Estrategia diagnóstica de paratuberculosis en bovinos

La paratuberculosis (PTBC) es una enfermedad crónica de los rumiantes, caracterizada por presentar un largo período de incubación y producir enteritis granulomatosa y diarrea profusa en estadios avanzados. Es causada por Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (Map). Su importancia económica se debe a las pérdidas asociadas con el descenso de la producción láctea, el desmejoramiento de los animales y la mortalidad. Según la severidad de los signos clínicos, la evolución de la PTBC bovina puede dividirse en cuatro estadios: silencioso, subclínico, clínico y avanzado. Los animales que cursan los primeros estadios, que habitualmente son los de mayor duración, excretan Map por calostro, leche y heces sin evidenciar signos clínicos. De esta manera transmiten la infección a otros animales susceptibles, particularmente a los terneros. Por lo expuesto, el control de la enfermedad debería basarse en la detección precoz y eliminación temprana de los animales infectados. Sin embargo, las pruebas diagnósticas disponibles actualmente adolecen de una marcada falta de sensibilidad, que las hace incompatibles con este tipo de estrategia. Las pruebas reconocidas y corrientemente en uso para el diagnóstico de PTBC son el cultivo de materia fecal y la prueba de ELISA indirecto para la detección de anticuerpos séricos. En estadios subclínicos la sensibilidad de estas pruebas se encuentra por debajo del 50%. A fin de mejorar la sensibilidad diagnóstica se desarrollaron técnicas de biología molecular, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que puede ser aplicada en muestras de materia fecal, leche y tejidos. Sin embargo, la eliminación de Map por las dos primeras vías es intermitente y con una baja concentración. Por consiguiente, para incrementar la sensibilidad se desarrolló un método de concentración de microorganismos: la separacióni inmunomagnética (IMS) mediante la utilización de nanopartículas imantadas acopladas a anticuerpos policlonales antiMap. El procedimiento aplicado a la leche bovina no solo aumenta la concentración de Map, sino que además elimina los componentes lácteos inhibidores de la PCR. La finalidad de esta tesis fue desarrollar un procedimiento de identificación de Map en muestras de leche. El protocolo elaborado cuenta con dos etapas: a. concentración del microorganismo por separación inmunomagnética con nanopartículas imantadas (perlas inmunomagnéticas) acopladas a anticuerpos monoclonales y policlonales específicos, producidos en la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Buenos Aires. b. identificación del material genético mediante la aplicación de una PCR IS900 con cebadores diseñados en la misma casa. Además, a fin de evaluar la técnica en condiciones de campo (evaluación preliminar), se analizaron muestras de leche cruda de bovinos procedentes de establecimientos infectados y libres de PTBC. La máxima capacidad de adhesión de las perlas inmunomagnéticas se obtuvo cuando se utilizaron de manera simultánea perlas acopladas a anticuerpos monoclonales y perlas acopladas a anticuerpos policlonales (107 UFC/mL). La PCR IS900 con los cebadores diseñados por la Dra. S. L. Mundo, en la Facultad de Ciencias Veterinarias mostró mayor sensibilidad analítica que con los cebadores diseñados por el Dr. Collins y col. y que la PCR ISF57, detectando 101, 103 y 102 UFC de Map/mL, respectivamente. Además, no presentó reacción cruzada cuando fueron enfrentadas con otras micobacterias como M. avium subsp. avium, M. phlei, M. fortuitum ni con M. scrofulaceum. En el ensayo a campo, se tomaron muestras de leche, materia fecal (MF) y sangre de 147 animales asintomáticos provenientes de 5 establecimientos infectados, y de 118 animales de 4 establecimientos libres de PTBC. Dichas muestras fueron analizadas por el método desarrollado (IMS-PCR IS900), por cultivo de leche y de MF y por ELISA indirecto en suero. De las muestras provenientes de los establecimientos infectados se obtuvieron los siguientes resultados positivos: IMS-PCR IS900: 80 (54,4%), cultivo de leche: 2 (1,4%), cultivo de MF: 17 (11,6%) y ELISA: 52 (35,4%). Las 118 muestras de los establecimientos libres resultaron negativas a todas las pruebas.La concordancia entre IMS-PCR IS900 y el cultivo de MF, y entre IMS-PCR IS900 y el ELISA presentó un nivel leve. Esto es consistente con la baja sensibilidad que tanto el cultivo como el ELISA presentan en animales asintomáticos. La sensibilidad y la especificidad relativas del cultivo de materia fecal con respecto a IMS-PCR IS900 fueron estimadas en 18,8% y 98,9% respectivamente. Para el ELISA, estos parámetros fueron estimados en 36,2% y 87,6% respectivamente. La ausencia de resultados positivos en los establecimientos libres es un indicador del alto nivel de especificidad demostrado por la IMS-PCR IS900. Los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que la técnica de IMS-PCR IS900 tiene una capacidad de discriminación más eficiente que las pruebas actualmente disponibles. Además, frente al cultivo de MF o de leche presenta la ventaja en el tiempo de procesamiento, que es significativamente más reducido que el necesario para un cultivo. Lo mencionado justifica que el método sea validado y posteriormente implementado para su uso como diagnóstico rutinario de muestras de campo.

