Estudio de la expresión de la 11 beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa-1 (11 beta-HSD1) y del péptido símil glucagón-1 (GLP-1) en perros con síndrome de Cushing

El Síndrome de Cushing (SC) se define como el exceso crónico de glucocorticoides en sangre. Es una de las enfermedades endocrinas más prevalentes en los perros. El SC se caracteriza por presentar disturbios en el metabolismo de los hidratos de carbono y lípidos, entre los que se destacan la tendencia a la hiperglucemia de ayuno, la hipercolesterolemia, la hipertrigliceridemia, la esteatosis hepática y, en los casos más severos, la Diabetes Mellitus (DM). Dichos disturbios se originan porque el cortisol antagoniza muchas funciones de la insulina, induciendo un estado de insulinorresistencia. El péptido símil glucagón 1 (GLP-1) es un péptido intestinal que potencia la secreción de insulina. En humanos con DM, los niveles de GLP-1 se encuentran reducidos. La 11? Hidroxiesteroide Deshidrogenasa tipo 1 (11?-HSD1) es una enzima que convierte la cortisona en cortisol en los tejidos y su alteración está relacionada con el desarrollo de Síndrome Metabólico, obesidad y SC. La Óxido Nítrico Sintasa endotelial (eNOS) produce óxido nítrico (NO) e interviene en la regulación fina (inhibitoria) de la esteroidogénesis adrenal. La metformina es un fármaco de amplio uso en el tratamiento de la DM en humanos, que permite reducir la hiperglucemia, las dislipemias y la insulinorresistencia. Los objetivos de la presente Tesis fueron: evaluar si existen cambios en la expresión de las enzimas 11?-HSD1 y eNOS y en la concentración del GLP-1 en los perros con SC, respecto a los perros sanos. A su vez, evaluar si dichas alteraciones están relacionadas con la persistencia del hipercortisolismo, la dislipemia y la progresión hacia DM en los perros con SC. Estudiar la concurrencia entre SC y DM y evaluar Estudio de la 11?-HSD1 y del GLP-1 en perros con Síndrome de Cushing los posibles factores de riesgo en los perros con SC que podrían predisponer el desarrollo de DM en forma concurrente. Asimismo, implementar nuevas terapias coadyuvantes, como la metformina, que permitan normalizar dichas alteraciones metabólicas. Se realizó el Test de Tolerancia Oral a la Glucosa (TTOG) en perros con SC, en obesos y en controles, y se evaluaron los niveles de GLP-1, insulina y glucemia en los tiempos 0, 15, 30, 60 y 120 minutos. Paralelamente, se evaluaron los índices HOMA (Homeostatis Model Assessment) así como también los niveles de GLP-1 en perros con SC y DM, y en perros con DM. A su vez, se tomaron muestras de tejido adiposo visceral de perros con SC y se evaluó la expresión enzimática de la 11?HSD1 a través de inmunohistoquímica y western blot. Asimismo, se tomaron muestras de glándulas adrenales de perros con SC y se evaluó la expresión enzimática de la eNOS a través de inmunohistoquímica y los niveles de NO plasmático. Se estudió la concurrencia entre SC y DM, se calculó la sobrevida y se evaluaron los factores de riesgo en los perros con SC que podrían predisponer el desarrollo de DM. Por último, se implementó la terapia coadyuvante con metformina en los perros con SC para evaluar si corrige las alteraciones metabólicas mencionadas previamente. Los perros con SC presentaron mayores niveles de GLP-1 (p<0.01), glucemia (p<0.01) e insulinemia (p<0.01), menor sensibilidad insulínica (p<0.01) y mayor funcionalidad de la célula ? pancreática (p<0.01). Los obesos presentaron un comportamiento intermedio. Las mayores concentraciones de GLP-1 podrían sobreestimular a la célula ? pancreática, predisponiendo su agotamiento y posterior Estudio de la 11?-HSD1 y del GLP-1 en perros con Síndrome de Cushing desarrollo de DM. Los perros con DM y con DM-SC presentaron niveles de GLP-1 similares a los perros con SC. La expresión de la enzima 11?-HSD1 en los adipocitos del tejido adiposo visceral de los perros con SC fue significativamente mayor respecto a los perros controles y obesos (p<0.05, p<0.001). La expresión de la enzima eNOS en la corteza adrenal (zona fasciculada) de los perros con SC fue significativamente menor respecto a los perros controles (p<0.01). Los niveles de NO plasmático fueron significativamente menores en los perros con SC, respecto a los controles (p<0.001). La concurrencia de SC y DM fue del 13,61%. Los perros con glucemias > 100 mg/dl (p<0.01, RR 1.16, PPV 0.98), con colesterol total > 350 mg/dl (p<0.01, RR 1.13, PPV 0.98), con triglicéridos > 250 mg/dl (p<0.05, RR 1.17, PPV 0.95), con Relación cortisol creatinina en orina > 100x10-6 (p<0.05, RR 1.13, PPV 0.95) tienen mayor riesgo de desarrollar DM. Los perros con adenoma hipofisario (p<0.05, RR 0.85, PPV 0.08) y las hembras no castradas (p<0.05, RR 0.86, PPV 0.77) tienen una mayor predisposición a desarrollar DM. La aparición de DM en perros con SC reduce el tiempo de sobrevida (p<0.01 con un Hazard ratio de 0.36). La pronta detección de los factores de riesgo permitirá implementar terapias para reducir la incidencia de DM en perros con SC. La implementación terapéutica de metformina resultó efectiva en la normalización de la glucemia (p<0.01), triglicéridos (p<0.05) y colesterol total (p<0.01) durante los primeros meses del tratamiento, acortándose así los tiempos de recuperación. Palabras clave: Síndrome de Cushing, Péptido símil glucagón-1, 11?Hidroxiesteroide Deshidrogenasa 1, Óxido Nítrico Sintasa endotelial, Metformina, Diabetes Mellitus.

