Nuevos aportes a la genética del hipotiroidismo congénito y de la resistencia a hormonas tiroideas : identificación y caracterización molecular de las mutaciones responsables

La tiroides es la primera glándula endócrina en aparecer en el desarrollo embrionario. Alrededor de la semana 11 de gestación, la glándula tiroides fetal ya tiene la capacidad de concentrar yoduro y aproximadamente en la semana 18, comienza a liberar hormonas tiroideas. Este aporte de hormonas endógenas es esencial para la maduración del cerebro y del esqueleto del feto. La deficiencia de hormonas tiroideas, aún durante cortos períodos podría conducir a daños cerebrales irreversibles cuyas consecuencias dependerán del momento de inicio y duración de dicha deficiencia. La prevalencia del hipotiroidismo neonatal es de 1/3.000-1/4000 recién nacidos según fue determinado a partir de programas de screening a nivel mundial. Dentro del hipotiroidismo varias entidades poseen características propias, el hipotiroidismo congénito sin bocio (disembriogénesis) debido a agenesias, ectopias o hipoplasias, correspondiendo al 80-85 % de los casos del hipotiroidismo neonatal. Se identificaron algunos casos donde la causa es una mutación en los genes TTF-1, TTF-2, Pax 8, NKH2-5 y Receptor de TSH. Un segundo grupo del hipotiroidismo neonatal lo constituyen los hipotiroidismos congénitos con bocio o bocios congénitos debido a alteraciones de unos de los componentes de la biosíntesis de hormonas tiroideas (dishormonogénesis): tiroperoxidasa (TPO), tiroglobulina (TG), DUOX2, NIS, Pendrina y dehalogenasa I. Dicho grupo corresponde al 15-20 % de los hipotiroidismos neonatales y se caracteriza por bajos niveles de hormonas tiroideas y como consecuencia aumento de TSH y mayor proliferación celular tiroidea. El bocio se presenta generalmente cuando la glándula tiroides es incapaz de producir suficiente cantidad de la hormona tiroidea para satisfacer las demandas del individuo. La glándula tiroides se agranda para compensar esta situación, con lo cual generalmente se corrigen las deficiencias leves de la hormona tiroidea pero no las severas. La biosíntesis de hormonas tiroideas se realiza en la interfase célula-coloide, en la membrana apical de la célula tiroidea, sobre una glicoproteína estructural de elevado tamaño que es la tiroglobulina. Esta es la proteína con mayor eficiencia de formación de hormonas tiroideas en presencia de concentraciones fisiológicas de yoduro. Además de intervenir en la biosíntesis de hormonas tiroideas sirve también para el almacenamiento del yoduro. El yoduro ingresa en forma activa en la glándula tiroides y debe ser oxidado antes de actuar como agente efectivo de yodinación. Ingresa al citoplasma celular a través del transportador NIS, ubicado en la membrana basolateral del tirocito. Un segundo transportador localizado en la membrana apical, la pendrina, lleva al yoduro hacia la interfase célula/coloide. Las tres etapas de la organificación del yoduro: oxidación, incorporación del mismo a los residuos tirosílicos de la tiroglobulina y finalmente el acoplamiento de las monoyodotirosinas y diyodotirosinas para formar las hormonas tiroideas triyodotironina (T3) y tetrayodotironina (T4) son catalizadas por una misma enzima microsomal, de membrana, la TPO y en presencia de una fuente de H202. Dos enzimas están relacionadas a la síntesis de H2O2, se trata de dos NADPH oxidasas unidas a la membrana apical denominadas Duox1 y Duox2, y dos factores de maduración de las mismas DuoxA1 y DuoxA2. La biosíntesis de las hormonas tiroideas está regulada por la TSH quien ejerce su acción estimuladora de la transcripción de los genes específicos tiroideos por interacción con su receptor. El efecto de las hormonas tiroideas, es ejercido a nivel transcripcional a través de la interacción de éstas con su receptor nuclear. Mutaciones dispersas a lo largo del gen de TPO constituyen la causa más común de dishormonogénesis con hipotiroidismo congénito permanente con un patrón de herencia autosómico recesivo. El gen que codifica a la TPO humana, de 17 exones está localizado en el cromosoma 2 en el intervalo 2p24-p25. Los aminoácidos entre 149 y 711 que corresponden a los exones 5 a 12 en el gen de la TPO humana muestran una significativa similitud con el consenso denominado ?animal haem peroxidase? (An peroxidase). Los exones 13 y 14 tienen homología con la familia de genes denominados ?complement control protein (CCP)-like? (residuos 742-795) y ?calcium-binding epidermal growth factor (EGF)-like? (residuos 796-839), respectivamente. El exón 15 codifica para el dominio de