteins, suggesting they are involved in TERRA regulation. TERRA induction is lost 1-2h after removal of H2O2 from culture medium, suggesting they have protective functions. This is supported by rapid increase of TERRA upon a second H2O2 challenge. PKA inhibitor H89 blocks the increase of TERRA induced by H2O2, suggesting that PKA controls TERRA induction. Treatment of cells with drugs that disturb cytoskeleton integrity or growing cells on surfaces of different stiffness that generate differential cytoskeleton organization also modifies TERRA levels. In fact, cytoskeleton rearrangements of EMTtransformed NMuMG cells associate with higher TERRAs and lack response to H2O2, mimicking what occurs in breast cancer cells that exhibit telomere dysfunction evidenced by confocal microscopy. In summary, we show that TERRAs are induced in response to oxidative stress and during EMT, being potentially novel early markers of cancer progression.