Expresión recombinante del autoantígeno ZnT8 y su aplicación en la detección y caracterización de anticuerpos en distintas formas de Diabetes Mellitus Autoinmune.

El descubrimiento de la isoforma 8 del Transportador de Zinc (ZnT8) como el cuarto autoantígeno inmunodominante involucrado en la Diabetes Mellitus (DM) autoinmune, provee un recurso adicional para el estudio de la incidencia y progresión de la enfermedad. La determinación de autoanticuerpos anti-ZnT8 (ZnT8A) junto con otros marcadores inmunológicos, aumenta la sensibilidad de detección de autoinmunidad en pacientes con DM tipo 1 así como en la población de riesgo (familiares en primer grado de pacientes con DM tipo 1). Asimismo, dado que el ZnT8 es un antígeno estructural de la célula ? pancreática, la presencia de ZnT8A revela indirectamente un daño celular específico. El estudio de los marcadores humorales resulta interesante para investigar las bases etiopatogénicas, y permiten distinguir las formas de DM asociadas a autoinmunidad. El diagnóstico preciso y la terapia adecuada y oportuna son elementos críticos para lograr un buen control metabólico evitando la aparición de complicaciones de la enfermedad. Los métodos radiométricos de referencia utilizados para la detección de los marcadores humorales de DM son ensayos de alta sensibilidad y especificidad, pero presentan altos costos, requieren de material radiactivo que generan residuos altamente contaminantes del medioambiente y su ejecución se limita a centros de investigación básica y aplicada que cuenten con la infraestructura y habilitación necesaria. Por lo tanto, es imprescindible el desarrollo de nuevas generaciones de ensayos no radiométricos de menor costo y complejidad operativa, que permitan mayor aplicación en laboratorios de mediana/baja complejidad y faciliten el acceso diagnóstico a un mayor número de pacientes, permitiendo implementar el tratamiento adecuado. En este contexto, los objetivos generales del presente trabajo de Tesis fueron: -Básicos: detección y caracterización de los ZnT8A provenientes de muestras de pacientes con distintos fenotipos clínicos de DM. El propósito final fue definir el perfil diferencial de inmunorreactividades (mapeo de epitopes) de los ZnT8A frente a distintas variantes antigénicas recombinantes producidas in vitro y los parámetros termodinámicos de interacción primaria (concentración -q- y constante de afinidad -Ka-). -Aplicados: desarrollo e implementación de inmunoensayos de alta sensibilidad y baja complejidad operativa para el screening rutinario del marcador ZnT8A. En la primera etapa se estudió la prevalencia de ZnT8A, en comparación con los otros marcadores de DM autoinmune -IAA/PAA, GADA e IA-2A- en tres grupos de pacientes con distintos fenotipos clínicos de DM. A partir de los resultados obtenidos, se demostró que ZnT8A constituye un marcador humoral adicional a la tríada ya existente, incrementando la sensibilidad diagnóstica de autoinmunidad. El principal epitope de ZnT8 involucrado en el reconocimiento de los autoanticuerpos se localiza en el dominio C-terminal de la molécula (aminoácidos 268-369), región en la que existen dos variantes polimórficas en el residuo 325. Así, se lograron diferenciar subpoblaciones de autoanticuerpos según sus inmunorreactividades frente a diferentes variantes antigénicas de ZnT8, alcanzando una caracterización inmunoquímica más exhaustiva de los ZnT8A. La construcción heterodimércia del dominio C-terminal de ZnT8 fue la variante antigénica que presentó la mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario del marcador ZnT8A en los distintos grupos de pacientes estudiados. A partir de los resultados obtenidos en la primera etapa y teniendo en cuenta que el desarrollo de inmunoensayos no radiométricos para la detección de ZnT8A requería del autoantígeno recombinante en grandes cantidades a un costo razonable, se procedió a la expresión de la construcción heterodimérica de ZnT8 en E. coli cepas GI698 y GI724, empleando la estrategia de síntesis acoplada a Trx. La quimera TrxZnT8 se recuperó de la fracción intracelular soluble y de los cuerpos de inclusión con un excelente comportamiento inmunoquímico validado por diversos estudios de unión a ZnT8A. Dado que la proteína obtenida de cuerpos de inclusión presentó un mayor grado de pureza y un mejor rendimiento se decidió seguir trabajando con la misma. Contando con el autoantígeno recombinante TrxZnT8 y con el objetivo de caracterizar la respuesta inmune humoral especifica de ZnT8A en términos de q y Ka, se realizaron radioinmunoensayos con sueros de pacientes con DM tipo 1 y pacientes diabéticos diagnosticados en edad adulta. Al evaluar las