Cushing's syndrome (CS) is defined as chronic glucocorticoid excess in blood. It is one of the most prevalent endocrine-diseases in dogs. The CS is characterized by disturbances in the metabolism of carbohydrates and lipids, among which highlights the trend of fasting hyperglycemia, hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, hepatic steatosis and, in severe cases, Diabetes Mellitus (DM). These disturbances arise because cortisol antagonizes many insulin´s functions, inducing a state of insulin resistance. Glucagon like peptide 1 (GLP-1) is an intestinal peptide which enhances insulin secretion. The levels of GLP-1 are reduced in humans with DM. The 11? Hydroxysteroid Dehydrogenase type 1 (11?-HSD1) is an enzyme that converts cortisone to cortisol in tissues and its alteration is related to the development of Metabolic Syndrome, Obesity and CS. The endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS) produces nitric oxide (NO) and is involved in the fine regulation of adrenal steroidogenesis. Metformin is a drug widely used in the treatment of human DM reducing hyperglycemia, dyslipidemia and insulin resistance. The aims of this thesis were to assess whether there are changes in the expression of 11?-HSD1 and eNOS and the concentration of GLP-1 in dogs with CS, compared to healthy dogs. In turn, assess whether these changes are related to the persistence of hypercortisolism, dyslipidemia and progression to DM in dogs with CS. Study the concurrence between CS and DM and assess potential risk factors in dogs with CS that could predispose the development of DM concurrently. Also, valuate if metformin amends such metabolic disorders. Estudio de la 11?-HSD1 y del GLP-1 en perros con Síndrome de Cushing Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) in dogs with CS, obeses and controls dogs were performed, and levels of GLP-1, insulin and glucose levels at times 0, 15, 30, 60 and 120 minutes were evaluated. In parallel, the Homeostatis Model Assessment (HOMA) was evaluated as well as levels of GLP-1 in dogs with CS and DM, and dogs with DM. In turn, visceral adipose tissue samples of dogs with CS were taken and enzymatic expression of 11?-HSD1 by immunohistochemistry and western blot was evaluated. Also, adrenal glands samples of dogs with CS were taken and enzyme eNOS expression was assessed by immunohistochemistry. Levels of plasmatic NO were also evaluated. Concurrence between CS and DM was studied, survival was calculated and risk factors were evaluated in dogs with CS that could predispose the development of DM. Finally, adjunctive therapy with metformin in dogs with CS was implemented to assess whether metabolic abnormalities are corrected. CS dogs had higher levels of GLP-1 (p<0.01), glucose (p<0.01) and insulin (p<0.01), lower insulin sensitivity (p<0.01) and higher functionality of pancreatic ? cell (p<0.01). Obese presented an intermediate behavior. The highest concentrations of GLP-1 could overstimulate pancreatic ? cell, predisposing depletion and subsequent development of DM. DM affected dogs had similar levels of GLP-1 to those dogs with CS. The expression of the enzyme 11?-HSD1 in adipocytes of visceral adipose tissue of dogs with CS was significantly higher compared to controls dogs (p<0.01). The enzyme eNOS expression in the adrenal cortex (fasciculata) of dogs with CS was significantly lower compared to controls and obese dogs (p<0.05, p<0.001). Plasma NO levels were significantly lower in dogs with CS compared to control dogs (p<0.001). The concurrence of CS and DM is 13.61%. Dogs with blood glucose Estudio de la 11?-HSD1 y del GLP-1 en perros con Síndrome de Cushing levels > 100 mg/dl (p<0.01, RR 1.16, PPV 0.98), total cholesterol > 350 mg/dL (p<0.01, RR 1.13, PPV 0.98), triglycerides > 250 mg/dl (p<0.05, RR 1.17, PPV 0.95), with cortisol urine creatinine ratio > 100x10-6 (p<0.05, RR 1.13, PPV 0.95) are at increased risk of developing DM. Dogs with pituitary adenoma (p<0.05, RR 0.85, PPV 0.08) and not spayed females (p<0.05, RR 0.86, PPV 0.77) are more prone to develop DM. The appearance of DM in dogs with CS reduces survival time (p<0.01 Hazard ratio: 0.36). Early detection of risk factors will allow to implement therapies to reduce the incidence of DM in dogs with CS. Introducing metformin therapy was effective in normalizing blood glucose (p<0.01), triglycerides (p<0.05) and total cholesterol (p<0.01) during the first months of treatment and shorten recovery times. Key words: Cushing´s syndrome, glucagon like peptide-1, 11?-Hydroxysteroid Dehydrogenase type 1, endothelial Nitric Oxide Synthase, Metformin, Diabetes Mellitus.