Paratuberculosis (PTB) is a chronic disease of ruminants, characterized by a long incubation period and development of granulomatous enteritis and diarrhea in advanced stages of the disease. It is caused by Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map). Its economic relevance is due to reduced milk yield, progressive cachexia and mortality. Depending on the severity of clinical signs, the evolution of bovine PTB can be divided into four stages: silent, subclinical, clinical, and advanced. The animals in the early stages, which are usually the longest, excrete Map by colostrum, milk and feces, with no evidence of clinical signs. In this way, the spread of the infection to other susceptible animals, particularly calves, takes place. For these reasons, control of the disease should be based on early detection and rapid culling of infected animals. However, currently available diagnostic tests have not enough sensitivity to do feasible the implementation of this type of strategy. The recognized and currently in use diagnostic tests for the diagnosis of PTB are fecal culture and indirect ELISA test for the detection of serum antibodies. In subclinical stages the sensitivity of these tests is below 50%. In order to improve the diagnostic sensitivity, biotechnology was applied for the development of new methods, as the polymerase chain reaction (PCR) that can be applied in feces, milk and tissues samples. However, the elimination of Map by feces or milk is intermittent and with a low concentration. Therefore to increase sensitivity a method of concentration of Map was developed: immunomagnetic separation (IMS) using magnetic nanoparticles coupled to polyclonal antibodies antiMap. The procedure applied to bovine milk not only increases the concentration of Map, but also removes the milk components PCR inhibitors. The purpose of this thesis was to develop a procedure to identify Map in milk samples. The developed protocol has two stages: a. concentration of microorganisms by immunomagnetic separation with magnetic nanoparticles (immunomagnetic beads) coupled to specific monoclonal and polyclonal antibodies produced in the Faculty of Veterinary Science, University of Buenos Aires. b. identification of genetic material by the application of IS900 PCR with primers designed in the same Faculty. In addition, in order to evaluate the performance of the method in field conditions (preliminary assessment), samples from dairy cows from both infected and free farms were analyzed. The maximum adhesion of immunomagnetic beads was obtained when beads coupled to monoclonal antibodies were used simultaneously with beads coupled to polyclonal antibodies (107 CFU/mL). A greater analytical sensitivity was obtained with the IS900 PCR with primers designed by Dr. S. L, Mundo, at the Faculty of Veterinary Science, compared to the IS900 PCR with primers designed by Dr. Collins et al. and ISF57 PCR (the methods were able to detect 101, 103 and 102 Map CFU/mL respectively). Furthermore, the IS900 PCR did not present cross-reaction when they were tested with other mycobacteria like M. avium subsp. avium, M. phlei, M. fortuitum and M. scrofulaceum. In field conditions, was used the milk, feces and blood samples of 147 asymptomatic dairy cows from 5 infected farms and 118 of cows with same condition from 4 free-farms. These samples were analyzed by the method developed (IMS-PCR IS900), by milk and fecal culture MF and by indirect ELISA in serum. From the infected farms samples were obtained following positive results: IMSIS900 PCR: 80 (54.4%), milk culture: 2 (1.4%), fecal culture: 17 (11.6 %) and ELISA: 52 (35.4%). The 118 samples from the 4 free-farms were negative to all tests. The agreement between IMS-IS900 PCR and fecal culture and between IMSIS900 PCR and ELISA showed a low level. This is consistent with the low sensitivity that those methods present in the asymptomatic cows. The sensitivity and specificity for the fecal culture with respect to IMS-IS900 PCR were estimated at 18.8% and 98.9% respectively. For ELISA, these parameters were estimated at 36.2% and 87.6% respectively. The absence of positive results in the free farms is an indicator of the high level of specificity shown by the IMS-IS900 PCR. The results obtained in this work suggest that IMS-IS900 PCR technique has a discriminatory capacity more efficiently than currently available tests. Furthermore, this technique in comparison with the fecal or milk culture has the advantage in processing time, which is significantly lower than that required for culture. The above justifies the method is validated and subsequently deployed for use as routine diagnosis of field samples.