muestras de ambos grupos, se observó que los pacientes infanto-juveniles con DM tipo 1 presentaron menores q y mayores Ka de ZnT8A que los adultos, sugiriendo la existencia de un camino etiopatogénico distinto entre ambos fenotipos clínicos de la enfermedad. Posteriormente se procedió a la optimización de ensayos no radiométricos en fase sólida para la determinación de ZnT8A. Así se desarrollaron dos métodos en fase sólida basados en el modelo doble paratope: dp-piELISA y FloCMIA, con diferencias en la fase sólida empleada (microplaca o microesferas) y en el sistema de detección (colorimétrico o fluorométrico). Ambos ensayos presentaron parámetros analíticos adecuados para ser considerados como métodos para el screening rutinario de ZnT8A. Dado que el inmunoensayo basado en Citometría de Flujo empleando microesferas de poliestireno presentó una muy buena especificidad y sensibilidad, así como también un mayor rango dinámico que los ensayos de tipo ELISA, puede considerarse como un método alternativo candidato para reemplazar al RBA. Asimismo, se destaca su potencial aplicación en la medición simultánea y discriminativa de varios marcadores relacionados con DM autoinmune empleando microesferas de distintos tamaños o fluorescencia interna (diferenciables en el Citómetro de Flujo) adsorbidas con distintos autoantígenos. De esta manera, las metodologías desarrolladas de autoinmunidad. El principal epitope de ZnT8 involucrado en el reconocimiento de los autoanticuerpos se localiza en el dominio C-terminal de la molécula (aminoácidos 268-369), región en la que existen dos variantes polimórficas en el residuo 325. Así, se lograron diferenciar subpoblaciones de autoanticuerpos según sus inmunorreactividades frente a diferentes variantes antigénicas de ZnT8, alcanzando una caracterización inmunoquímica más exhaustiva de los ZnT8A. La construcción heterodimércia del dominio C-terminal de ZnT8 fue la variante antigénica que presentó la mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario del marcador ZnT8A en los distintos grupos de pacientes estudiados. A partir de los resultados obtenidos en la primera etapa y teniendo en cuenta que el desarrollo de inmunoensayos no radiométricos para la detección de ZnT8A requería del autoantígeno recombinante en grandes cantidades a un costo razonable, se procedió a la expresión de la construcción heterodimérica de ZnT8 en E. coli cepas GI698 y GI724, empleando la estrategia de síntesis acoplada a Trx. La quimera TrxZnT8 se recuperó de la fracción intracelular soluble y de los cuerpos de inclusión con un excelente comportamiento inmunoquímico validado por diversos estudios de unión a ZnT8A. Dado que la proteína obtenida de cuerpos de inclusión presentó un mayor grado de pureza y un mejor rendimiento se decidió seguir trabajando con la misma. Contando con el autoantígeno recombinante TrxZnT8 y con el objetivo de caracterizar la respuesta inmune humoral especifica de ZnT8A en términos de q y Ka, se realizaron radioinmunoensayos con sueros de pacientes con DM tipo 1 y pacientes diabéticos diagnosticados en edad adulta. Al evaluar las muestras de ambos grupos, se observó que los pacientes infanto-juveniles con DM tipo 1 presentaron menores q y mayores Ka de ZnT8A que los adultos, sugiriendo la existencia de un camino etiopatogénico distinto entre ambos fenotipos clínicos de la enfermedad. Posteriormente se procedió a la optimización de ensayos no radiométricos en fase sólida para la determinación de ZnT8A. Así se desarrollaron dos métodos en fase sólida basados en el modelo doble paratope: dp-piELISA y FloCMIA, con diferencias en la fase sólida empleada (microplaca o microesferas) y en el sistema de detección (colorimétrico o fluorométrico). Ambos ensayos presentaron parámetros analíticos adecuados para ser considerados como métodos para el screening rutinario de ZnT8A. Dado que el inmunoensayo basado en Citometría de Flujo empleando microesferas de poliestireno presentó una muy buena especificidad y sensibilidad, así como también un mayor rango dinámico que los ensayos de tipo ELISA, puede considerarse como un método alternativo candidato para reemplazar al RBA. Asimismo, se destaca su potencial aplicación en la medición simultánea y discriminativa de varios marcadores relacionados con DM autoinmune empleando microesferas de distintos tamaños o fluorescencia interna (diferenciables en el Citómetro de Flujo) adsorbidas con distintos autoantígenos. De esta manera, las metodologías desarrolladas deautoinmunidad. El principal epitope de ZnT8 involucrado en el reconocimiento de los autoanticuerpos se localiza en el dominio C-terminal de la molécula (aminoácidos 268-369), región