Endotelina-1 y -3 : efectos moduladores sobre el transportador neuronal de noradrenalina en el hipotálamo de rata. Receptores y vías intracelulares involucradas

En el presente trabajo de tesis, demostramos que las endotelinas-1 y -3 (ET-1 y ET-3) se comportan como neuropéptidos moduladores de la actividad del transportador de noradrenalina (NET) en el hipotálamo anterior y posterior de ratas normotensas. La regulación del mismo por las ETs es compleja e involucra diferentes subtipos de receptores de ETs, incluyendo los llamados no convencionales o atípicos y múltiples vías de señalización. En el hipotálamo anterior se observa que la ET-1 disminuye la captación neuronal de noradrenalina (NA) a expensas de la reducción de la actividad del NET debido a una disminución en los sitios de unión. Las modificaciones producidas en la actividad del NET son específicamente sobre la capacidad máxima de transporte de NA o sea número de transportadores funcionales sin alterar su afinidad. El efecto inhibitorio de la ET-1 es mediado por el receptor ETB e involucra diferentes vías que incluyen la NOS neuronal, la PKA y la PKC. En general estas vías activan los sitios de fosforilación del transportador en los aminoácidos serina y tirosina interactuando entre Sintaxina A1 y NET. Esto produce la regulación del transportador en la superficie neuronal aumentando la internalización del NET, por lo tanto disminuye su número en la membrana de la terminal nerviosa. En esta misma región hipotalámica, la ET-3 incrementa la captación neuronal de NA por aumento de la actividad del NET debido a un incremento del número de transportadores expresados en la membrana de la neurona. Este efecto se basa en una movilización del NET desde los compartimentos intracelulares hacia la superficie de la membrana. Este neuropéptido ejercería su efecto a través de la activación de un receptor atípico o no convencional el cual está acoplado a una proteína G. La activación del complejo receptor atípico/proteína G involucra diferentes mecanismos intracelulares Ca2+ dependientes. En el hipotálamo posterior, ambos neuropéptidos disminuyen la captación neuronal de NA a expensas de la reducción de la actividad del NET como consecuencia de una disminución en los sitios de unión. Este efecto es consecuencia de un incremento en la internalización del transportador desde la superficie de la membrana neuronal hacia los depósitos intracelulares. En el caso de la ET-1 el efecto inhibitorio es mediado por el receptor ETB unido a proteína G y la ET-3 a través de la activación de un receptor atípico o no convencional el cual está acoplado a una proteína G. En ambas situaciones, independientemente del receptor que se active, el efecto inhibitorio de ambas ETs involucra diferentes vías intracelulares que incluyen a la NOS neuronal, PKA y PKC. Esto produciría el mismo efecto descripto previamente en el caso de la ET-1 en el hipotálamo anterior. Sobre la base de los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral sumado a los trabajos previos de nuestro grupo permiten demostrar contundentemente que tanto la ET-1 como la ET-3 se comportan como neuromoduladores de la transmisión noradrenérgica en el hipotálamo anterior como en el posterior, de animales normotensos, a través de la regulación de tres procesos importantes, la actividad del NET, la regulación de la liberación neuronal de NA y la actividad y expresión de la tirosina hidroxilasa. Por lo tanto, y a la luz de todos estos resultados, podemos inferir que los efectos producidos por las ETs a nivel central sobre la fisiología cardiovascular son consecuencia de la reducción en la simpatoinhibición a nivel del hipotálamo anterior y un incremento de la simpatoexitación del hipotálamo posterior. Todo esto daría respuesta al aumento de la actividad simpática central, producido por las ETs, que fuera observado por diversos autores.

In this thesis, we show that endothelin-1 and -3 (ET-1 and ET-3) behave as neuropeptides regulating the activity of the norepinephrine transporter (NET) in the anterior and posterior hypothalamus of normotensive rats. The regulation is complex and involves different ET receptor subtypes, including the so called non-conventional or atypical receptors as well as multiple signaling pathways. In the anterior hypothalamus ET-1 reduces neuronal norepinephrine (NE) uptake by decreasing the number of functional transporters without altering its affinity. The inhibitory effect of ET-1 is mediated by ETB receptors and involves different signaling pathways including NOS, PKA and PKC. These pathways induce the phosphorylation at serine a tyrosine sites which favor NET interaction with syntaxin A1 leading to NET internalization and thereby decreasing the number of binding site at the membrane surface of nerve terminals. Nevertheless, in the same hypothalamic region, ET-3 increases neuronal NE uptake and thus NET activity by increasing the number of transporters available at the neuronal membrane. This occurs as the result of NET mobilization from intracellular compartments to the membrane surface. ET-3 exerts its effect through the activation of an atypical or non-conventional ET receptor which is coupled to a G protein. The activation of atypical ET receptor / G protein involves different intracellular calcium-dependent mechanisms. In the posterior hypothalamus both endothelins decrease NE uptake by reducing NET activity as the result of diminished binging sites at the neuronal membrane. This is achieved because both endothelins favor NET internalization to intracellular compartments. ET-1 response is mediated by ETB receptors whereas that of ET-3 by the activation of an atypical or nonconventional ET receptor coupled to a G protein. Regardless which receptor is activated, both endothelins activate the same intracellular pathways including neuronal NOS, PKA and PKC leading to the same response as that of ET-1 in the anterior hypothalamus. Present findings together with previous studies from our laboratory strongly support that both ET-1 and ET-3 behave as neuromodulators of noradrenergic transmission in the in the anterior and posterior hypothalamus of normotensive rats through the regulation of three major steps: NET activity (as shown in the present thesis), neuronal NE release and tyrosine hydroxylase activity and expression. In the light of these results we propose that the regulation of cardiovascular physiology induced by brain ETs is mediated by the decreased sympathoinhibition of the anterior hypothalamus and the increased sympathoexcitation of the anterior hypothalamus. Thus, our findings may explain the net increase in the central sympathetic activity mediated by ETs described by several authors.