Evaluación del ADN espermático en semen fresco canino (Canis familiaris)

En las últimas décadas la reproducción de los animales de compañía ha alcanzado un importantísimo desarrollo en todo el mundo. Esto se debe a un aumento de la cría de perros de raza con fines comerciales, a la cría de cánidos para ser incorporados a las fuerzas de seguridad y de rescate, a la crianza y preparación de cánidos adiestrados para asistir a personas con capacidades diferentes y a la utilización del perro doméstico como modelo experimental en el estudio de enfermedades genéticas humanas y de cánidos silvestres en vías de extinción. Esta creciente demanda ha llevado a fomentar la investigación en el área de la reproducción con el objetivo de estudiar parámetros relacionados a la fisiología de los gametos y a la mejora de las biotecnologías dirigidas a incrementar la eficiencia reproductiva de estas especies. Actualmente, los parámetros seminales utilizados en la evaluación del eyaculado canino comprenden: movilidad, concentración, morfología, vitalidad y funcionalidad de las membranas espermáticas. En los últimos años, ha surgido un creciente interés en incluir el análisis del ADN espermático dentro de la evaluación de las características seminales de rutina, debido a varios trabajos que correlacionan el grado de daño del ADN con varios índices de fertilidad. Los objetivos de esta tesis fueron: 1) evaluar el ADN espermático canino a través de la tinción con Azul de Toluidina (AT) en semen fresco, 2) evaluar el ADN espermático canino a través de la técnica de dispersión de la cromatina espermática (SCD: Sperm Chromatin Dispersion test) en semen fresco y 3) correlacionar los resultados obtenidos en los objetivos 1 y 2 con los parámetros seminales de rutina. Objetivo 1: se utilizó la tinción de AT para evaluar el grado de compactación o condensación de la cromatina en semen fresco canino. Se determinaron los patrones de espermatozoides teñidos con AT. El ditiotreitol (DTT, agente reductor de los puentes disulfuro de las protaminas) permitió descondensar la cromatina espermática y utilizarse como control positivo de la tinción. El dodecilsulfato sódico (SDS) combinado con el DTT permitió visualizar mayores grados de descondensación de la cromatina. No se observaron diferencias significativas (p>0,05) entre los tiempos de tinción evaluados (15 y 30 minutos) en los diferentes patrones de AT y en los espermatozoides que reaccionaron con el DTT. Además, la fijación de los frotis con etanol 96° fue efectiva para observar los espermatozoides, evitándose la hidrólisis ácida utilizada por otros autores. Tanto la fijación con etanol como la tinción con AT durante 15 minutos permitieron simplificar y agilizar la técnica. Objetivo 2: se evalúo la fragmentación del ADN espermático en semen fresco canino mediante la técnica de SCD. Se probaron 2 concentraciones diferentes de 2-mercaptoetanol (ME) en la solución de lisis 1 (2,5 y 5%) estableciendo los patrones de SCD para la especie. La concentración óptima de ME fue la del 5%, debido a que conservó el ?core? o núcleo residual y mostró un halo extenso alrededor del mismo, los halos fueron de mayor tamaño y el halo relativo fue también mayor con respecto a la concentración de 2,5% (p<0,05). La incubación del semen con 0,3 M de NaOH durante 15 minutos fue eficaz para lograr la fragmentación del ADN por lo que puede ser utilizado como control positivo del ensayo. Objetivo 3: los resultados obtenidos en los objetivos 1 y 2 fueron correlacionados con los parámetros seminales de rutina. No se observó asociación entre las anormalidades de la cabeza espermática (tinción de Casarett) y las alteraciones en la compactación de la cromatina (AT) y la fragmentación del ADN (SCD). Tampoco se observó correlación entre el resto de las características seminales de rutina y el ADN, a excepción de las colas enrolladas que correlacionaron positivamente con la fragmentación del ADN cuando se utilizó 5% de ME en la solución de lisis. Conclusiones: es posible evaluar el ADN de espermatozoides de semen fresco canino mediante técnicas sencillas, económicas y repetibles como la tinción con AT y la técnica de SCD, contribuyendo a una evaluación seminal más completa. Existirían espermatozoides en el semen fresco canino con morfología normal de la cabeza y alteraciones del ADN. Las técnicas utilizadas en esta tesis permiten evidenciar alteraciones en el ADN que no son visualizadas con las pruebas de rutina de los espermogramas y esto cobra un interés mayor cuando se piensa en programas de reproducción asistida.