Estudios sobre la proteína 3A en la transcripción/replicación del Virus de la Fiebre Aftosa

La Fiebre Aftosa es una enfermedad vesicular aguda de rápida propagación y amplio rango de huéspedes. El agente etiológico es el virus de la fiebre aftosa (VFA), un virus no envuelto con genoma ARN de simple cadena y polaridad positiva, perteneciente a la familia Picornaviridae. El genoma del VFA codifica para una poliproteína que es escindida por proteasas virales para generar 4 proteínas capsidales y 8 no capsidales (PNC). Se ha reportado que la proteína NC 3A juega un papel relevante en la síntesis del ARN, en el anclaje a membranas intracelulares del complejo replicativo, así como en la virulencia y rango de huésped del VFA. El propósito de este trabajo fue estudiar el rol de la región N-terminal y la propuesta como transmembrana de la proteína NC 3A en la replicación del ARN y en su ubicación intracelular. La metodología utilizada fue la evaluación de mutantes puntuales y de deleción realizadas sobre un replicón del VFA (pRep), basado en la cepa O1/Campos, transcripto desde el promotor de la polimerasa del fago T7 (T7pol). Este replicón codifica la región completa de proteínas NC, y los extremos no traducibles, pero las proteínas capsidales fueron reemplazadas por el gen reportero de la Luciferasa de Luciérnaga. Se realizaron deleciones sobre pRep en la región N-terminal de 3A (pRep?6-11, pRep?6-17 y pRep?6-23) y posteriormente mutaciones puntuales (pQ18A/H19A/E20A y pE20A). Por otra parte, se mutó la zona predicha como transmembrana (aa 57-76), reemplazándola por una secuencia de 8 alaninas (pRep?TM). La evaluación de replicación/transcripción se realizó por medición de luminiscencia, luego de transfección de células BHK-21 con los plásmidos mutantes o controles, junto con los plásmidos que expresan T7pol y Luciferasa Renilla, este último para normalizar la medición. Las mutantes pRep?6-23, pQ18A/H19A/E20A, pE20A y pRep?TM presentaron una marcada disminución de actividad Luciferasa con respecto a pRep con 3A wt. La ubicación intracelular se evaluó mediante Inmunofluorescencia Indirecta, por microscopia de fluorescencia y confocal, utilizando el anticuerpo monoclonal 3H7 y un anticuerpo comercial contra la etiqueta Flag. Se construyeron plásmidos de expresión de 3Awt (p3AF) y de las mutantes analizadas anteriormente, unidas a la etiqueta Flag (p?6-11F, p?6-17F, p?6-23F y p?TMF). Con la mutante p?TMF, se demostró que la secuencia comprendida entre los aa 56 y 76 de la proteína 3A del VFA, estaría involucrada en la asociación a membranas citoplasmáticas, ya que luego de su deleción la proteína se localiza en el núcleo celular. Se concluye que la región comprendida entre los aa 18 a 23 de la proteína 3A, en especial el ácido glutámico en la posición 20, serian críticos para la replicación viral, mientras que los aa 56 a 76 están involucrados en la ubicación subcelular de la misma. Complementariamente, se mapeó el anticuerpo monoclonal 3H7 y se encontró que su epitope se ubica en la zona N-terminal de 3A y se desarrolló un ensayo de ELISA indirecto utilizando la proteína 3A unida a un péptido carrier (3AGFP-ELISA) para screening de circulación viral en bovinos. El 3AGFP-ELISA resulto rápido y específico, en la distinción de sueros de animales vacunados, de sueros de animales infectados o convalecientes. Se evaluó su performance en comparación con el ensayo 3ABC-ELISA actualmente en uso, (desarrollado también por nuestro Instituto), mediante el análisisde un grupo de 5 sueros positivos de referencia fuertes y débiles (cercanos al valor de corte del ensayo) y posteriormente el análisis de 363 sueros de animales vacunados/no infectados. Los resultados obtenidos con ambos ELISAs 3AGFP y 3ABC mostraron una muy buena correlación, por lo que 3AGFP-ELISA, se podría proponer como una técnica simple y rápida, para el screening inicial de sueros de campo.