Estudio de la patogénesis causada por mycobacterium bovis en cerdos domésticos y desarrollo de estrategias para el control de la tuberculosis en suinos

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecto-contagiosa de curso crónico, producida por bacterias del género Mycobacterium. Mycobacterium bovis (M. bovis) es el principal agente causal de la tuberculosis bovina (TBb), enfermedad que afecta ignificativamente al ganado bovino, pero que también puede infectar a otros animales de producción como cabras y cerdos, así como a especies salvajes como ciervos y jabalíes. También es capaz de infectar humanos, por lo que constituye un serio problema para la salud pública al tratarse de una enfermedad zoonótica. En cerdos, la principal vía de contagio es oral y se produce cuando estos entran en contacto con animales enfermos o al ser alimentados con leche o subproductos lácteos de animales infectados, así como también desechos alimenticios contaminados. La enfermedad está caracterizada por la formación de granulomas nodulares, siendo mayor la frecuencia de lesiones en los linfonódulos mandibulares y retrofaríngeos, compatible con una vía de infección predominantemente oral. Sin embargo, también hay formas más generalizadas, que incluyen lesiones en tórax y el abdomen, lo que sugiere que también puede ocurrir transmisión respiratoria debido al tropismo que tiene M. bovis por el pulmón. La TB porcina, si bien no está erradicada, se encuentra bajo control en países desarrollados. Sin embargo, en países donde predominan los sistemas de producción más extensivos como Argentina, y donde la TBb es endémica, M. bovis tiene un impacto sustancial en la producción y en la salud pública. Por otra parte, en nuestro país, prevalecen los sistemas de producción de pequeña y mediana escala, constituyendo más del 95% de la producción porcina, donde las medidas de bioseguridad y los controles sanitarios son escasos o nulos. Por lo tanto, mejorar las condiciones de inocuidad alimentaria y disminuir la contaminación ambiental en estos sistemas de producción tendrá un impacto tanto económico, como sobre la salud pública y la salud animal. A su vez, mejorar el estado sanitario de estos establecimientos contribuirá a que desarrollen su máximo potencial productivo, y así posicionarlos de un modo más competitivo incrementando su comercialización dentro y fuera del país.En nuestro país, los datos sobre la prevalencia de la TB porcina son escasos, y la incidencia de la enfermedad se estima por la presencia de lesiones compatibles con TB (LCT) en la inspección bromatológica en frigorífico. Entre 1969 y 2005, la incidencia de TB porcina disminuyó de 8,4 a 0,7% y alcanzó el 0,3% de acuerdo con la prevalencia actual de TB en bovinos. Esto es consistente con una reducción de la transmisión a los cerdos y otras especies debido al progreso de los programas de erradicación de la TB en el ganado bovino. Actualmente, no existen herramientas diagnósticas eficaces para detectar a los animales infectados en el ganado en pie. En Argentina, contamos con un programa de erradicación y control de la TB porcina basado en la Intradermorreacción doble comparativa con PPDb y PPDa, al igual que en el ganado bovino. Particularmente en el cerdo, esta técnica resulta difícil de ejecutar y con frecuencia arroja resultados falsos positivos, siendo además de carácter opcional. Por lo tanto, la información existente sobre el estado sanitario de los establecimientos respecto a la TB no se conoce con certeza. Por otra parte, el cerdo constituye una fuente de infección para otras especies animales, así como para el humano, pudiendo actuar como un mantenedor o diseminador de la enfermedad, cobrando importancia epidemiológica ya que en el cerdo podrían también generarse nuevas variantes de M. bovis. Por lo expuesto, el presente trabajo tiene como objetivo general desarrollar estrategias para la detección y el control de la tuberculosis en suinos y comprender los mecanismos de virulencia de M. bovis, así como la patogénesis y la respuesta inmune del hospedador en diferentes modelos experimentales y mediante un abordaje genómico. Para ello, nos