Respuesta inmune innata pulmonar frente a la infección inhalatoria por brucella abortus

La brucelosis es una zoonosis causada por bacterias intracelulares gram negativas del género Brucella, las cuales afectan a animales domésticos y salvajes, y pueden transmitirse al hombre por diversas vías. Una de estas vías es la inhalación de aerosoles contaminados. La brucelosis afecta a 500.000 personas en todo el mundo cada año y en Argentina se producirían anualmente entre 10.000 y 20.000 nuevos casos. La importancia de la vía inhalatoria ha quedado de manifiesto en brotes epidémicos vinculados a la generación de aerosoles contaminados en ámbitos laborales, particularmente en laboratorios microbiológicos y en mataderos. Se estima que se requieren tan sólo 10 a 100 organismos aerosolizados para generar infección en seres humanos, y es por ello que Brucella se considera altamente infectiva cuando se adquiere por vía aerógena y es clasificada por el CDC como agente bioterrorista. A pesar de la importancia de las vías respiratorias para la entrada de Brucella en el organismo, se desconoce casi por completo la respuesta inmune pulmonar a la infección inhalatoria por Brucella spp. El objetivo general de este trabajo de Tesis fue evaluar la interacción de Brucella abortus con la mucosa respiratoria y sus componentes en las primeras etapas de la infección para caracterizar la respuesta inmune innata y antimicrobiana desencadenada en el pulmón, así como evaluar los mecanismos que utiliza la bacteria para evadir la vigilancia inmunológica pulmonar y diseminarse sistémicamente. Para ello desarrollamos un modelo murino de infección intratraqueal por B. abortus que nos permitió evaluar la respuesta inmune innata durante la primera semana de infección, y analizar un posible mecanismo de evasión de la inmunidad. También se realizaron estudios in vitro para evaluar la respuesta de las principales células conformantes de los tejidos pulmonares. Los resultados de esta Tesis demuestran que B. abortus genera una respuesta inmune pulmonar retardada y de baja intensidad, a pesar que es capaz de infectar y persistir en pulmón murino, pudiéndose diseminar desde el sitio de infección hacia los órganos periféricos tan tempranamente como 1 día p.i.. Se detecta en pulmón un leve aumento de las citoquinas IL-1? y MCP-1 a 3 días p.i. y sólo con cargas bacterianas altas (106 UFC/ ratón), mientras que el resto de las citoquinas proinflamatorias (IL-12, KC, TNF-? e IFN-?) no se diferencian del control hasta 7 días p.i. El análisis histológico demostró que la infección con B. abortus produce cambios en la composición celular del pulmón afectado, observándose un leve infiltrado de células mononucleares. Sin embargo, la citometría no permitió precisar la identidad de las células infiltrantes. Cuando se infectaron los ratones intratraquealmente con una mutante doble de B. abortus para las proteínas BtpA y BtpB (btpAbtpB-), involucradas en el bloqueo de la señalización por TLRs, la histología pulmonar reveló un mayor infiltrado de células mononucleares que en los pulmones de ratones infectados con la cepa salvaje (wt). Esto sugiere que las proteínas Btp modulan el reclutamiento de las células inmunes hacia el pulmón. A diferencia de lo que ocurre en el pulmón, el recuento de bacterias viables en los órganos periféricos de los ratones infectados por vía intratraqueal con la doble mutante fue mucho menor que en los ratones infectados con la cepa wt. Esto podría deberse a que las proteínas Btp modulan los mecanismos inmunes involucrados en la eliminación de la bacteria en los órganos periféricos. Los mayores niveles de citoquinas en el bazo de los animales infectados con la doble mutante avalaron esta hipótesis. Este estudio es el primero en demostrar in vivo que las proteínas Btp le confieren una ventaja de supervivencia a B. abortus. Asimismo se realizaron ensayos para evaluar la capacidad de modulación de las proteínas Btp frente a agonistas TLR administrados exógenamente. Se halló que la sobrevida de B. abortus en el ambiente pulmonar previamente inflamado con LPS de E. coli depende sustancialmente de la expresión de estas proteínas. Para tener una aproximación a la interacción hospedador-patógeno en infecciones humanas debe recurrirse a modelos in vitro realizados con células de origen humano. Para ello se realizaron infecciones de cultivos primarios de pneumocitos humanos y explantos pulmonares, y se midieron citoquinas y quemoquinas en sobrenadante de cultivo mediante ELISA. Los resultados indican que las células epiteliales alveolares son pobres respondedoras frente a la infección directa por B. abortus en cuanto a secreción de citoquinas proinflamatorias, al igual que los explantos pulmonares, si bien estos últimos responden con mayores niveles de citoquinas. El epitelio respiratorio también responde a las infecciones con la producción de CCL20 y ?-defensinas, los cuales actúan en forma dual como péptidos antimicrobianos y como quemoquinas. Se evaluó su expresión y secreción en un modelo de infección in vitro de líneas celulares humanas, THP-1 (monocitos), Calu-6 (bronquiales) y A549 (alveolares) y en cultivo primario de pneumocitos y explantos humanos. Además se evaluó in vitro la actividad antimicrobiana de ambos péptidos frente a B. abortus. Se observó que las células epiteliales humanas secretan CCL20 y beta-defensina 2 en respuesta a la infección por B. abortus o a las citoquinas producidas por monocitos infectados. Ambas moléculas son producidas en concentraciones que no parecen tener actividad antimicrobiana contra B. abortus, pero que podrían mediar funciones inmunomoduladoras durante la infección. En conclusión, la infección inhalatoria por Brucella abortus genera una respuesta innata pulmonar de poca intensidad que le permite sobrevivir en pulmón y probablemente facilita su diseminación a otros órganos. La persistencia pulmonar de la bacteria posiblemente se vea facilitada, entre otros factores, por su capacidad de supervivencia intracelular y sus mecanismos de modulación de la respuesta inmune innata.