Nanotecnología : diagnóstico para la brucelosis porcina

La brucelosis porcina es una zoonosis de importancia para la salud pública y la economía agropecuaria, ya que provoca importantes pérdidas en la producción y restricciones sanitarias en el comercio interno y en las exportaciones. Por ello, es importante tener un diagnóstico rápido y confiable. Hasta la fecha, la prueba confirmatoria de brucelosis es el aislamiento de la bacteria, lo cual es difícil de implementar. Los test diagnósticos vigentes se basan en pruebas serológicas que son útiles para el diagnóstico de piaras pero no permiten obtener un diagnóstico fiable de los animales a nivel individual. Por esta razón, en este trabajo se desarrolló y evaluó un nuevo test diagnóstico. El mismo consiste en un inmunoensayo (iELISA) utilizando como antígeno una glicoproteína recombinante, la cual está formada por el polisacárido O del LPS de Yersinia enterocolitica O:9 (idéntico al polisacárido O de B. suis) unido covalentemente a la proteína transportadora AcrA derivada de Campylobacter jejuni. Este antígeno fue previamente caracterizado y validado para el diagnóstico de brucelosis en humanos y bovinos. A partir del mismo, se desarrolló y validó el glico-iELISA utilizando un panel de sueros positivos y negativos previamente caracterizados por las técnicas de aglutinación con antígeno bufferado en placa (BPA) y Ensayo de Polarización Fluorescente (FPA). Los resultados indican que el glico-iELISA permite discriminar claramente animales positivos de negativos, con un valor de cut-off de 0,56, resultando en una sensibilidad y especificidad diagnóstica de 100%. Además, se desarrolló como prueba de concepto, un inmunoensayo de fluorescencia basado en la unión covalente del mencionado antígeno a micropartículas magnéticas con un panel reducido de sueros. Esta plataforma presenta las ventajas de reducir los tiempos de incubación y los lavados son más eficientes utilizando racks magnéticos sin necesidad de centrifugar, entre otras. Ambos ensayos desarrollados permitieron discriminar animales positivos de negativos, incluso en piaras infectadas identificando puntualmente al animal infectado y diferenciándolo de los animales negativos expuestos.

Porcine brucellosis is an important zoonosis to public health and to agricultural economy since it causes significant losses in production, and the establishment of sanitary restrictions on local and international trade. Therefore, it is important to have a rapid and reliable diagnosis. To date, confirmatory diagnosis of brucellosis mainly relies on the isolation of the bacterium, but it is difficult to implement. Currently, most of the diagnostic tests are based on serological assays useful for diagnosing herds; however there is still not an accurate diagnosis to test individual animals. Thus, in the present work we developed and evaluated a novel indirect immunoassay (iELISA) using a recombinant glycoprotein antigen formed by the LPS O: 9-O polysaccharide of Yersinia enterocolitica (identical to the O polysaccharide of B. suis) covalently coupled to the carrier protein AcrA, derived from Campylobacter jejuni. This antigen was previously characterized and validated for the diagnosis of brucellosis in humans and cattle. From the above mentioned antigen we have developed and validated the glyco-iELISA using a panel of positive and negative sera previously characterized by agglutination buffered plate antigen techniques (BPA), and by fluorescent polarization assay (FPA). The results indicate that the glyco-iELISA differentiates positive animals from clearly negative ones. A cut-off value of 0.56 resulted in a diagnostic test sensitivity and specificity of 100 %, respectively. In addition, as a proof of concept we set to develop, with a small panel of sera, an indirect fluorescence immunoassay with OAg-AcrA coupled to magnetic beads. Due to the advantage of using magnetic racks instead of centrifugation, reduced incubation time and more efficient washes, this platform has shown to be a valuable practical diagnostic tool. Both developed assays discriminate positive from negative animals, even in infected herds specifically identifying the infected animal and differentiating it from negative animals exposed.