propusimos en primer lugar desarrollar un test de diagnóstico serológico que permita detectar la enfermedad en el animal en pie y de esta manera contribuir a los programas de control y erradicación de la TBb. Desarrollamos y validamos un ELISA indirecto que demostró ser una técnica altamente repetible y reproducible con resultados comparables con un ELISA comercial. Los valores diagnósticos de la prueba resultaron en una sensibilidad del 69% y una especificidad del 100% para un punto de corte de 0,2275. Estos valores permitieron detectar animales enfermos dentro de una población de estado sanitario desconocido y, si bien la Se es baja, no hay riesgo de eliminar animales verdaderamente sanos debido a la Sp del 100%. Adicionalmente, y con el objetivo de contribuir al conocimiento de la epidemiologia de la TB en cerdos, se aislaron y genotipificaron cepas de M. bovis provenientes de muestras de LCT de cerdos faenados en frigorífico. A partir de los resultados obtenidos, se seleccionó una cepa MB894 cuyo espoligotipo resultó de interés epidemiológico al estar asociado a infecciones en humanos, para ser evaluada en modelos animales. Se evaluó la patogénesis y la respuesta inmune en un ensayo de infección experimental de cerdos domésticos inoculados por vía oral con la cepa MB894. Se utilizaron dos grupos de animales, uno de los cuales recibió una sensibilización previa con una suspensión de M. bovis inactivada (HIMB). Los resultados obtenidos nos permitieron confirmar la virulencia de la cepa, dado que todos los animales presentaron LCT. El estudio de las lesiones macroscópicas halladas, su distribución y las características histopatológicas, así como la excreción de micobacterias, nos permitieron conocer en mayor profundidad la patogénesis de la infección en esta especie. Asimismo, pudimos evaluar la respuesta inmune humoral desencadenada tras la infección, pudiendo detectar animales seropositivos a partir de los 70 días post infección. Pudimos observar que la sensibilización previa con HIMB aumentó ligeramente la intensidad de la respuesta, dado que este grupo presentó mayor score de lesiones, mayor fibrosis y un aumento significativo de la respuesta inmune humoral. A pesar de que las diferencias para el score de lesiones entre los grupos no fueron estadísticamente significativas, observamos que la ruta de infección utilizada combinada con una sensibilización previa puede modificar el curso de la infección hacia el desarrollo de lesiones con un componente fibroso más alto, lo que podría sugerir una mayor resistencia a la infección en las condiciones adecuadas. Posteriormente, se caracterizó la virulencia de la cepa en el modelo de TB pulmonar en ratones BALB/c por comparación con una cepa de M. bovis ya caracterizada. Los ratones fueron infectados por la vía intratraqueal y se evaluó la virulencia de la cepa mediante el estudio de las lesiones producidas, la histopatología, los recuentos de unidades formadoras de colonias y el estudio de citoquinas. Los resultados obtenidos indicaron un grado de virulencia similar al de la cepa hipervirulenta M. bovis 303 (MB303) aislada de jabalí, evidenciado la alta virulencia de la cepa de M. bovis aislada de LCT de cerdo. Para tratar de comprender los mecanismos de virulencia que aportan al fenotipo de alta virulencia realizamos un estudio de genómica comparativa. Se secuenció, ensambló y anotó el genoma completo de la cepa MB894 utilizando como cepa de referencia la cepa de M. bovis AF2122/97. Una vez obtenido el mapa completo del genoma, se realizó la comparación con la cepa MB303, encontrándose diferencias a nivel de SNPs e INDELs en 10 genes, que podrían generar cambios a nivel de proteína y ser relevantes para la virulencia de la bacteria. Luego se analizaron genes polimórficos reportados en la bibliografía, relacionados con el metabolismo de lípidos. Finalmente, se estudió el pan genoma de la cepa MB894, junto con la cepa hipervirulenta MB303 y una cepa de virulencia atenuada de M. bovis 534 (MB534) y se encontró que la cepa MB894 presentó genes exclusivos que podrían estar asociados a las diferencias encontradas en cuanto a la virulencia.