transmembrana y los exones 16 y 17 para la región intracitoplasmática4. El conocimiento de la organización estructural del gen de la TPO humana permitió desarrollar las herramientas necesarias para identificar mutaciones que originan bocios congénitos por deficiencia de dicha proteína. Estos estudios permitieron diseñar primers intrónicos para amplificar por PCR cada uno de los 17 exones de la tiroperoxidasa y en consecuencia estudiar, a partir del ADN genómico, pacientes con bloqueo de la organificación del yoduro por defecto de la TPO. Hasta el momento, más de 80 mutaciones se han descripto en el gen de TPO las cuales se heredan de un modo autosómico recesivo12. En alrededor del 20% de los casos de hipotiroidismo congénito permanente se han identificado defectos monoalélicos en dicho gen, presumiblemente debido a mutaciones crípticas no halladas en regiones intrónicas o regulatorias del gen. De esta manera, se ha reportado solamente la expresión monoalélica del alelo mutante. La necesidad actual es analizar cómo estas diferentes mutaciones ubicadas en diferentes dominios del gen de TPO alteran la funcionalidad de la respectiva proteína y originan el bocio congénito. Esto permitirá un gran adelanto en el conocimiento de la fisiopatología de la enfermedad y de la correlación clínica con la variabilidad fenotípica. Una segunda entidad es la Resistencia a Hormonas Tiroideas (RTH) que se caracteriza por una disminución de la respuesta a la T3 por parte de los tejidos. La incidencia de RTH es de 1 caso cada 50.000 nacidos vivos, con más de 600 casos conocidos. Existen dos genes que codifican a los receptores de hormonas tiroideas, el gen THRalfa se encuentra en el cromosoma 17 y el gen THRbeta, de 10 exones en el cromosoma 3. El 90% de las mutaciones se localizan en el dominio LBD (Ligand Binding Domain) del gen THRbeta y se heredan de modo autosómico dominante. Han sido descriptas alrededor de 200 mutaciones dentro de las cuales predominan aquellas que originan cambio de aminoácido. Solo dos mutaciones han sido descriptas recientemente en el gen THRalfa. Con respecto a los polimorfismos en dicho gen, no se conoce mucho aun respecto del rol de los mismos. Estudios recientes han demostrado la asociación de los mismos con los niveles de TSH, éste es el caso del polimorfismo THR?-in9-G/A el cual explica una concentración aumentada de TSH de manera alelo, dosis dependiente. Con respecto al hipotiroidismo congénito con bocio, uno de nuestros objetivos consistió en la identificación de mutaciones en el gen de TPO siendo las que se presentan con mayor frecuencia en esta patología. A tal fin, se analizaron 5 pacientes con diagnóstico clínicobioquímico de hipotiroidismo congénito con bocio por defectos en la organificación del yodo. En primer lugar se utilizó la técnica PCR-RFLP para identificar la posible presencia de la mutación p.R396fsX472 generada por la inserción duplicación de GGCC en la posición 1277 de la secuencia de referencia del ARNm en el octavo exón del gen TPO la cual genera, un cambio en el marco de lectura dando como resultado un codón prematuro en el exón 9, con la producción de una proteína truncada sin actividad biológica. A continuación, luego de la puesta a punto de las condiciones para la amplificación por PCR del promotor y de cada uno de los 17 exones del gen se llevó a cabo la secueciación de los mismos. Se identificaron en nuestros pacientes una mutación descripta en bibliografía, p.E799K y dos variantes raras de secuencia: p.V748M y la deleción c.2007-11_2007-9del (-CTT). Se empleó el sistema de clonado pGEM-T Easy Vector para la caracterización de la deleción heterocigota identificada. Se analizó la segregación alélica en las familias correspondientes a los pacientes portadores de las mutaciones. Por otra parte en los pacientes se identificaron y caracterizaron polimorfismos ya sea descriptos como no descriptos previamente. Con respecto a la RTH, se estudiaron 11 pacientes con sospecha de estar afectados con dicha patología y sus grupos familiares. Para la Identificación y caracterización de nuevas mutaciones en el gen del THRbeta se amplificaron los exones que presentan habitualmente mutaciones. Se realizó PCR a partir de ADN genómico empleando primers intrónicos para los exones 7, 8, 9 y 10 del gen THRbeta. Se secuenciaron los productos de PCR y posteriormente fueron analizados los resultados. Se identificó asi una mutación no descripta previamente, lo cual fue confirmado por estudios poblacionales para descartar un posible polimorfismo: p.P452L y dos mutaciones reportadas: p.A268G y p.G345R. Las alteraciones identificadas ya sean en el gen de TPO como en el de THRbeta fueron caracterizadas mediante estudios bioinformáticos de actualidad. Se realizaron análisis evolutivos de homología proteica, de predicción de la estructura proteica secundaria, de predicción del impacto funcional de las sustituciones aminoacídicas identificadas y el efecto que las posibles mutaciones halladas en regiones consenso de splicing pudieran ocasionar sobre dicho proceso. Por otra parte se incluyeron estudios ?in silico? 