en la que existen dos variantes polimórficas en el residuo 325. Así, se lograron diferenciar subpoblaciones de autoanticuerpos según sus inmunorreactividades frente a diferentes variantes antigénicas de ZnT8, alcanzando una caracterización inmunoquímica más exhaustiva de los ZnT8A. La construcción heterodimércia del dominio C-terminal de ZnT8 fue la variante antigénica que presentó la mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario del marcador ZnT8A en los distintos grupos de pacientes estudiados. A partir de los resultados obtenidos en la primera etapa y teniendo en cuenta que el desarrollo de inmunoensayos no radiométricos para la detección de ZnT8A requería del autoantígeno recombinante en grandes cantidades a un costo razonable, se procedió a la expresión de la construcción heterodimérica de ZnT8 en E. coli cepas GI698 y GI724, empleando la estrategia de síntesis acoplada a Trx. La quimera TrxZnT8 se recuperó de la fracción intracelular soluble y de los cuerpos de inclusión con un excelente comportamiento inmunoquímico validado por diversos estudios de unión a ZnT8A. Dado que la proteína obtenida de cuerpos de inclusión presentó un mayor grado de pureza y un mejor rendimiento se decidió seguir trabajando con la misma. Contando con el autoantígeno recombinante TrxZnT8 y con el objetivo de caracterizar la respuesta inmune humoral especifica de ZnT8A en términos de q y Ka, se realizaron radioinmunoensayos con sueros de pacientes con DM tipo 1 y pacientes diabéticos diagnosticados en edad adulta. Al evaluar las muestras de ambos grupos, se observó que los pacientes infanto-juveniles con DM tipo 1 presentaron menores q y mayores Ka de ZnT8A que los adultos, sugiriendo la existencia de un camino etiopatogénico distinto entre ambos fenotipos clínicos de la enfermedad. Posteriormente se procedió a la optimización de ensayos no radiométricos en fase sólida para la determinación de ZnT8A. Así se desarrollaron dos métodos en fase sólida basados en el modelo doble paratope: dp-piELISA y FloCMIA, con diferencias en la fase sólida empleada (microplaca o microesferas) y en el sistema de detección (colorimétrico o fluorométrico). Ambos ensayos presentaron parámetros analíticos adecuados para ser considerados como métodos para el screening rutinario de ZnT8A. Dado que el inmunoensayo basado en Citometría de Flujo empleando microesferas de poliestireno presentó una muy buena especificidad y sensibilidad, así como también un mayor rango dinámico que los ensayos de tipo ELISA, puede considerarse como un método alternativo candidato para reemplazar al RBA. Asimismo, se destaca su potencial aplicación en la medición simultánea y discriminativa de varios marcadores relacionados con DM autoinmune empleando microesferas de distintos tamaños o fluorescencia interna (diferenciables en el Citómetro de Flujo) adsorbidas con distintos autoantígenos. De esta manera, las metodologías desarrolladas deautoinmunidad. El principal epitope de ZnT8 involucrado en el reconocimiento de los autoanticuerpos se localiza en el dominio C-terminal de la molécula (aminoácidos 268-369), región en la que existen dos variantes polimórficas en el residuo 325. Así, se lograron diferenciar subpoblaciones de autoanticuerpos según sus inmunorreactividades frente a diferentes variantes antigénicas de ZnT8, alcanzando una caracterización inmunoquímica más exhaustiva de los ZnT8A. La construcción heterodimércia del dominio C-terminal de ZnT8 fue la variante antigénica que presentó la mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario del marcador ZnT8A en los distintos grupos de pacientes estudiados. A partir de los resultados obtenidos en la primera etapa y teniendo en cuenta que el desarrollo de inmunoensayos no radiométricos para la detección de ZnT8A requería del autoantígeno recombinante en grandes cantidades a un costo razonable, se procedió a la expresión de la construcción heterodimérica de ZnT8 en E. coli cepas GI698 y GI724, empleando la estrategia de síntesis acoplada a Trx. La quimera TrxZnT8 se recuperó de la fracción intracelular soluble y de los cuerpos de inclusión con un excelente comportamiento inmunoquímico validado por diversos estudios de unión a ZnT8A. Dado que la proteína obtenida de cuerpos de inclusión presentó un mayor grado de pureza y un mejor rendimiento se decidió seguir trabajando con la misma. Contando con el autoantígeno recombinante TrxZnT8 y con el objetivo de caracterizar la respuesta inmune humoral especifica de ZnT8A en términos de q y Ka, se realizaron radioinmunoensayos con sueros de pacientes con DM tipo 1 y pacientes diabéticos diagnosticados en edad adulta. Al evaluar las muestras de ambos