Tuberculosis (TB) is a chronic infectious disease, produced by members of the genus Mycobacterium. Mycobacterium bovis (M. bovis) is the main cause of bovine tuberculosis (TBb), a disease that significantly affects cattle, but which can also affect other farm animals such as goats, deer and pigs, as well as wild species, being a problem for public health as it is a zoonotic disease. In pigs, the main route of infection is the oral route, and occurs when they are in contact with sick animals or when they are fed with milk or dairy unpasteurized products, as well as contaminated food waste. The disease is characterized by the formation of nodular granulomas, with a higher frequency of lesions in the mandibular or retropharyngeal lymph nodes, compatible with a predominantly oral route of infection. However, there are also more generalized lesions, including the locations in thorax and abdomen, suggesting that both respiratory and foodborne transmission may occur. Although TB in pigs is not eradicated, it remains under control in developed countries. However, in countries where extensive production systems predominate and TBb is endemic such as Argentina, M. bovis has a big impact on production and public health. On the other hand, in Argentina, small and medium-scale production systems represent more than 95% of the total pig production, being the priority of this area to place the consumption of pork meat in the market. Therefore, improving food safety conditions and reducing environmental contamination in these systems will have an economic impact, as well as on animal and public health conditions. At the same time, improving the health status of these establishments will help them to develop their maximum productive potential, and thus to position them in a more competitive way and increase commercialization within and outside the country. In our country, data on swine TB is scarce, and the prevalence of the disease in pigs is estimated by the presence of TB like-lesions at inspection in slaughterhouse. Between 1969 and 2005, the incidence of swine TB decreased from 8,4 to 0,7% and reached 0,3% in accordance with the prevalence of TB in cattle. This is consistent with a reduction in transmission to pigs and other species due to the progress of TB eradication program livestock. Currently, there are no effective ante mortem diagnostic tools to detect infected animals. In Argentina, there is a swine TB eradication and control program, based on a double comparative tuberculin skin test with PPDb and PPDa, as in cattle. Particularly in pigs, this technique is difficult to perform and often provides false positive results. Thus, the information regarding the TB health status of the farms is uncertain. On the other hand, pigs constitute a source of infection for other animals in the farm as well as for humans, being able to act as a reservoir or as a ?spill-over? host suggesting an important role in the epidemiology of TB and acting as a reservoir where new variants of M. bovis may occur. The aim of the present work was to develop strategies for the detection and control of swine TB. Also, to understand the virulence of M. bovis strains, through the study of the pathogenesis and immune response in different experimental models, together with a genomic approach, in order to contribute to TBb eradication programs. To this aim, we first develop a diagnostic serological test, to detect the disease in pigs? populations. For this end we developed and validated an in house-ELISA, which proved to be highly repeatable and reproducible, comparable with a commercial ELISA test, and with a sensitivity of 69% and a specificity of 100%, allowing to detect sick animals within a given population, without the risk of eliminating healthy animals. Additionally, M. bovis strains from TB-like lesions from slaughtered pigs were isolated and genotyped. We focused our attention on strain MB894 that presented a spoligotype associated with human infections. This strain was selected for further characterization in animal models. We first evaluated the pathogenesis and immune response in pigs experimentally infected with MB894 strain. Two groups of 10 animals each were infected by the oral route in previously sensitized animals or not, with a heat- inactivated M. bovis suspension (HIMB). The results obtained allowed us to confirm the virulence of the strain, since all the animals presented TB-like lesions. The study of these lesions, their distribution and histopathology, as well as the excretion of mycobacteria, allowed us to better understand the pathogenesis of M. bovis infection in pigs. In addition, we were able to evaluate the humoral immune response triggered after infection, detecting seropositive animals after 70 days post infection. We observed that previous sensitization with HIMB slightly increased the intensity of the response, given by a higher lesion score, a more fibrotic component and an increase in the humoral immune response. Although the differences were not statistically significant for the lesion score between the groups, we observed that the oral route of infection, combined with a previous oral sensitization, could modify the course of the infection towards the development of lesions with a higher fibrotic component, which could suggest resistance to infection under the right conditions. Subsequently, we studied the virulence of the strain MB894 in the pulmonary TB model in BALB/c mice in comparison with an already characterized M. bovis 04-303 strain, MB303. Mice were infected by the intratracheal route, and the virulence of the strains was evaluated by the study of macroscopic lesions, histopathology, colony-forming units and cytokines expression. The results obtained showed a degree of virulence comparable to the hypervirulent strain MB303 isolated from wild boar, evidencing the high virulence of the M. bovis strain isolated from a pig TB-like lesion. To understand the highly virulence phenotype, we performed the whole genome-sequencing of MB894 using the M. bovis AF2122/97 strain as reference. A comparative genomic study was performed between MB894 and MB303 strains, and SNPs/ INDELs were found in 10 genes that could have a high effect at the protein level and could be relevant for the virulence of the bacteria. We also looked for previously characterized genes involved in lipid metabolism reported in the bibliography, probably related with virulence. Finally, the pangenome of MB894 was performed together with the hypervirulent strain MB303 and an attenuated strain M. bovis 534 (MB534), and MB894 exclusive genes were found that could be associated with differences in virulence