3D siendo un gran aporte el modelado por homología llevado a cabo para la TPO humana. Las técnicas de biología molecular empleadas constituyen una herramienta útil para la comprensión de la fisiopatología molecular del hipotiroidismo neonatal y de la RTH. Por otra parte contribuirán al diagnóstico temprano y la elección del tratamiento más conveniente haciendo posible también el adecuado asesoramiento genético a las familias afectadas.

The thyroid gland is the first endocrine gland to appear in embryonic development. About week 11 of gestation, fetal thyroid gland and has the ability to concentrate iodide and approximately 18 weeks, begins to release thyroid hormones. The contribution of endogenous hormones is essential for brain maturation and the fetal skeleton. Deficiency of thyroid hormones, even for short periods may lead to irreversible brain damage whose consequences depend on the time of onset and duration of the deficiency. The prevalence of neonatal hypothyroidism is 1/3000-1/4000 from neonatal screening programs. In hypothyroidism several entities have their own characteristics, congenital hypothyroidism without goitre (dysembriogenesis) due to agenesis, ectopia or hypoplasia, corresponding to 80-85% of cases of neonatal hypothyroidism. Some cases where the cause is a mutation in TTF-1, TTF-2 , Pax 8, NKH2-5 and TSH receptor genes were identified. A second group is made up of neonatal hypothyroidism Congenital hypothyroidism with goitre or goiter due to congenital abnormalities of some of the components of the biosynthesis of thyroid hormones (dyshormonogenesis): thyroid peroxidase (TPO), thyroglobulin (TG), DUOX2, NIS, pendrin and dehalogenase I. This group corresponds to the 15-20% of neonatal hypothyroidism and is characterized by low levels of thyroid hormones and consequently greater increase TSH and thyroid cell proliferation. Goitre usually occurs when the thyroid gland is unable to produce enough thyroid hormone to meet the demands of the individual. The thyroid gland enlarges to compensate for this situation, which usually overcomes mild deficiencies of thyroid hormone is correct but not severe. The biosynthesis of thyroid hormones is performed in cell-colloid interface in the apical membrane of the thyroid cell, on a structural glycoprotein of large size is TG. This is more efficient protein formation of thyroid hormones in the presence of physiological concentrations of iodide. In addition to intervening in the biosynthesis of thyroid hormones also serves for the storage of iodide. Iodide enters active thyroid gland and must be oxidized before acting as an effective agent iodination. Enter the cell cytoplasm through the NIS transporter located in the basolateral membrane of the thyrocyte. A second conveyor located at the apical membrane, the pendrin leads to the interface iodide cell / colloid. The three stages of iodide organification: oxidation implement into the tirosilic residues of thyroglobulin and finally coupling the monoyodotirosinas and diyodotirosinas to form the thyroid hormones triiodothyronine (T3) and tetraiodothyronine (T4) are catalyzed by the same enzyme microsomal membrane, TPO and in the presence of a source of H202. Two enzymes are related to the synthesis of H2O2, these two NADPH oxidases bound to the apical membrane called DUOX1 and DUOX2, and two maturation factors and DuoxA DuoxA1. The biosynthesis of thyroid hormones is regulated by TSH who exerts its stimulatory action of thyroid transcription of specific genes by interacting with its receptor. The effect of thyroid hormones is exerted at the transcriptional level through their interaction with the nuclear receptor. Dispersed throughout TPO gene mutations are the most common cause of congenital hypothyroidism dyshormonogenesis permanent. The gene encoding human TPO, exons 17 is located on chromosome 2 in the range 2p24-p25. Amino acids 149 to 711 corresponding to exons 5 to 12 in the human TPO gene show significant similarity to the consensus called "animal haem peroxidase" (An peroxidase). Exons 13 and 14 have homology to the family of genes