Comparación de métodos para el diagnóstico y estudio del virus de la diarrea viral bovina en muestras de suereos, fetos y neonatos bovinos

El virus de la diarrea viral bovina (VDVB) es un Pestivirus de la familia Flaviviridae que afecta al ganado bovino en Argentina y en el mundo, ocasionando importantes pérdidas productivas y reproductivas. Uno de los pilares fundamentales en el control de este virus es la identificación y eliminación de los animales persistentemente infectados. Para ello se requieren técnicas diagnósticas de alta sensibilidad/especificidad, rápidas, económicas y adaptadas a la situación epidemiológica local. En esta tesis se adaptó e implementó un método de reacción en cadena de la polimerasa convencional con transcripción reversa (RT-PCR) para la detección del VDVB en sueros bovinos provenientes de programas de saneamiento del virus y en casos clínicos. Asimismo, se evaluó y comparó el desempeño del aislamiento viral, ELISA para detección de antígeno, RT-PCR convencional y en tiempo real para la detección del VDVB en muestras de sueros y en casos de abortos o mortalidad neonatal. La variabilidad y evolución genética de las cepas obtenidas en este y en otros estudios nacionales se evaluó mediante estudios de filogenia y filodinamia. La técnica RT-PCR presentó una elevada sensibilidad analítica para su uso en muestras de sueros individuales o en pools bajo las condiciones epidemiológicas del país. Mediante la propuesta sanitaria para el control del VDVB se detectó al virus en el 1% de los bovinos y en el 20% de los rodeos. Aunque este trabajo no fue realizado bajo un estricto diseño epidemiológico, los resultados obtenidos aportan datos valiosos a la limitada información de la prevalencia del VDVB en Argentina. Por otra parte, el método RT-PCR mostró un adecuado desempeño para la identificación del virus en muestras de fetos abortados y mortalidad neonatal, que comúnmente presentan alto grado de autolisis y/o contaminación ambiental. Al comparar las técnicas para la detección del VDVB en suero, se demostró que cualquiera de las técnicas evaluadas puede ser empleada para la identificación del virus en muestras individuales de suero. En cuanto a la aplicación de las técnicas diagnósticas para la identificación del VDVB en muestras fetales, se concluye que ambos métodos moleculares fueron más adecuados que el ELISA. Las técnicas moleculares adecuadamente estandarizadas deberían incorporarse de forma rutinaria en los protocolos de diagnóstico de pérdidas reproductivas asociadas al VDVB. El estudio filogenético confirmó la circulación de los subtipos 1a, 1b y 2b del VDVB, con predominio del VDVB-1b. Mediante filodinamia se profundizó la caracterización de los dos subtipos más prevalentes en el país, 1a y 1b. Ambos habrían iniciado su diversificación genética entre las décadas del 50 y 60, en coincidencia con las primeras descripciones clínicas de la enfermedad en el país. El fragmento 5´UTR del VDVB-1a presentó mayor variabilidad genética que el VDVB-1b, aunque las curvas demográficas mostraron largos períodos de diversidad genética constante en ambos subtipos, confirmando así su naturaleza endémica. Se concluye que en el país se disponen técnicas de diagnóstico sensibles y específicas para la detección del VDVB; dependiendo su elección de diversos factores como el tipo de muestra, cantidad de individuos a evaluar, presentación clínica, infraestructura del laboratorio, costos, entre otros. La información obtenida a partir de los estudios genéticos contribuye al conocimiento de la historia evolutiva del VDVB en Argentina, siendo estos datos útiles para el diseño y evaluación de estudios epidemiológicos, herramientas diagnósticas y programas de control de la enfermedad

Bovine viral diarrhea virus (BVDV) belongs to the genus Pestivirus in the Flaviviridae family that affects cattle in Argentina and worldwide, causing significant productive and reproductive losses. One of the main aspects in the control of this virus is the identification and removal of persistently infected animals. For this purpose, diagnostic techniques with high sensitivity/specificity, fast, low-cost, and locally adapted to the epidemiological situation are necessary. A conventional reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay was adapted and implemented for BVDV detection in bovine sera from herds enrolled in BVDV control programs, and from herds with clinical cases. Additionally, the performance of virus isolation, antigen-capture ELISA, conventional and real-time RT-PCR was evaluated and compared for BVDV detection in serum samples and in cases of abortion or neonatal mortality. The diversity and genetic evolution of the BVDV strains obtained in this, and in other national studies, were evaluated through phylogeny and phylodynamic studies. The RT-PCR method presented a high analytical sensitivity for BVDV detection in individual serum samples or in pools under the epidemiological conditions of the country. BVDV was detected in 1% of the cattle and in 20% of the herds. Although the current research was not conceived as an epidemiological study, the obtained results are a relevant contribution to the limited knowledge of BVDV prevalence in Argentina. On the other hand, the RT-PCR method showed a good performance for BVDV identification in aborted fetuses and neonatal mortality samples, which usually present high autolysis degree and/or environmental contamination. Comparisons among diagnostic techniques showed that any of the evaluated methods can be selected for BVDV detection in individual serum samples. Regarding the application of diagnostic techniques for BVDV detection in fetal samples, it is concluded that both molecular methods were more suitable than the antigen-capture ELISA. Molecular techniques should be routinely incorporated for diagnostic protocols for BVDVrelated reproductive losses. The phylogenetic study confirmed the circulation of BVDV-1a, - 1b and -2b, being BVDV-1b the most frequent subtype. The most prevalent subtypes in the country, BVDV-1a and -1b, were further characterized through phylodynamic analysis. Both subtypes would have begun their genetic diversification between the 1950s and 1960s, consistent with the first clinical descriptions of the disease in the country. Although BVDV-1a presented a greater 5´UTR genetic diversity than BVDV-1b, the demographic curves showed long periods of constant genetic diversity in both subtypes, confirming its endemic nature. In conclusion, reliable diagnostic techniques for BVDV detection are available in the country. Therefore, the choice of diagnostic techniques will depend on various factors such as sample type, number of samples, clinical presentation, laboratory infrastructure, and costs. The results obtained from the genetic studies contribute to the knowledge of the evolutionary history of BVDV in Argentina. Moreover, these data could be useful for the design and evaluation of epidemiological studies, diagnostic tools, and disease control programs.