Multiplicación clonal de gametas, aplicada a la generación de embriones bovinos

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2020-05-05

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

CLONACION - ANDROGENESIS - PARTENOGENESIS - HEMICLONES - CLONING - ANDROGENETIC - PARTHENOGENETIC - HEMICLONES

Descripción:

La producción de embriones androgénicos haploides (EAh) y embriones partenogénicos haploides (EPh) presenta un gran potencial en el ámbito de la producción animal y la medicina. Dado que las blastómeras de un EPh o EAh contienen copias exactas del ADN de la gameta que lo originó, representan clones del genoma de ese oocito o espermatozoide. Esto permite, por un lado, multiplicar el rendimiento reproductivo de dicha gameta (resultando en la producción de hemiclones), pero también realizar análisis genéticos pre-cigóticos (antes de generar el cigoto). Sin embargo, la generación de embriones haploides aún presenta algunas dificultades, especialmente en animales de producción. En el caso de los EAh, los protocolos descriptos son técnicamente complejos. Por otro lado, la activación haploide, necesaria para obtener EPh y durante la producción de embriones heteroparentales, es ineficiente en el bovino. Por lo tanto, en esta tesis se trabajó en primer lugar sobre diferentes estrategias para la producción de EAh mediada por FIV. Los resultados obtenidos siguieren que al realizar FIV de oocitos enucleados, el porcentaje de polispermia intrínseco de la técnica y la variabilidad característica de cada toro generaría una incertidumbre respecto al porcentaje real de embriones haploides que se obtendrían. Por el contrario, al realizar la enucleación posterior a un protocolo de FIV corta (4 horas) se observó que es posible identificar a cada genoma durante la micromanipulación, resolviendo de esta manera el obstáculo que representa en bovinos poder diferenciar el origen parental de los pronúcleos (PN). Por otro lado, se evaluó la producción de EAh mediante micromanipulación sin zona pelúcida (ZP), que resultó en un procedimiento más simple, tasas de desarrollo a blastocisto similares a la micromanipulación tradicional con ZP, pero mejores tasas de clivaje. El análisis cromosómico de los EAh de día 2 junto con el análisis genético de marcadores moleculares de los blastocistos sugiere que los estadíos tempranos representan una mejor fuente de blastómeras para producir hemiclones, ya que una mayor proporción de ellas aún mantiene el complemento haploide. A continuación, se evaluaron diferentes protocolos de activación haploide que potencialmente reemplacen a Io-3h-DMAP para ser aplicados en: a) la producción de EPh, y b) durante la producción de hemiclones. Para ello, se comparó la eficiencia de activación partenogénica haploide de los agentes activadores etanol (Et), roscovitina (Rosc), cicloheximida (CHX), dehidroleucodina (DhL) y PD0325901 (PD), luego de un tratamiento con Ionomicina (Io). A continuación, estos agentes fueron combinados en tratamientos novedosos. Los resultados mostraron que Rosc y CHX son similares respecto a la formación de PN, extrusión del segundo corpúsculo polar (2CP) y clivaje. Sin embargo, teniendo presente el objetivo de reemplazar el uso de drogas de amplio espectro por otras con blancos más específicos, Rosc se presenta como una mejor alternativa. Por otro lado, a pesar de que los tratamientos combinados incrementaron la formación de PN, el tratamiento simple con Rosc presentó una tendencia a inducir las mayores tasas de embriones haploides según el recuento cromosómico realizado a día 2 del desarrollo. Por lo tanto, se sugiere utilizar el protocolo Io-Rosc para la producción de EPh. A su vez, se decidió utilizar este tratamiento para activar a los hemiclones. Finalmente, se trabajó sobre la producción de embriones heteroparentales a partir de la fusión de un oocito con una blastómera androgénica haploide ya que, según reportes previos, se caracterizan por un desarrollo menor respecto a los controles. Por lo tanto, en primer lugar confirmó que la activación con Io-Rosc resultara en tasas de desarrollo similares a las descriptas anteriormente en bovinos. Luego, se trabajó sobre la sincronización entre la célula donante y el citoplasto receptor. Se comparó el efecto sobre el desarrollo embrionario de la fusión de la blastómera con un oocito pre-activado (grupo AFA) respecto al protocolo de activación posterior a la fusión (grupo FA). El grupo AFA resultó en menores tasas de desarrollo embrionario respecto al grupo FA, aunque la diferencia no resultó significativa. Sin embargo, su potencial estaría comprometido desde etapas más tempranas. Ambos grupos resultaron en un desarrollo menor que el control por lo que, mediante el análisis de marcadores moleculares, se descartó que se debiera una falla en la incorporación del ADN de la blastómera androgénica. Se realizaron ensayos preliminares de sincronización de células en metafase, que sugieren que el tratamiento de las blastómeras haploides con nocodazol seguido por MG132 podría resultar en mayores tasas de desarrollo de embriones heteroparentales. Finalmente, se analizó la abundancia relativa de ARNm de genes de interés en embriones tempranos y blastocistos. Los hemiclones en estadío temprano presentaron un patrón de expresión alterado, que sería consecuencia de la activación artificial y no de características intrínsecas del embrión. En contraste, la expresión de los blastocistos FA fue comparable a los controles FIV. En conclusión, aún no resulta claro el motivo del menor potencial de desarrollo de los hemiclones, aunque resulta evidente que es un fenómeno biológico presente en todas las especies estudiadas hasta el momento. Sin embargo, las modificaciones en los protocolos desarrolladas en esta tesis simplifican notablemente la técnica, lo que vuelve al bovino una especie modelo para estudio de EAh, EPh y hemiclones, y abre nuevas puertas en esta rama de la biotecnología.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7170_Suva