Rol de las proteínas de reconocimiento de peptidoglicanos (PGRPs) en el sistema inmune innato

La RI innata es la primera barrera de defensa de un organismo. Entre los mecanismos implicados en esta respuesta se destaca el reconocimiento de productos conservados de los microorganismos (LPS, las secuencias de ADN -CpG, PGN, etc.) denominados genéricamente patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). Los PGNs interactúan con factores humorales (lisozima, CD14 soluble) y celulas (macrófagos y linfocitos) del hospedador induciendo la producción de citoquinas responsables de las manifestaciones clínicas en infecciones (fiebre, inflamación, etc.). Las PGRPs son proteínas de reconocimiento de PAMPs que unen (como el CD14 o el TLR) y en ciertos casos hidrolizan (como la lisozima) los PGNs presentes en la pared bacteriana. Es por ello que estas moléculas serían muy importantes a la hora de montar una defensa contra las infecciones bacterianas y, se encuentran altamente conservadas desde los insectos hasta los mamíferos. Estas se agrupan en tres clases: PGRP-S (short) (19-20 kDa), PGRP-I (intermédiate), (40-45 kDa) y PGRP-L (long), (30-90 kDa). En los seres humanos se expresan 4 PGRPs distintas denominadas PGRP-S, PGRP-L, PGRP-I? y PGRP-I? también nombradas como PGLYRP-1, PGLYRP-2, PGLYRP-3 y PGLYRP-4, respectivamente. Actualmente, las funciones de PGRPs en mamíferos son mucho menos entendidas que la de los insectos y hay poca certeza sobre que células expresan PGRPs. PGRP-S ha sido implicada en la destrucción intracelular de bacterias por PMNs, pero no se la detectó en LB, LT, ni en monocitos. Se detectó la presencia de PGRP-I? y de PGRP-I? en células epiteliales y PGRP-L, la única con función enzimática, en el hígado o los LT. Menos se sabe aún acerca de los mecanismos que emplean para comunicar la presencia de bacterias. Con el objetivo de estudiar el rol de estas proteínas en la RI innata, expresamos, replegamos in vitro y purificamos con un alto grado de pureza diferentes PGRP humanas en forma recombinante (PGRP-S, PGRP-I?C y PGRP-I?N) obteniendo rendimientos de proteína correctamente plegada y purificada de aproximadamente 1-2 mg/L cultivo. Con ellas obtuvimos antisueros policlonales específicos para cada una de las PGRPs, los cuales no demostraron reactividad cruzada con lisozima ni con otras PGRPs, que fueron utilizados como herramientas biológicas para la detección de las mismas. Observamos que las PGRPs recombinantes dimerizaban por la formación de puentes disulfuro intermoleculares y demostramos que estos dímeros son funcionalmente activos, ya que son capaces de unir bacterias y PGNs. Determinamos la presencia en saliva y en suero de PGRP-S sin embargo ni PGRP-I? ni PGRP-I? fueron detectadas en ninguna de las muestras estudiadas. Por otro lado, comprobamos Universidad de Buenos Aires 90 la existencia de dímeros de PGRP-S en PMN humanos y observamos que se secretaban. Comprobamos que los dímeros se generan por la formación de puentes disulfuro intermoleculares sin perder su funcionalidad. Como se observara en el suero, los dímeros de PGRP-S estarían formados por la oxidación de Cys libres en la superficie del monómero ya que es sensible a la reducción con DTT. También detectamos PGRP-S en monocitos y PMN mientras que PGRP-I? fue detectada en células epiteliales alveolares. Las PGRPs de mamíferos están descritas como proteínas solubles que actuarían como un puente entre el reconocimiento de PGN y la inducción de señales intracelulares, por lo que tendrían al menos dos sitios de interacción, uno para interactuar con el PGN y otro para hacerlo con proteínas efectoras del hospedador. Observamos que todas las PGRPs producidas no solo se unen a la superficie de los monocitos/macrófagos, sino que también, son endocitadas por estas células. No detectamos cambios al repetir los ensayos de endocitosis en presencia de Wortmanina en los cultivos, lo que sugiere que la macropinocitosis no jugaría un rol preponderante en la internalización de estas proteínas. Por otro lado, comprobamos que las PGRPs incrementan los niveles de expresión de NF-?B con respecto a los controles así como también lo hacen los complejos PGRP-PGN respecto a los controles de células tratadas con PGN, lo que sugeriría la existencia de un receptor celular que al interactuar con las PGRPs comunicaría la presencia de bacterias o fragmentos de PGN bacterianos. Sin embargo todos los intentos de co-precipitar este posible receptor no fueron exitosos. En principio se observó que PGRP-S de origen murino y humano poseía acción bacteriostática mientras que la de origen bovino era bactericida, pero posteriormente, se demostró que si estaban glicosiladas podían actuar como bactericidas sobre ciertas especies bacterianas. Si bien observamos que las PGRPs aumentaban el daño en las membranas de las bacterias, no detectamos efectos bactericidas ni bacteriostáticos, sin embargo, la interacción de las PGRPs con la superficie de los monocitos/macrófagos genera en estos un aumento de la capacidad fagocítica, tanto para S. aureus como para sus PGNs, y determinan también, el desarrollo de un perfil proinflamatorio en monocitos/macrófagos al inducirse en ellos un aumento de la proliferación, en la expresión de marcadores de activación CD14, CD80, CD86 y CD11, y en la secreción de las citoquinas TNF-?, IL-8, IL-12, IL-1? e IL-6 cuando se incuban con PGRPs en presencia o ausencia de PGNs. Además, observamos que las PGRPs disminuyen la acción de los PGNs en los procesos de apoptosis temprana y en el daño que estos causan sobre las membranas de estas células, al tiempo que aumentan su actividad metabolica. Basándonos en lo descrito podemos concluir que PGRP-S humana sería un dímero natural que es expresado en PMN como una proteína de 45 kDa, la cual es secretada al medio cuando el PMN degranula, y que su presencia puede ser detectada en suero. Por otro lado, los resultados obtenidos sugieren que las PGRPs serían reconocidas por moléculas presentes en la superficie celular de los monocitos favoreciendo la fagocitosis de bacterias como el S. aureus, y el daño en las membranas de las mismas. Por último, las PGRPs aumentarían la activación así como también la proliferación celular y la secreción de CKs proinflamatorias aumentando de esta manera, la respuesta inflamatoria, y por otra parte, estas tendrían un efecto protector sobre los monocitos/macrófagos, bloqueando la acción de los PGNs sobre los mismos.