Estudio de las bases bioquímicas y moleculares de la actividad hidrolítica de variantes salvajes y mutacionales de ß-lactamasas CTX-M sobre oximino-cefalosporinas : papel de mutaciones puntuales en la expansión del espectro de hidrólisis

La mayoría de los microorganismos productores de ?-lactamasas CTX-M suele ser resistente a cefotaxima pero sensible a ceftazidima. Por esta razón, estas enzimas se conocen como ?cefotaximasas?. Sin embargo, existen variantes ?emergentes? que poseen la mutación Asp240Gly y son capaces de conferir resistencia a cefotaxima y ceftazidima simultáneamente. En este trabajo demostramos que la mutación Asp240Gly se asocia a un fenotipo claro de resistencia a ceftazidima sólo cuando clones hiperproductores de Escherichia coli carecían de porinas OmpF en la membrana externa. La sustitución de glicina en la posición 240 no afecta visiblemente la conformación ni la estabilidad de la enzima, lo que se traduce en eficiencias catalíticas conservadas frente a los ?-lactámicos. Sin embargo, otorgaría mayor flexibilidad conformacional a la enzima, de manera tal que ceftazidima podría acomodar su sustituyente voluminoso en la cavidad del sitio activo para ser hidrolizado más eficientemente. Las ?-lactamasas CTX-MAsp240Gly tienen eficiencias catalíticas frente a ceftazidima entre 5 y 15 veces mayores que las de sus respectivas variantes salvajes, aunque éstas continúan siendo por lo menos 200 veces más bajas que las de cefotaxima. Es decir que a pesar de ejercer efectos sutiles en el comportamiento cinético, la mutación Asp240Gly puede otorgar una gran ventaja selectiva cuando se combina con impermeabilidad en el ambiente de selección adecuado.

Most CTX-M producing microorganisms are usually resistant to cefotaxime but susceptible to ceftazidime. Therefore, these enzymes are called "cefotaximases". However, there are emerging variants possessing the Asp240Gly mutation that are able to confer resistance to cefotaxime and ceftazidime simultaneously. In this work we demonstrate that the Asp240Gly mutation is associated with a ceftazidime resistance phenotype only when Escherichia coli hyperproducing clones lacked porin OmpF in the outer membrane. Substitution of glycine at position 240 does not visibly affect the conformation or the stability of the enzyme, resulting in conserved catalytic efficiencies against most ?-lactam antibiotics. However, the mutation leads to a higher conformational flexibility that allows ceftazidime to accommodate its bulky substituent in the active site cavity, so that it can be hydrolysed more efficiently. CTX-MAsp240Gly ?-lactamases have catalytic efficiencies towards ceftazidime between 5 and 15 times higher than those of their respective wild variants, although these are still at least 200 times lower than cefotaxime. Despite having subtle effects on the kinetic behavior, the Asp240Gly mutation can provide a selective advantage when combined with low permeability in a suitable selection environment.