Director(a):
Cetica, Pablo Daniel
Institución otorgante:
Universidad de Buenos Aires.   Facultad de Ciencias Veterinarias
Fecha de la defensa:
2010
Tipo de documento:
tesis doctoral - info:eu-repo/semantics/acceptedVersion
Grado alcanzado:
Doctor de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Veterinarias Reproducción animal
Editor:
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias
Formato:
application/pdf  |   kb.   |  203 h.
Idioma:
español
Area Temática:
Descripción:
La técnica de producción de embriones porcinos in vitro dista de ser óptima. Una de las principales causas es la deficiente maduración del ovocito in vitro. El desconocimiento de las variables involucradas en el proceso de maduración incluye al metabolismo del complejo ovocito-cumulus (COC) y a la regulación de su actividad metabólica por acción de las gonadotrofinas. Las características del cumulus que rodea al ovocito inmaduro han demostrado estar relacionadas con la capacidad de maduración del gameto, sin embargo no hay consenso sobre los criterios utilizados para evaluar el cumulus. Además, no se ha considerado la relación de las características del cumulus con la actividad metabólica del COC. El objetivo general del presente trabajo fue estudiar el perfil metabólico de los COCs porcinos durante la maduración in vitro. Los objetivos particulares fueron: establecer la calidad de los ovocitos inmaduros, evaluar la maduración in vitro en las diferentes categorías de COCs y estudiar el metabolismo de los hidratos de carbono, aminoácidos y lípidos y la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) analizando la injerencia del cumulus y de las gonadotrofinas en los patrones metabólicos durante el proceso de maduración. Los COCs inmaduros fueron clasificados en seis clases dependiendo del tamaño y el aspecto del cumulus que rodea al ovocito (clases A1, A2, B1, B2, C y D). En todas las experiencias realizadas para evaluar la participación del cumulus y de las hormonas en el metabolismo se maduraron COCs pertenecientes a las clases aptas para madurar nuclearmente (A1, A2, B1 y B2) en presencia y ausencia de gonadotrofinas. Se determinaron las variaciones en las concentraciones de glucosa, lactato y amoníaco en el medio de maduración del COC, el contenido de proteínas totales del COC, el contenido de lípidos neutros y el nivel de ROS endógenas del ovocito. Además, se evaluó el número de células del cumulus en las diferentes clases y su variación debida al efecto de las gonadotrofinas durante la maduración in vitro. Se observó un mayor porcentaje de ovocitos inmaduros vivos en las clases A, pero igual porcentaje de ovocitos en estadio de vesícula germinal en las clases A, B y C. El porcentaje de ovocitos que alcanzaron el estadio de metafase II luego de la maduración in vitro fue similar en las clases A y B, pero el porcentaje de ovocitos con capacidad de madurar citoplasmáticamente resultó superior en la clase A1. El número de células que forman el cumulus resultó similar en las clases A, aumentando durante la maduración con gonadotrofinas y disminuyendo al madurar sin estimulación hormonal. En las clases B se halló menor número de células del cumulus y no se apreció variación del mismo durante la maduración independientemente de la presencia de gonadotrofinas. La alta correlación positiva y la relación molar 1:2 entre el consumo de glucosa y la producción de lactato observadas indican que la glucólisis sería el principal destino de la glucosa consumida por el COC porcino durante la maduración in vitro. La actividad glucolítica y la producción de amoníaco resultaron mayores en las clases A y se incrementaron por acción de las gonadotrofinas, aunque con mayor intensidad en la clase A1. Al analizar de modo simultáneo la actividad de la glucólisis y el estadio nuclear luego del cultivo in vitro, no se halló relación entre estos parámetros. La inhibición de la glucólisis con fluoruro de sodio (NaF) y ATP se acompañó con una disminución paralela en el porcentaje de ovocitos que alcanzaron el estadio de metafase II. El AMP no modificó la actividad glucolítica en presencia o ausencia de gonadotrofinas, pero disminuyó el porcentaje de metafase II alcanzado. Se halló mayor contenido de proteínas en los COCs inmaduros de las clases A, el cual no se modificó luego de la maduración sin gonadotrofinas pero se incrementó al suplementar el medio con hormonas. Las clases de COCs evaluadas demostraron tener igual contenido de lípidos y nivel de ROS en el ovocito inmaduro, produciéndose una disminución similar de ambos