Clonado y expresión del transportador SLC35A3 en Pichia pastoris : optimización de la producción utilizando la tecnología de fusión a GFP

La identificación de colonias transformadas que expresan altos niveles de proteína de membrana es Pichia pastoris es un cuello de botella en los estudios de estructura y función de transportadores NSTs en nuestro laboratorio, dada la baja concentración obtenida en otros sistemas de expresión como Sacaromices cervisae, y, el alto consumo de tiempo que implica el análisis de SDS-PAGE, western blot, y los ensayos de actividad biológica. Nosotros describimos un método de screening rápido en células enteras; para esto fusionamos el transportador implicado en desordenes de la glicosilación como la malformación vertebral compleja (CMV), SLC35A3 a la GFP y 8 histidinas en la región C terminal mediante PCR; el producto lo digerimos y linealizamos con pmeI en un vector pPICZb que puede insertar múltiples copias de la construcción SLC35A3.GFP.His8 en el genoma de Pichia pastoris, dicho vector contiene un gen de resistencia a la zeocina que permite seleccionar las colonias transformantes. Los transformantes fueron obtenidos por transformación química en células competentes. La construcción pPICZB.SLC35A3.GFP.HIS8 fue introducida en el genoma de Pichia pastoris por recombinación homóloga bajo el promotor AOX1 altamente regulado e inducible con metanol. En este trabajo utilizamos la luminiscencia de GFP para monitorear la expresión del transportador SLC35A3 en células enteras transformadas. Posteriormente se realizó el screening de 96 transformantes de 122 obtenidos. Se seleccionaron los mejores transformantes y se sembraron cultivos de 1ml para optimizar variables de cultivo como la densidad óptica (UOD/ml) óptima para iniciar el cultivo, pH, temperatura, concentración del inductor metanol y concentración de glicerol y mezclas de glicerol/metanol. Se tomaron muestras para medir densidad óptica (UOD/ml) y Fluorescencia (Ua/ml). Finalmente se seleccionaron las mejores condiciones de cultivo para probar la cantidad y calidad de proteína producida en 25ml de cultivo y 1 litro comparando la mejor condición de cultivo encontrada con la recomendada por el fabricante del kit EasySelect (Invitrogen). Los resultados muestran que colonias con altos niveles de fluorescencia de GFP pueden ser utilizados para identificar células enteras que expresan altos niveles del transportador SLC35A3 en estadio temprano de crecimiento exponencial no superior a 48 horas post inducción. La correlación entre la fluorescencia de GFP y la expresión del transportador A3 se utilizó para monitorear las condiciones de cultivo óptimas para la expresión produciendo más de 22mg/L y disminuyendo el tiempo empleado en el laboratorio para poner a punto un sistema de expresión del transportador A3 integro para iniciar estudios de estructura y función.