Caracterización de dos isoformas de CDPKs de Solanum tuberosum (papa) : análisis de sus expresiones en respuesta a estrés hídrico

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2020-07-01

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

QUINASAS DE PROTEINAS DEPENDIENTES DE CALCIO (CDPKs) - FOSFORILACION DEPENDIENTE DE Ca2+ - VIAS DE SEÑALIZACION - SOLANUM TUBEROSUM - CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASES - CALCIUM-DEPENDENT PHOSPHOTYLATION - SIGNALING PATHWAYS - SOLANUM TUBEROSUM

Descripción:

El calcio es un segundo mensajero ubicuo en plantas que participa en la señalización de estímulos bióticos y abióticos. Las oscilaciones del catión son decodificadas por distintos sensores, entre ellos se destacan las quinasas de proteínas dependientes de calcio (CDPKs). Estas enzimas presentan un dominio catalítico de quinasa de serina/treonina (KD) fusionado a través de un dominio autoinhibitorio (AD) a un dominio regulador similar a calmodulina (CLD) con cuatro sitios EF-hands de unión al calcio. La familia CDPK en papa (Solanum tuberosum) está compuesta por 26 miembros divididos en cuatro grupos; cinco CDPKS pertenecen al grupo III y tres de ellas, StCDPK22/23/24, presentan sólo tres sitios EF-hands en su dominio regulatorio faltando el sitio más cercano al AD (Fantino et al. 2017). Una nueva búsqueda permitió encontrar un nuevo miembro de este grupo, StCDPK27, que también presenta tres sitios EF-hand, pero en este caso carece del segundo sitio. El análisis filogenético de los miembros del grupo III reveló que las isoformas que carecen del primer sitio EF-hand forman un clado aparte. Se ha reportado que CDPKs con sólo 3 sitios presentan menor sensibilidad por el calcio (Boudsocq et al. 2012). Con el fin de analizar su dependencia por el catión, se amplificaron las secuencias codificantes de StCDPK22 y StCDPK24, y se generaron y purificaron las proteínas recombinantes, StCDPK22:6xHis y StCDPK24:6xHis (524 y 532 aa respectivamente). Ambas isoformas comparten 78% de identidad nucleotídica y 80% a nivel aminoacídico. A pesar de la gran identidad de secuencia de su KD presentan diferencias en su actividad quinasa y en la preferencia por el complejo ATP-Me2+. Se observa que StCDPK24 presenta mucha mayor actividad en todas las condiciones ensayadas y tiene una clara preferencia por el complejo ATP-Mg2+, presenta una dependencia parcial por Ca2+ y antagonistas de calmodulina disminuyen su actividad. Se determinó que Syntide-2 fue el mejor sustrato aceptor y con éste se determinaron los parámetros cinéticos (Vmáx y KM). Por su parte, StCDPK22 tiene muy baja actividad (casi nula), no se observa una clara dependencia por calcio y su actividad mejora cuando se utiliza ATP-Mn2+ como sustrato dador. Ambas isoformas presentan un patrón similar de autofosforilación en ausencia de calcio (Y39 o S33 del NTV, S321 o S323 y T325 o T327 del AD y S521 o S523 del CTV para StCDPK22 o StCDPK24 respectivamente). Además, StCDPK22 se fosforiló en dos residuos del KD (S83 y S297) en ausencia de calcio; mientras que StCDPK24 se autofosforiló en dos residuos del CLD (S438 y S445) sólo en presencia de calcio sugiriendo que esta isoforma es regulada por el catión. Es interesante que AtCPK8 de Arabidopsis también se autofosforila en los mismos residuos del AD y CTV sugiriendo que puede ser una forma de regulación de las CDPKS del clado. Se realizó un modelado in silico de la estructura secundaria y terciaria de ambas enzimas. Los datos de RT-qPCR indican que StCDPK22 presenta una expresión más restringida a flor y estadios tempranos de tuberización mientras que la expresión de StCDPK24 es ubicua, aunque fue mayor en brotes jóvenes, tallo, flor, hoja y estadios de tuberización. El análisis in silico de sus promotores permitió identificar varios motivos de respuesta a ABA y a estrés abiótico, por lo que su expresión se analizó en respuesta a la salinidad utilizando plantas in vitro y de invernadero. StCDPK24 se induce tempranamente (6 h) en respuesta a la sal en plantas in vitro para luego decaer. Lo mismo ocurrió en tallo de plantas de invernadero tratadas con sal (8 h). Nuestros resultados indican que ambas CDPKs difieren tanto en su actividad como en sus perfiles de expresión y la expresión espacio-temporal de StCDPK24 en respuesta al estrés salino sugiere que podría participar en esta cascada de señalización [fórmula aproximada, revisar la misma en el original].

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7098_Sciorra