Efectos inmunomodulatorios de Enterococcus faecalis CECT7121 : estudios sobre la inmunidad innata y su influencia en la respuesta adaptativa

Enterococcus faecalis CECT7121 es una bacteria de origen ambiental que ha demostrado modular la respuesta inmune en diversos modelos biológicos, convirtiéndose en un atractivo candidato a ser empleado como microorganismo probiótico. Sin embargo, aún es necesario definir los mecanismos a través de los cuales ejerce sus efectos inmunomodulatorios. En el presente trabajo de Tesis Doctoral se evaluaron los efectos de E. faecalis CECT7121 sobre las células dendríticas (DCs), analizando no solo su activación como efectores centrales de la respuesta inmune innata sino también sus consecuencias sobre la inmunidad adaptativa. También se estudió la estimulación que este microorganismo ejerce sobre los macrófagos. Además, se evaluaron las consecuencias del tratamiento intragástrico con este probiótico en ratones BALB/c. Por último, dadas las características inmunoestimulantes de E. faecalis CECT7121 hacia un perfil inflamatorio, se utilizó un modelo tumoral para contextualizar los efectos benéficos de esta cepa. E. faecalis CECT7121 indujo en forma dosis-dependiente una fuerte activación in vitro de DCs generadas a partir de precursores de médula ósea, induciendo la secreción de citoquinas pro- y anti-inflamatorias (IL-6, TNF?, IL-12p40 e IL-10). En comparación con otras cepas bacterianas analizadas, se observaron diferencias significativas en los niveles de TNF? e IL-10 producidos in vitro. Además, E. faecalis CECT7121 estimuló la expresión de marcadores celulares de activación como MHC-II, CD80 y CD40. Las preparaciones antigénicas obtenidas de E. faecalis CECT7121 indujeron diferentes respuestas de citoquinas en cultivos de DCs. En particular, los ácidos lipoteicoicos estimularon la producción de todas las interleuquinas pro-inflamatorias testeadas, mostrando características interesantes como moléculas inmunoestimulatorias. La estimulación con E. faecalis CECT7121 sobre DCs generadas a partir de precursores de médula ósea de ratones genéticamente modificados remarcó la importancia de los mecanismos de reconocimiento y las moléculas que participan en la señalización intracelular. La eliminación de la proteína adaptadora MyD88 en DCs MyD88-/- impidió su maduración y la producción de citoquinas. Por su parte, ni la expresión de DC-SIGN humano (hSIGN) ni la ausencia del receptor de manosa (MR-/-) en DCs murinas pareció haber modificado el efecto estimulatorio de esta cepa bacteriana. En el estudio de las consecuencias generadas sobre la respuesta inmune adaptativa, las DCs previamente estimuladas con E. faecalis CECT7121 estimularon la proliferación de linfocitos T CD4+ e indujeron la producción de IFN? en co-cultivos in vitro. Los ensayos in vivo permitieron evidenciar que la inoculación intraperitoneal de DCs pulsadas con E. faecalis CECT7121 en ratones naïve generó una acumulación sistémica de células que específicamente produjeron IFN?. In vitro, E. faecalis CECT7121 promovió la activación de macrófagos hacia el perfil clásico M1, estimulando la producción de citoquinas pro-inflamatorias como IL-6 y TNF?. En comparación con las demás cepas estudiadas, no se detectaron diferencias significativas en los niveles de citoquinas secretados. Al analizar los mecanismos intracelulares desencadenados, se observó que esta cepa probiótica activó la vía de señalización que involucra al factor de transcripción NFAT. El tratamiento intragástrico con E. faecalis CECT7121 en ratones BALB/c ejerció un efecto estimulante sobre el sistema inmune local y sistémico. Este probiótico indujó mayores respuestas proliferativas y torció la respuesta inmune hacia la producción de IFN?. La producción de esta citoquina fue mayor al día 4 y disminuyó para el día 11 luego del tratamiento, mostrando signos de una respuesta cinética que tiene lugar tanto a nivel local como sistémico. En las condiciones experimentales utilizadas, E. faecalis CECT7121 no afectó la generación ni el reclutamiento de Tregs o MDSCs. Al contextualizar los efectos benéficos E. faecalis CECT7121 empleando modelos anti-tumorales, este probiótico inhibió de manera dosis-dependiente la proliferación in vitro de las células tumorales murinas (LBC) y humanas (Raji y PL104). Las cepas control mostraron un comportamiento dosis-dependiente similar al de E. faecalis CECT7121. Sin embargo, no todas las bacterias testeadas mostraron el mismo nivel de inhibición de la proliferación celular. Resultados similares fueron observados en los efectos directos de las paredes bacterianas purificadas. La administración in vivo por vía intraperitoneal de E. faecalis CECT7121 o las cepas control testeadas protegió de la muerte al 90 % de los animales desafiados con una dosis letal del linfoma LBC, probablemente debido a la acción conjunta de la estimulación in situ de la respuesta inmune innata y la inhibición tumoral directa. En resumen, estos resultados demuestran que la estimulación inmunológica generada por E. faecalis CECT7121 involucra la activación de la respuesta inmune innata (teniendo como blanco principal a las DCs y los macrófagos) y el consecuente desarrollo de respuestas celulares adaptativas del perfil Th1. Estos resultados demuestran que E. faecalis CECT7121 puede, en definitiva, constituir una novedosa estrategia adyuvante tanto en planes de vacunación oral como sistémica, o incluso como agente modulador en terapias anti-tumorales.