Cambios en la expresión de subunidades del RNMDA como marcadores de un aprendizaje

Los receptores de glutamato NMDA (RNMDA) están involucrados en aprendizaje y formación de una nueva memoria. Son fundamentales en la codificación y ?almacenamiento? de información y necesarios en la evocación. Juegan un rol crítico en el establecimiento y mantenimiento de plasticidad sináptica y en la formación y estabilización de las sinapsis durante el desarrollo. Los RNMDA son heterotetrámeros compuestos por dos subunidades GluN1, obligatorias para el ensamblado, y dos subunidades regulatorias: GluN2 (A, B. C o D) o GluN3 (A o B). GluN2A y GluN2B son las subunidades regulatorias más abundantes en telencéfalo, especialmente en regiones del SNC relacionadas con memoria y aprendizaje, como hipocampo, amígdala y corteza prefrontal (CPF). En este trabajo de Tesis, nos propusimos evaluar si la adquisición de distintos tipos de aprendizaje y la inducción de plasticidad sináptica producían cambios en los niveles de las subunidades GluN1, GluN2A y GluN2B del RNMDA. En la primera parte, se analizaron posibles cambios en las subunidades del RNMDA durante la consolidación y luego de la evocación de una memoria. Se entrenaron ratas Wistar en distintos paradigmas: habituación al campo abierto (CA), reconocimiento de objetos (RO) y localización espacial de objetos (LO). Luego del entrenamiento o del testeo, los animales fueron eutanasiados y se extrajeron hipocampo, CPF y amígdala para ser analizadas por western blot (WB). Los animales de 1, 2, 3 y 12 meses se habituaron al CA durante la sesión de 5 minutos. En los animales de 1, 2 y 3 meses pero no en los de 12 meses, los niveles de las subunidades GluN1 y GluN2A aumentaron en hipocampo, 70 minutos después de una sesión de CA capaz de generar habituación al ambiente. Este aumento es transitorio, ya que los niveles disminuyen significativamente, siendo indistintos del control a los 90 minutos. Por otro lado, 70 min luego de la evocación de una memoria reciente (1 día) o de una memoria remota (2 meses), hubo un aumento en los niveles de GluN1 y GluN2A en la CPF, involucrando a esta estructura en ?el almacenamiento? o ?persistencia de la traza? de esa memoria del ambiente. También hubo aumento de GluN1 y GluN2A en hipocampo, 70 min luego del entrenamiento en el CA con dos objetos novedosos (igual para RO y LO), lo que permite sugerir que podría tratarse de un mecanismo general relacionado con la formación de una memoria espacial. Por otra parte, 70 min después del test de LO, hubo un aumento de GluN1 y una disminución de GluN2B en hipocampo, mientras que no se detectaron cambios luego del testeo de RO, lo que podría ser explicado porque el RO es independiente del hipocampo (en esta etapa, en que se trata de la discriminación de objetos), mientras que LO sí depende de dicha estructura. Aunque los cambios detectados indican un posible aumento del RNMDA, aparece una disminución de GluN2B; podría tratarse de un mecanismo diferente relacionado con la formación de una memoria espacial sobre un ?engrama similar?. En la segunda parte, evaluamos el efecto de la inducción de plasticidad sináptica en los RNMDA, utilizando un modelo in vitro. Cultivos primarios de neuronas hipocampales (14DIV) fueron estimulados mediante pulsos de KCl. Las neuronas fueron fijadas a distintos tiempos y se evaluaron las subunidades del RNMDA mediante inmunofluorescencia. Comprobamos que existen aumentos de GluN1 y Glun2A similares a los observados in vivo. Sin embargo, dada la compartimentalizacion en la expresión proteica, el análisis de este aumento debe ser considerado por separado, ya que también los mecanismos moleculares involucrados son distintos según la subunidad y el compartimiento analizado. a. En somas, similar a lo observado in vivo, el aumento resulta significativo a los 70 min del estímulo, b. mientras que en dendritas, el aumento ocurre a partir de los 30? para GluN2A y de los 45 min para GluN1. c. En ambos compartimientos, a los 90 min los valores fueron similares a los controles, mostrando su carácter transitorio. d. El aumento de GluN1 en el soma, depende principalmente de: síntesis de novo de mensajeros y de traducción, mientras que a nivel de dendritas, depende de movilización desde pooles ya traducidos, retenidos en el RE a ese nivel. e. El aumento de GluN2A en el soma depende exclusivamente de traducción de mensajeros silenciados, mientras que en las dendritas, el aumento a los 75 min del estímulo tiene dos componentes: transporte de receptores GluN2A-RNMDA ya ensamblados y traducción de mensajeros locales silenciados. Estos aumentos, así como los aumentos in vivo, fueron transitorios, ya que disminuyeron a niveles no diferentes del control a los 90 min, tanto en dendritas como en los cuerpos neuronales. Los resultados in vivo e in vitro muestran que, luego de inducción de plasticidad o luego de un aprendizaje espacial novedoso, hay incremento de las subunidades GluN1 y GluN2A en hipocampo con curso temporal semejante, lo que permite hipotetizar que: ?habría un aumento en los RNMDA posiblemente conteniendo GluN2A, que podría actuar como una señal duradera, contribuyendo a marcar sinapsis involucradas (tagging?), dando lugar al establecimiento y mantenimiento de la plasticidad sináptica, que constituiría parte de la traza de una nueva memoria.? Como última parte, desarrollamos vectores derivados de virus adeno-asociados (AAV), capaces de codificar para un short-hairpin RNA (sh-RNA) anti- GluN2A (sh2A). Pudimos demostrar que la infección con el vector AAV-sh2A disminuyo la expresión de GluN2A, por lo que constituiría una herramienta útil para el estudio de los RNMDA conteniendo GluN2A, tanto in vitro como in vivo. Además, observamos que la disminución de GluN2A en las neuronas transducidas, produjo aumento del número total de espinas, principalmente de espinas inmaduras.