parámetros en todas las clases luego de la maduración en ausencia o presencia de gonadotrofinas. Además, la adición de cisteína al medio de cultivo ocasionó una mayor disminución en el nivel de ROS de los ovocitos en todas las clases de COCs estudiadas. Si bien la vitalidad del ovocito inmaduro estaría relacionada con las características del cumulus, el estadio de vesícula germinal sería el factor principalmente vinculado con la maduración nuclear. La maduración meiótica podría completarse independientemente de las características del cumulus en las clases A y B, sin embargo la maduración citoplasmática tendría una dependencia mayor con las características del cumulus que rodea al gameto. La glucólisis y el metabolismo de aminoácidos se desarrollarían principalmente en las células del cumulus. El mayor número de células del cumulus explicaría en parte el mayor contenido de proteínas de los COCs inmaduros pertenecientes a las clases A y les permitiría responder al estímulo gonadotrófico durante la maduración in vitro incrementando la intensidad de la vía glucolítica, el catabolismo de aminoácidos y la síntesis de proteínas, sin embargo las particularidades del cumulus clase A1 conferirían una mayor capacidad de respuesta metabólica a las hormonas. El desarrollo de la actividad glucolítica en las células del cumulus sería independiente del progreso meiótico del ovocito, sin embargo la actividad de la vía sería necesaria para que los ovocitos puedan completar la maduración. El contenido de lípidos y el nivel de ROS del ovocito inmaduro no estarían asociados con el tipo cumulus que rodea al gameto. El consumo de lípidos endógenos y la disminución del nivel de ROS en los ovocitos durante la maduración serían independientes de las características del cumulus y de la estimulación gonadotrófica, por lo tanto el metabolismo del ovocito sería responsable de la regulación de estos aspectos metabólicos sin la participación de las células del cumulus. La adición de cisteína al medio de maduración contribuiría al control de la producción de ROS de los ovocitos durante el cultivo in vitro sin estar influido por el tipo de cumulus que rodea al gameto. En conclusión, los ovocitos rodeados por un cumulus íntegro y oscuro tendrían la mayor competencia de maduración in vitro. Las gonadotrofinas mejorarían la maduración de los ovocitos al modular el metabolismo de los hidratos de carbono y de los aminoácidos en las células del cumulus. La lipólisis y la producción de ROS en el ovocito serían independientes de las características del cumulus que lo rodea y no estarían reguladas hormonalmente.
Descripción completa
Abstract:
The in vitro porcine embryo production technique needs to be improved. Inefficient oocyte in vitro maturation is one of the main causes of the embryo production failure. The cumulus-oocyte complex (COC) metabolism and its regulation by gonadotropins are relevant aspects that remain unclear. Although immature cumulus features are related to oocyte maturation ability, those features lack clearly defined evaluation criteria. In addition, the relation between cumulus characteristics and COC metabolic activity has not been considered. The main purpose of this work was to evaluate the metabolic profile of porcine COC during in vitro maturation. The specific aims were: to establish immature oocyte quality, to evaluate oocyte in vitro maturation in each COC class and to study the influence of cumulus and gonadotropins on carbohydrates, amino acids and lipid metabolism and reactive oxygen species (ROS) production during in vitro maturation. Immature COCs were allotted into six different classes (A1, A2, B1, B2, C and D) according to their size and morphological criteria. COCs able to complete nuclear maturation (A1, A2, B1 and B2) were matured with and without gonadotropins to evaluate cumulus and hormonal influence on metabolism. Variations of glucose, lactate and ammonia concentrations in maturation media, amounts of COC protein and oocyte neutral lipid and endogenous ROS levels were measured. In addition, the number of cumulus cells of each COC class and its variation due to the influence of gonadotropins during in vitro maturation were evaluated. Although a higher rate of live immature oocytes was observed in A classes, the percentages of oocytes at germinal vesicle stage were similar between A, B and C classes. The nuclear maturation rates after in vitro culture were the same in classes A and B, but cytoplasmic maturation was higher in class A1. The number of cumulus cell was the same in both A