Efectos del cocultivo de células epiteliales oviductales porcinas sobre la calidad y desarrollo de embriones porcinos producidos in vitro

La eficiencia del proceso de producción in vitro (PIV) en los mamíferos es afectada por diversas variables asociadas a las condiciones de cultivo durante la maduración, fecundación y desarrollo embrionario. Actualmente, los porcentajes de blastocistos porcinos obtenidos a partir de ovarios de faena son bajos en comparación con otras especies y los embriones obtenidos de menor calidad, debido a que las condiciones de cultivo embrionario in vitro resultan subóptimas en relación con el ambiente in vivo en el cual se desarrollan estos procesos. El cocultivo de gametas y embriones con células somáticas es una herramienta que se desarrolló para mejorar las condiciones de cultivo in vitro. Estas células pueden remover componentes tóxicos o deletéreos, proteger del estrés oxidativo, modificar físico-químicamente el medio y secretar factores de crecimiento. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del cocultivo de embriones porcinos producidos in vitro con células epiteliales oviductales porcinas (CEOP) sobre el desarrollo embrionario in vitro y la calidad de los embriones obtenidos. Se decidió utilizar un cocultivo corto, durante los primeros días de desarrollo. En una primera instancia, se obtuvo un cultivo en pureza de CEOP capaz de ser utilizado en sistemas de cocultivo. El carácter epitelial en las células en cultivo primario y de pasaje 1 se confirmó por la expresión de cadherina E, citoqueratina y la presencia de cilios en las vesículas esferoidales (VE) de CEOP. Según la caracterización, estas células presentaron gotas lipídicas, actividad esteroideogenica, así como también la secreción de glucoproteínas como la glucoproteína oviductal 1 (OVGP-1). El patrón de expresión de receptores hormonales coincidió con la utilización de oviductos de diestro, pero difirió entre el cultivo primario y el pasaje 1. En una segunda instancia, se utilizaron diferentes sistemas de cocultivo de CEOP con embriones porcinos producidos in vitro. Se estableció un sistema de cocultivo con CEOP exitoso, sin el agregado de suero fetal bovino como complemento. El cocultivo de CEOP de pasaje 1 en monocapa con embriones porcinos obtenidos in vitro durante los dos primeros días de cultivo favoreció el porcentaje de blastocistos y su eclosión. Si bien ningún tratamiento modificó el número de células en los blastocistos y la apoptosis evaluada por TUNEL, el cocultivo con CEOP de pasaje 1 disminuyó los niveles de especies reactivas derivadas del oxígeno (ERO) en los embriones porcinos segmentados, obtenidos in vitro. El cocultivo con VE de CEOP no representó un beneficio con respecto al cultivo de embriones en medios tradicionales. Este trabajo constituye el primer reporte de la evaluación de la calidad de embriones porcinos producidos por FIV en sistemas de cocultivo y de la evaluación de los niveles de ERO en embriones porcinos segmentados obtenidos por FIV. Los resultados obtenidos contribuyen a mejorar las técnicas actualmente empleadas en la producción in vitro de embriones porcinos y en la evaluación de la calidad embrionaria. Asimismo, los modelos de cocultivo desarrollados podrían ser utilizados para comprender los mecanismos bioquímicos y moleculares implicados en la interacción materno-embrionaria en el ambiente oviductal.

The efficiency of the in vitro production process (IVP) in mammals is affected by various variables associated with culture conditions during maturation, fertilization and embryonic development. Currently, the percentages of pig blastocysts obtained from slaughterhouse ovaries are low compared to other species. The embryos obtained are of lower quality because the in vitro embryo culture conditions are suboptimal in relation to the in vivo environment in which these processes occur. The co-cultured of gametes and embryos with somatic cells is a tool that was developed to improve the in vitro culture conditions. These cells can remove toxic or harmful components, protect against oxidative stress, physically and chemically modify the medium, and secrete growth factors. The objective of this work was to evaluate the effect of co-culture porcine embryos produced in vitro with porcine oviductal epithelial cells (POEC) on the in vitro embryonic development and the quality of the embryos obtained. Firstly, a pure culture of POEC capable of being used in co-culture systems was obtained. The epithelial character of the cells in primary culture and passage 1 was confirmed by the expression of E cadherin and cytokeratin and the presence of cilia in the spheroidal vesicles (EV) of POEC. According to the characterization, these cells presented lipid droplets,steroidogenic activity, and the secretion of glycoproteins. The expression pattern of hormone receptors coincided with diestrous oviducts and differed between the primary culture and passage 1. Secondly, different POEC co-culture systems were used with in in vitro-produced pig embryos. A successful POEC co-culture system was established without adding fetal bovine serum as a supplement. The co culture of passage 1-POEC in monolayers with pig embryos obtained in vitro during the first two days of culture favoured the percentage of blastocysts and their hatching. Although no treatment modified the number of cells in the blastocysts and the apoptosis evaluated by TUNEL, the co-culture with passage 1-POEC decreased reactive oxygen species (ROS) levels in the cleaved porcine embryos obtained in vitro. Co-culture with EV of POEC did not represent a benefit over embryo culture in traditional media. This work constitutes the first report on evaluating the quality of porcine embryos produced by IVF in co-culture systems and ROS levels in cleaved porcine embryos obtained by IVF. These results contribute to improving the techniques currently used in the in vitro production of porcine embryos and the evaluation of embryonic quality. Likewise, the developed co-culture models could be used to understand the biochemical and molecular mechanisms involved in the maternal-embryonic interaction in the oviductal environment.