grupos, se observó que los pacientes infanto-juveniles con DM tipo 1 presentaron menores q y mayores Ka de ZnT8A que los adultos, sugiriendo la existencia de un camino etiopatogénico distinto entre ambos fenotipos clínicos de la enfermedad. Posteriormente se procedió a la optimización de ensayos no radiométricos en fase sólida para la determinación de ZnT8A. Así se desarrollaron dos métodos en fase sólida basados en el modelo doble paratope: dp-piELISA y FloCMIA, con diferencias en la fase sólida empleada (microplaca o microesferas) y en el sistema de detección (colorimétrico o fluorométrico). Ambos ensayos presentaron parámetros analíticos adecuados para ser considerados como métodos para el screening rutinario de ZnT8A. Dado que el inmunoensayo basado en Citometría de Flujo empleando microesferas de poliestireno presentó una muy buena especificidad y sensibilidad, así como también un mayor rango dinámico que los ensayos de tipo ELISA, puede considerarse como un método alternativo candidato para reemplazar al RBA. Asimismo, se destaca su potencial aplicación en la medición simultánea y discriminativa de varios marcadores relacionados con DM autoinmune empleando microesferas de distintos tamaños o fluorescencia interna (diferenciables en el Citómetro de Flujo) adsorbidas con distintos autoantígenos. De esta manera, las metodologías desarrolladas de autoinmunidad. El principal epitope de ZnT8 involucrado en el reconocimiento de los autoanticuerpos se localiza en el dominio C-terminal de la molécula (aminoácidos 268-369), región en la que existen dos variantes polimórficas en el residuo 325. Así, se lograron diferenciar subpoblaciones de autoanticuerpos según sus inmunorreactividades frente a diferentes variantes antigénicas de ZnT8, alcanzando una caracterización inmunoquímica más exhaustiva de los ZnT8A. La construcción heterodimércia del dominio C-terminal de ZnT8 fue la variante antigénica que presentó la mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario del marcador ZnT8A en los distintos grupos de pacientes estudiados. A partir de los resultados obtenidos en la primera etapa y teniendo en cuenta que el desarrollo de inmunoensayos no radiométricos para la detección de ZnT8A requería del autoantígeno recombinante en grandes cantidades a un costo razonable, se procedió a la expresión de la construcción heterodimérica de ZnT8 en E. coli cepas GI698 y GI724, empleando la estrategia de síntesis acoplada a Trx. La quimera TrxZnT8 se recuperó de la fracción intracelular soluble y de los cuerpos de inclusión con un excelente comportamiento inmunoquímico validado por diversos estudios de unión a ZnT8A. Dado que la proteína obtenida de cuerpos de inclusión presentó un mayor grado de pureza y un mejor rendimiento se decidió seguir trabajando con la misma. Contando con el autoantígeno recombinante TrxZnT8 y con el objetivo de caracterizar la respuesta inmune humoral especifica de ZnT8A en términos de q y Ka, se realizaron radioinmunoensayos con sueros de pacientes con DM tipo 1 y pacientes diabéticos diagnosticados en edad adulta. Al evaluar las muestras de ambos grupos, se observó que los pacientes infanto-juveniles con DM tipo 1 presentaron menores q y mayores Ka de ZnT8A que los adultos, sugiriendo la existencia de un camino etiopatogénico distinto entre ambos fenotipos clínicos de la enfermedad. Posteriormente se procedió a la optimización de ensayos no radiométricos en fase sólida para la determinación de ZnT8A. Así se desarrollaron dos métodos en fase sólida basados en el modelo doble paratope: dp-piELISA y FloCMIA, con diferencias en la fase sólida empleada (microplaca o microesferas) y en el sistema de detección (colorimétrico o fluorométrico). Ambos ensayos presentaron parámetros analíticos adecuados para ser considerados como métodos para el screening rutinario de ZnT8A. Dado que el inmunoensayo basado en Citometría de Flujo empleando microesferas de poliestireno presentó una muy buena especificidad y sensibilidad, así como también un mayor rango dinámico que los ensayos de tipo ELISA, puede considerarse como un método alternativo candidato para reemplazar al RBA. Asimismo, se destaca su potencial aplicación en la medición simultánea y discriminativa de varios marcadores relacionados con DM autoinmune empleando microesferas de distintos tamaños o fluorescencia interna (diferenciables en el Citómetro de Flujo) adsorbidas con distintos autoantígenos. De esta manera, las metodologías desarrolladas de menor complejidad operativa respecto del método radiométrico de referencia estimulan la descentralización de las determinaciones de ZnT8A, ampliando el acceso diagnóstico a un número mayor de pacientes.