classes, raising with gonadotropic stimulation during maturation and decreasing during culture without hormones. The cumulus cell number observed in B classes was lower and showed no variation during culture with or without gonadotropins. Glycolysis would be the main fate of glucose consumption showed by porcine COC during in vitro maturation, as suggested by the high positive correlation and molar rate 1:2 observed between glucose consumption and lactate production. Glycolysis and ammonia production were higher in A classes. Both pathways showed increased activity during gonadotropic stimulation and the hormonal effect was more intense in class A1 COCs. No association was found between the glycolytic activity and the nuclear maturation of oocytes when both aspects were evaluated simultaneously. Sodium fluoride (NaF) and ATP induced glycolysis and nuclear maturation inhibition. AMP showed no effect on glycolytic activity in the presence or absence of gonadotropins, but it diminished metaphase II rate. Protein content of immature COC was higher in A classes. After maturation without gonadotropins no modification was observed, but hormonal stimulation induced a similar raise in the amount of proteins present in both A classes. Equal neutral lipid content and ROS levels were observed in immature oocytes from classes A1, A2, B1 and B2. Both parameters showed the same decrease after maturation in the presence or absence of gonadotropins. In addition, culture media supplementation with cysteine induced a greater decrease in ROS levels in oocytes belonging to all evaluated classes. Immature oocyte vitality would be associated with cumulus features, but germinal vesicle stage seems to be the main factor affecting nuclear maturation. Oocytes from classes A and B could reach metaphase II stage regardless of cumulus characteristics. However cytoplasmic maturation would be closely associated to the surrounding cumulus. Glycolysis and amino acid metabolism mainly take place in cumulus cells. The higher protein content in immature class A COCs could be partly due to their greater cumulus cell number. The increase of glycolysis, amino acid catabolism and protein synthesis in response to gonadotropins would be partly mediated by the higher number of cumulus cells. However class A1 particularities would allow a greater metabolic response to hormones. Glycolysis in cumulus cells seems not to be associated with oocyte nuclear progress, but the activity of this pathway would be required for oocytes during in vitro maturation to reach metaphase II stage. Lipid content and ROS levels of immature oocytes would not be associated with cumulus features. The lipid consumption and the decrease in ROS levels during in vitro oocyte maturation seem to be independent of the surrounding cumulus and gonadotropic stimulation. Thus, oocyte metabolism itself would regulate those aspects without cumulus participation. Cysteine supplementation to culture medium would contribute to diminish ROS production in oocytes during in vitro maturation without cumulus influence. In conclusion, oocytes surrounded by a complete and dense cumulus would be more competent for in vitro maturation. Gonadotropic stimulation of carbohydrates and amino acid metabolism in cumulus cells would improve oocyte maturation. Oocyte lipolysis and ROS production would be independent of the surrounding cumulus and gonadotropic regulation.
Complete abstract
Identificador(es):
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=avaposgra&cl=CL1&d=HWA_1559
Filiación Institucional:
Fil: Alvarez, Gabriel Martín. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Buenos Aires, Argentina
Fil: Alvarez, Gabriel Martín. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal (INITRA). Buenos Aires, Argentina
Institución aportante:
Facultad de Ciencias Veterinarias
Biblioteca cooperante:
Biblioteca y Centro Multimedia de la Facultad de Ciencias Veterinarias
Derechos:
info:eu-repo/semantics/openAccess
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/
Licencia de uso:
Licencia Creative Commons

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Cita bibliográfica:

Alvarez, Gabriel Martín (2010). Estudio del perfil metabólico de los complejos ovocito-cumulus porcinos en la maduración in vitro  (tesis doctoral). Universidad de Buenos Aires.  Facultad de Ciencias Veterinarias. [consultado:  ] Disponible en el Repositorio Digital Institucional de la Universidad de Buenos Aires:  <http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=avaposgra&cl=CL1&d=HWA_1559>