Identification of resistance mechanism to targeting of the ADAM 17/ EGFR axis in triple negative breast cancer in vivo

El cáncer de mama triple negativo (TNCB) es aquel que no expresa el receptor de estrógenos (ER), ni el de progesterona (PR) o el HER2. Esta patología representa el 15% de los tumores de mama invasivos y tiene una alta incidencia en mujeres jóvenes Afro-Americanas. Es responsable de una alta tasa de mortalidad por cáncer de mama ya que generalmente el TNCB causa metástasis; además, responde pobremente a las terapias con quimioterápicos a largo plazo y generalmente desarrolla resistencia a las terapias dirigidas, incluyendo las que implican al EGFR. Por todo ello, es fundamental el desarrollo de terapias alternativas, dado que solo el 30% de las mujeres con cáncer de mama metastásico sobrevive pero ninguna de las que presentan TNBC metastásico. Actualmente, no existe una terapia adecuada y efectiva para el TNBC. En parte, esto se debe a la alta heterogeneidad genética que presentan estos tumores, lo cual redunda en la inefectividad de terapias basadas en una única droga. Terapias basadas en blancos terapéuticos específicos están en investigación y desarrollo, como aquellas basadas en la inhibición de quinasas implicadas en señalización (ejemplo: /Akt, MEK, VEGFR, PDGFR), reparación del DNA, supervivencia celular o acciones androgénicas. Mayormente, estas terapias específicas son combinadas con quimioterapia sistémica. Sin embargo, hasta el momento, los beneficios de tales propuestas terapéuticas no son claros. Aproximadamente el 60% de los TNBC de tipo basal sobreexpresan EGFR; sin embargo, las terapias que implican la inhibición del receptor son mayormente inefectivas debido al desarrollo de resistencia. Distintos mecanismos están involucrados en el desarrollo de resistencia a las terapias dirigidas, como ser mutaciones en la proteína blanco o la redundancia y sobreactivación de vías de señalización compartidas con otros factores de crecimiento. Por lo tanto, es fundamental diseñar terapias combinadas para TNBC que contemplen el posible desarrollo de resistencia. El trabajo de investigación propuesto intenta identificar alteraciones de vías de señalización intracelular ocasionadas por las terapias dirigidas, particularmente en lo que respecta al eje ADAM17/EGFR, con el fin de establecer su posible implicancia en el desarrollo de resistencia. Dado que se desconoce como es regulada la actividad y selectividad de ADAM17, se realizó un amplio estudio mediante shRNA para dilucidar como se regula el clivaje de and PPP1R14D regulan el clivaje de TGFa, AREG y HB-EGF sin afectar la actividad proteasa de ADAM17. La inhibición del eje ADAM17/EGFR sería beneficioso para el tratamiento del TNBC. Nuestros estudios in vitro revelaron que células MDA MB 231 knockout para PKC? and PPP1R14D no presentan sobreactivación de RTKs, sugiriendo que en estos modelos podría verse potenciada la eficacia terapéutica de la inhibición del eje ADAM17/EGFR. Sin embargo, cuando las mismas células fueron inyectadas a ratones, produjeron un fenotipo de tumor agresivo y metastásico, asociado a la reactivación de vías de señalización intracelular como las mediadas por ERK y PI3K/Akt. Ello se asoció a un aumento de la expresión y activación de distintas RTKs, incluido el EGFR como así también de Akt. Estos resultados sugieren la activación alternativa de vías de señalización que permiten que las células tumorales proliferen y produzcan metástasis.

Triple-negative breast cancers (TNBCs) (ER/PR/HER2 negative) represent 15% of invasive breast cancers and occur at a higher rate in young and African-American women. Exploration of novel therapeutic approaches is critical, since only 30% of woman with metastatic breast cancer will survive and virtually none with metastatic TNBC. The status quo as it pertains to the treatment of TNBCs can be summarized as: no effective therapies available. In part, the lack of therapeutic success is due to high genetic heterogeneity of TNBCs, challenging single drug approaches. Many targeted strategies to treat TNBC are being explored, including the inhibition of kinase pathways (e.g. PI3K/Akt, MEK, VEGFR and PDGFR), the inhibition of DNA repair, of survival pathways and androgen receptor blockade. In most cases, such single-drug targeted therapy is combined with systemic genotoxic chemotherapy. For example, although about 60% of basallike TNBCs over express EGFR, EGFR targeted therapy, including kinase inhibition, has been disappointing due to the development of resistance. Various resistance mechanisms allow cancer cells to evade single-drug targeted therapies: mutations in the targeted molecules, extensive crosstalk/pathway redundancy and the upregulation of alternate growth or survival pathways. Design of combinatorial approaches of therapeutics for TNBC that overcome resistance is therefore critical. The contribution of the proposed research is expected to be the identification of signaling network perturbations that occur in response to single targeted therapies, in particular in ADAM17/EGFR axis inhibition, and confer resistance. Based on published results, inhibition of the ADAM17/EGFR ligand axis in TNBC should provide therapeutic benefit with reduced tumor growth and decreased metastasis, if not possibly cure. In our in vitro studies on PKC? and PPP1R14D gene knockout in MDA-MB-231 cells indeed led to decreases in cellular growth and migration. However, to our surprise, when the same cells were injected into mice through orthotropic fat pad transplantation, they produced aggressive, metastatic tumors that showed activation of alternate growth signaling pathways, namely of the mitogen-activated protein kinase ERK and of the PI3kinase target Akt, also a mitogen activated kinase. This suggested that TNBC cells were developing resistance to EGF ligand regulator knockdown by rewiring their growth factor signaling pathways. To determine where these additional growth signals come from, we first considered the tumor cells themselves. In this context we discovered that when kept in culture, MDA-MB-231 cells expressing sh- RNAs targeting either PKCa or PPP1R14D maintained knockdown of the target for up to 35days tested. At the same time EGFR and ERK showed low activity as expected due to a decrease in EGF ligand cleavage; Akt activity was undetectable. Since we observed strong reactivation of ERK and new activation of Akt in tumors in vivo, we considered possible up-regulation of other growth factor receptors on the cell surface that would be engaged by factors released from the tumor stroma once cells are inserted in vivo. Indeed, we found that FGFR2 and Erbb4 were upregulated. It is therefore likely that reactivation of ERK and new activation of Akt was due to FGFR2 and Erbb4. This would suggest that combination therapy of EGF ligand release regulator inhibition and FGFR inhibition would decrease growth of these tumors in vivo.