Efecto de los aminoácidos sobre la longevidad celular en Saccharomyces cerevisiae : estudio de las rutas de señalización involucradas

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2022-09-12

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Descripción:

El envejecimiento se caracteriza por una pérdida progresiva de la integridad fisiológica que impide la función y aumenta la vulnerabilidad a la muerte. Este deterioro es el factor de riesgo primario en diversas patologías humanas como cáncer, diabetes, desórdenes cardiovasculares y enfermedades neurodegenerativas. La investigación acerca del envejecimiento ha logrado avances sin precedentes en los últimos años, fundamentalmente por el descubrimiento de que la velocidad de envejecimiento es controlada, al menos en parte, por caminos genéticos y procesos bioquímicos conservados a lo largo de la evolución. Diferentes aspectos característicos del envejecimiento son objeto de estudio en distintos organismos modelo: inestabilidad genómica, acortamiento de telómeros, alteraciones epigenéticas, agotamiento de células madre, disfunción mitocondrial, senescencia celular, comunicación intercelular y sensado desregulado de nutrientes. La levadura Saccharomyces cerevisiae es ampliamente utilizada como modelo para estudiar los mecanismos genéticos y moleculares de la longevidad. En este organismo se definen dos tipos de envejecimiento: replicativo y cronológico. El envejecimiento replicativo (en inglés, Replicative Life Span: RLS) se define como el número máximo de células hijas que una célula madre puede producir, mientras que el envejecimiento cronológico (en inglés, Chronological Life Span: CLS) se define como el periodo de tiempo en que una célula que no se está dividiendo permanece viable. Estos dos tipos de envejecimiento en levaduras tienen sus contrapartes en células de mamiferos: RLS se puede comparar con el envejecimiento de células mitóticamente activas y CLS se puede comparar con el envejecimiento de células en estado post-mitótico tales como neuronas o células de músculo. La restricción dietaria, que equivale a un ayuno de nutrientes sin llegar a producir malnutrición, es la única intervención conocida que enlentece el envejecimiento y extiende la vida y se la ha asociado a la regulación negativa de los sistemas conservados de señalización dependientes de nutrientes TORC1 y Ras-PKA. Si bien se han propuesto distintas hipótesis acerca de cómo la restricción dietaria modula el envejecimiento, el mecanismo aún no se ha establecido. El propósito de este proyecto fue estudiar los mecanismos moleculares involucrados en el proceso del envejecimiento de células de S. cerevisiae. Se analizó el efecto de los aminoácidos sobre la longevidad cronológica (CLS) en levaduras prototróficas y se determinaron qué vías de transducción de señales se encuentran involucradas en ese proceso. En particular, nos enfocamos en las vías TORC1, SPS (Ssy1-Ptr3-Ssy5) (sistema de sensado de aminoácidos) y la de control general de aminoácidos GAAC. Las vías GAAC y TORC1 coordinan la disponibilidad de nutrientes con la síntesis de proteínas, mientras que la vía SPS coordina la disponibilidad de aminoácidos a través de su incorporación al interior celular. Entre los procesos asociados al metabolismo de aminoácidos y a la longevidad analizamos el camino de respuesta a proteínas mal plegadas UPR (del inglés, Unfolded Protein Response), la tolerancia a un estrés por altas temperaturas y la activación de la autofagia. A través del conteo de unidades formadoras de colonias (UFC) a lo largo del tiempo, determinamos que el suplemento de aminoácidos tiene un efecto negativo sobre la longevidad en células wild type. Con la misma metodología, obtuvimos resultados donde determinamos que en ausencia de aminoácidos las proteínas Tor1 y Gln3 de la vía TORC1 tienen un efecto negativo sobre la longevidad, mientras que los factores de transcripción pertenecientes a la vía GAAC, Gcn4 y Leu3, son necesarios para el mantenimiento de la sobrevida en estas condiciones. En cambio, en presencia de aminoácidos, observamos que las mutantes de la vía SPS, que participan en la captación de aminoácidos extracelulares, logran aumentar su sobrevida con respecto a las células wild type. La presencia de aminoácidos también afecta la respuesta a distintos tipos de estrés. Observamos que la actividad UPR aumenta en presencia de aminoácidos. Determinamos que la misma se encuentra regulada tanto por la vía TORC1 como por la vía GAAC. Además, observamos que en presencia de aminoácidos la actividad UPR es menor en mutantes de la vía SPS que en células wild type. También encontramos que los aminoácidos producen un aumento en la tolerancia al estrés térmico y que la misma depende en parte de la vía TORC1 como también de la presencia del sensor Ssy1. Por otro lado, la presencia de aminoácidos solo interfiere con la activación de la autofagia luego de un ayuno de la fuente de nitrógeno. Además, la autofagia se encuentra regulada tanto por la vía TORC1 como la vía GAAC. Los altos niveles de autofagia observados durante la fase estacionaria en cepas deficientes en Tor1 y Gln3, podrían explicar en parte el fenotipo longevo de las mutantes. Mediante un análisis global del proteoma de células deficientes en el factor de transcripción Gcn4, efector principal de la vía GAAC, encontramos grupos de proteínas de expresión diferencial que participan tanto en el metabolismo celular como en la respuesta a varios tipos de estrés. Encontramos distintas enzimas sub-representadas involucradas en vías de biosíntesis para aminoácidos. Por otro lado, encontramos sobre-representadas varias proteínas relacionadas con el metabolismo del carbono, como la degradación del glucógeno y enzimas que participan en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Además analizamos el contenido relativo de aminoácidos entre células gcn4Δ y wild type mediante espectroscopía RMN y detectamos que varios aminoácidos se encuentran en menor contenido relativo en las células mutantes. También determinamos la cantidad de glucógeno y trehalosa en células crecidas hasta fase estacionaria. El conjunto de los resultados indica que la ausencia de Gcn4 produce una pérdida de la homeostasis que influye sobre el flujo de carbono dentro de la célula, produciendo una disminución en el almacenamiento de carbohidratos de reserva y un aumento en la actividad mitocondrial, lo que en última instancia impactará sobre la longevidad. En conjunto nuestros resultados indican que el metabolismo de los aminoácidos tiene un impacto directo sobre la longevidad cronológica la cual se encuentra regulada por las vías de señalización estudiadas. Además estas vías de señalización participan en la respuesta a distintos tipos de estrés lo que probablemente también impacte en el proceso de envejecimiento.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7153_Gulias