Nueva generación de inmunoensayos basados en citometría de flujo para la detección simultánea de autoanticuerpos : aplicación al apoyo diagnóstico en diabetes mellitus autoinmune

En el área de DM autoinmune, es imprescindible el desarrollo de metodologías de menor costo y complejidad operativa respecto de los ensayos radiométricos de referencia, que permitan mayor aplicación y difusión en laboratorios de mediana/baja complejidad y faciliten el acceso al diagnóstico correcto a un mayor número de pacientes, permitiendo implementar el tratamiento adecuado. En este contexto, el objetivo general del presente trabajo fue el desarrollo y optimización de inmunoensayos basados en Citometría de Flujo (FloCMIA) altamente sensibles y semicuantitativos para la determinación simultánea y discriminativa de los principales marcadores de DM Autoinmune: GADA e IA-2A. En la primera etapa se encaró el desarrollo de 3 protocolos alternativos de FloCMIA basados en diferentes diseños para la determinación de autoanticuerpos anti-GAD (GADA) empleando microesferas de 4 ?m como fase sólida y diferentes reactivos conjugados a fluorocromos. Se evaluó su performance analítica en pacientes con DM autoinmune provenientes del servicio analítico STAN-CONICET. En el protocolo A se aplicó un modelo indirecto, mientras que en el protocolo B se ensayó la amplificación de la señal fluorescente asociada al modelo anterior por la incorporación del sistema de amplificación avidina-biotina. Sin embargo, estos diseños no reunieron las condiciones adecuadas para aplicarse en la clínica rutinaria. El protocolo C se basó en el modelo de doble paratope, el cual es internacionalmente aceptado para la detección de autoanticuerpos en DM autoinmune. De hecho, la mejor performance analítica se logró con este modelo de FloCMIA y se expandió su aplicación a un grupo de muestras de pacientes infanto-juveniles con DMT1. Este protocolo constituyó una alternativa innovadora, rentable y de menor complejidad operativa en comparación a la determinación tradicional de GADA por RBA y/o dpELISA en pacientes con DM autoinmune. El desarrollo de los inmunoensayos para la detección de autoanticuerpos anti-IA-2 (IA-2A) requería de una fuente del autoantígeno recombinante de fácil producción. Para ello, se aplicó el sistema de expresión procariota en las cepas GI698 y GI724 de E. coli empleando la estrategia de síntesis acoplada a Trx. Este enfoque permitió obtener a la proteína TrxIA-2ic a partir de la FSI de la cepa GI724 con alto rendimiento, correctamente plegada y con alta estabilidad durante su almacenamiento. TrxIA-2ic demostró un excelente comportamiento inmunoquímico validado por diversos estudios de unión a IA-2A. A partir de los resultados obtenidos se procedió a la optimización de ensayos no radiométricos en fase sólida para la determinación de IA-2A en pacientes con DMT1. Entre los modelos ensayados, el bcELISA, basado en un modelo indirecto para la detección de anticuerpos con revelado colorimétrico, no presentó una performance adecuada para poder aplicarse en el laboratorio de apoyo diagnóstico diabetológico. Sin embargo, QL-dpELISA y el protocolo C de FloCMIA aplicado a la determinación de IA-2A, basados en el modelo de doble paratope con variaciones en la fase sólida empleada (microplaca o microesferas de 5 ?m) y el sistema de detección del inmunocomplejo (quimioluminiscencia o fluorescencia), presentaron parámetros analíticos mejorados permitiendo considerarlos como métodos alternativos candidatos para reemplazar al RBA. Contando con los 2 autoantígenos recombinantes principales vinculados a DMT1 (TrxGAD y TrxIA-2ic), expresados en forma recombinante en E. coli en gran cantidad y correctamente plegados, se pudieron desarrollar el diseño de FloCMIA multiplex (de menor costo y complejidad operativa respecto de los métodos radiométricos de referencia) empleando la discriminación por tamaño de microesferas, para la determinación simultánea y discriminativa de GADA e IA-2A en pacientes con DMT1. El FloCMIA multiplex no sólo presentó una excelente performance analítica, sino que evidenció un mayor número de pacientes con autoinmunidad que cuando se ejecutó cada RBA por separado. Asimismo, constituyó una alternativa menos costosa y compleja y se evitó el uso de material radiactivo. Los resultados obtenidos demostraron que FloCMIA multiplex es una buena alternativa para aplicar tanto en programas de predicción y prevención de la DMT1, como en el apoyo diagnóstico de autoinmunidad de distintas formas clínicas de DM, permitiendo instaurar el tratamiento adecuado en los pacientes. Asimismo, la metodología desarrollada de menor complejidad operativa respecto al RBA estimula la descentralización de las determinaciones, ampliando el acceso al diagnóstico a un número mayor de pacientes.