Identification of cleavage regulatory mechanisms and phenotypic consequences to targeting of the ADAM 17/ EGFR axis in triple negative breast cancer (TNBC) in-vitro

Ectodominio desdoblamiento de proteínas de la superficie celular por una disintegrina y metaloproteinasas (Adams) es altamente regulado, y su desregulación se ha vinculado a muchas enfermedades. ADAM17- dependiente Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) pro-ligando unidades clivaje carcinogénesis mamaria, proliferación, migración e invasión de Cáncer de Mama Triple Negativo (TNBC) células tanto in vitro como in vivo. ADAM 17 de expresión de forma negativa en los pacientes TNBC predice los resultados adversos en pacientes con cáncer de mama y recientemente se ha propuesto como una nueva herramienta de diagnóstico y objetivos terapéuticos. Esta tesis explora el potencial para entender empaparlo anterior reglamento de ADAM17 En el caso de ADAM17/EGFR ligando en eje TNBC. El objetivo general es el de investigar la etnización de ADAM17 sustratos por examinar el efecto de los inhibidores de la enzima diferentes moléculas de señal ización (kinasas, fosfatasas y del citoesqueleto componentes) en basal y éster de forbol inducidos por ADAM17-mediada por clivaje sustrato EGFR y la fosforilación en MDA-MB-231células. ADAM17 escote los reguladores han sido identificadas como nuevas dianas farmacológicas en TNBC. En línea con este objetivo, el papel de los dos identificados recientemente ADAM17 depende de clivaje de los reguladores del laboratorio, la proteína quinasa C (PKC alfa-?) y proteína fosfatasa 1 reguladores (inhibidor) subunidad 14 (PPP1R14D), TNBC pertinentes en las respuestas celulares han sido evaluados. En primer lugar, el tumbador inducible (KD) de estos objetivos se ha logrado en la línea celular epi telial TNBC MDA-MB-231 lentivíricos IPTG a través de sistema de vectores shRNA inducible (pLKO-904) y sus efectos sobre la migración, la invasión y prol iferación celular fue probado in vitro. Estos resultados in vitro se correlacionaron con los resultados obtenidos in vivo mediante el trasplante las mismas células mamarias orthoptopic través adiposa de trasplante en ratones. Para ambos enfoques, anál isis de Western blot de extractos de proteínas totales aislados de l isados celulares todo fue uti l izado para determinar el nivel total y fosforilación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, por sus siglas en inglés) así como de sus objetivos posteriores reguladas por señales extracelulares (llamada Erks cuya), proteína quinasa B (AKT) y transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3). qPCR fue uti l izado para estudiar los niveles de expresión de EGFR y de otros receptores tirosina quinasas (RTKs). Las pruebas ELISA con sobrenadantes de cultivos celulares se real izaron para medir escinde ADAM17 sustratos tales como soluble transformar-crecimiento-factor-alfa (TGF-?), de heparina EGF (HB-EGF), la anfiregul ina, tumor necrosis factor receptor-1 de (TNFR1) junto con el sustrato ADAM10 R/c. Encontramos que el derramamiento reglamento se produce sobre el sustrato y que la proteína quinasa C (PKC) es esencial en la regulación de clivaje ligando EGF. PKC? y PPP1R14D el tumbador produjo una significativa disminución migración, invasión y prol iferación celular de las células, lo que sugiere que la selección de PKC? y PPP1R14D podría proporcionar un beneficio terapéutico en TNBC. Dirigido a los reguladores que escote sustratos dirección en lugar de la proteasa podría impedir que el observado efectos secundarios negativos de amplio espectro inhibidores de metaloproteasas en pacientes, que se debieron a la no inhibición selectiva clivaje sustrato. Desde solo terapias dirigidas, en particular las terapias dirigidas contra el EGFR, suelen provocar resistencia, l igando EGF cl ivaje selección regulador podrían uti l izarse en combinación con los beneficiarios directos de EGFR mejor beneficio terapéutico.

Ectodomain cleavage of cel l-surface proteins by A Disintegrin And Metalloproteinases (ADAMs) is highly regulated, and its dysregulation has been l inked to many diseases. ADAM17-dependent Epidermal Growth Factor (EGF) pro-ligand cleavage drives mammary carcinogenesis, proliferation, migration and invasion of Triple Negative Breast Cancer (TNBC) cells both in vitro and in vivo. ADAM 17 over-expression in TNBC patients negatively predicts adverse outcomes in breast cancer patients and has recently been suggested as a novel diagnostic tool and therapeutic target. This thesis explores the potential to understand shedding regulation upstream of ADAM17 for ADAM17/EGFR ligand axis targeting in TNBC. The overall objective is to investigate the cleavage of ADAM17 substrates by examining the effect of enzyme inhibitors targeting different signal ing molecules (kinases, phosphatases and cytoskeletal components) on basal and phorbol ester-induced ADAM17-mediated substrate cleavage and EGFR phosphorylation in MDA-MB-231cells. ADAM17 cleavage regulators have been identified as new drug targets in TNBC. In line with this objective, the role of two recently identified ADAM17 dependent cleavage regulators from the lab, Protein Kinase C alpha (PKC-?) and Protein Phosphatase 1 Regulatory (inhibitor) subunit 14 (PPP1R14D), in TNBC relevant cellular responses have been evaluated. Firstly, inducible knockdown (KD) of these targets was achieved in the TNBC epi thelial cel l line MDA-MB-231 via lentiviral IPTG-inducible shRNA vector system (pLKO- 904) and i ts effects on migration, invasion and cell proliferation was tested in vitro. These in vitro results were correlated with in vivo results obtained by transplanting the same cel ls via orthoptopic mammary fat-pad transplantation into mice. For both approaches, Western blot analysis of total protein extracts isolated from whole cell lysates was used to determine the phosphorylated and total levels of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) as wel l as of its downstream targets Extracel lular signal-Regulated Kinases (ERKs), Protein Kinase B (PKB/Akt) and Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (STAT3). qPCR was used to study the expression levels of EGFR and of other Receptor Tyrosine Kinases (RTKs). ELISAs using cell culture supernatants were conducted to measure cleaved ADAM17 substrates such as soluble transforming-growth-factor-alpha (TGF-?), heparin-binding EGF (HB-EGF), amphiregul in, tumor-necrosis-factor-receptor-1 (TNFR1) along with the ADAM10 substrate R/c Met. We found that the shedding regulation occurs on the substrate level and that Protein Kinase C (PKC) activity is essential in the regulation of EGF l igand cleavage. PKC? and PPP1R14D knockdown resul ted in significantly reduced migration, invasion and cellular proliferation of cells, suggesting that targeting of PKC? and PPP1R14D could provide a therapeutic benefit in TNBC. Targeting cleavage regulators that address substrates instead of the protease could prevent the observed negative side effects of broadspectrum metal loprotease inhibitors in patients, which were due to nonselective substrate cleavage inhibition. Since single targeted therapies, in particular therapies directed against the EGFR, often induce resistance, EGF l igand cleavage regulator targeting could be used in combination with direct EGFR targeting for better therapeutic benefit.