called "Control complement protein (CCP) -like" (residues 742-795) and "calcium-binding epidermal growth factor (EGF) -like" (residues 796-839), respectively. Exon 15 encodes the transmembrane domain and exons 16 and 17 for the intracytoplasmic region. Knowledge of the structural organization of the gene for human TPO allowed to develop the skills to identify mutations that cause congenital goiters that protein deficiency tools. These studies enabled the design primers to PCR amplify intron each of the 17 exons of thyroid peroxidase and consequently study, from the genomic DNA of patients with iodide organification default caused by TPO gene mutations. So far, more than 80 mutations have been described in the TPO gene which is inherited in an autosomal recessive manner. In about 20% of cases of permanent congenital hypothyroidism, monoallelic defects have been identified in this gene, presumably because of mutations not found in cryptic intron or regulatory regions of the gene. Thus, it has been reported only monoallelic expression of the mutant allele. The present need to analyze how these different mutations located in different domains of TPO gene alter the functionality of the respective protein and cause congenital goiter. This will allow a breakthrough in the understanding of the pathophysiology of the disease and clinical correlation with phenotypic variability. A second entity is resistance to Thyroid Hormone (RTH), characterized by a decreased response to T3 by tissue. RTH incidence is 1 in every 50,000 live births, with over 600 known cases. There are two genes encoding a thyroid hormone receptor, the THRalfa gene is located on chromosome 17 and gene THRbeta of 10 exons on chromosome 3. 90% of the mutations are located in the LBD domain (Ligand Binding Domain ) of THRbeta gene and are inherited in an autosomal dominant manner. Have been described about 200 mutations within those which predominate amino acid change. Only two mutations have been recently described in THRalfa gene. Regarding polymorphisms in the gene, is not known yet about the role much the same. Recent studies have shown the association of these with TSH levels, this is the case of polymorphism THR?-in9-G / A which explains an increased concentration of TSH allele manner dose dependent. In relation with congenital hypothyroidism one of our objectives was identify mutations in the TPO gene because this mutations are present in the greatest frequence. Five patients with congenital hypothyroidism with goiter by defects in organification of iodine were analyzed. RFLP PCR-test was used to check the presence or absence of mutation p.R396fsX472 generated by insertion-duplication homozygous GGCC position 1277 in the eighth exon of TPO gene that generates a change in the reading frame resulting in a premature exon 9, with the production of a truncated protein with no biological activity codon. Then, PCR-sequencing technique of the promoter and 17 exons of TPO gene was carried out after of the pre-tuning the better conditions for amplification of each exon. A reported mutation was identified, p.E799K and two rare variants of sequence: P. V748M and c.2007-11_2007-9del (-CTT). Cloned system pGEM-T Easy Vector for the characterization of the heterozygous deletion identified. The allelic segregation was studied in the familial groups of our patients. Also, reported and new polymorphisms were identified in the five patients. With respect of RTH, 11 patients with suspected this patology were studied. In order to identify new mutations we amplified by PCR and sequenced exons 7,8,9 and 10 of THRbeta gene using intronic primers. Two mutations described above p. A268G, p.G345R were identified and a de novo mutation p.P452L. The last mutation was confirmed by poblational studies to discard the presence of a polymorphism. The identified alterations were analyzed with different bioinformatics tools. Protein homology analysis, prediction of protein secondary structure prediction of the functional impact of amino acid substitutions which are identified and the effect of possible consensus mutations found in regions cause splicing was performed on this process. Silico studies 3D were carried. We have to mention the importance of the homology modeling to this study. The molecular biology techniques used here, are an important tool to the understanding of the molecular physiopathology of the neonatal hypothyroidism and RTH. They will contribute to the early diagnostic and the selection of the appropriate treatment enabling too, the adequate genetic counseling to affected families.