Enzimas microbianas activas sobre polisacáridos estructurales de pared celular vegetal : producción recombinante y caracterización bioquímica y funcional

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2022-04-26

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

ENZIMAS RECOMBINANTES - CELULOSA - HEMICELULOSA - MICROORGANISMOS - CAZIMAS - BIOMASA LIGNOCELULOSICA - RECOMBINANT ENZYMES - CELLULOSE - HEMICELLULOSE - MICROORGANISMS - CAZYMES - LIGNOCELLULOSIC BIOMASS

Descripción:

La biomasa lignocelulósica consiste principalmente en polisacáridos estructurales y es considerada una materia prima con gran potencial para la producción sustentable de biocombustibles y bioproductos. Sin embargo, la viabilidad económica de estos procesos depende de la conversión eficiente de los polisacáridos estructurales, celulosa y hemicelulosa, en oligosacáridos cortos y azúcares monoméricos fermentables (glucosa y xilosa). Para lograrlo es necesario desarrollar cócteles enzimáticos compuestos por múltiples enzimas activas sobre carbohidratos, o CAZimas, con actividades complementarias y que pueden provenir de distintos organismos lignocelulolíticos. Estas incluyen glicosil hidrolasas (GHs) y enzimas auxiliares con actividad oxidativa (Aas) que son clasificadas en familias según su secuencia de aminoácidos y estructura tridimensional. La hipótesis de esta Tesis es que las enzimas secretadas por hongos y bacterias celulolíticas aeróbicas tienen actividades complementarias que pueden resultar en sinergismo para la degradación de biomasa lignocelulósica residual. Su caracterización y producción en sistemas recombinantes permite su aplicación en procesos de bioconversión específica de polisacáridos estructurales a monómeros fermentables. El objetivo principal del presente trabajo es el clonado, expresión recombinante y caracterización bioquímica y funcional de CAZimas fúngicas y bacterianas para ser aplicadas en procesos de deconstrucción de biomasa lignocelulósica residual. Se seleccionaron enzimas de dos organismos altamente eficientes en la degradación de lignocelulosa: el hongo Pycnoporus sanguineus y la bacteria Cellulomonas sp. B6. Los hongos del género Pycnoporus son productores de extractos enzimáticos extracelulares con actividad ligno-celulolítica y se destacan por su eficiencia para la degradación de la pared celular vegetal, en especial de celulosa y lignina. Por otro lado, las bacterias del género Cellulomonas codifican para numerosas CAZimas extracelulares. En particular, el aislamiento Cellulomonas sp. B6 se caracteriza por su alta actividad xilanolítica extracelular. Por ello, este trabajo se enfoca en la caracterización de enzimas activas sobre celulosa de P. sanguineus y de xilano de Cellulomonas sp. B6. Entre las enzimas fúngicas se clonaron dos exoglucanasas o celobiohidrolasas I (CBH I) (EC 3.2.1.176), de la familia GH7 (PsCel7A y PsCel7B) y tres monooxigenasas líticas de polisacáridos (LPMO) (EC 1.14.99.54) de la familia AA9 (PsAA9A, PsAA9B y PsAA9C). Las celobiohidrolasas I son exoglucanasas que actúan procesivamente desde el extremo reductor de la celulosa cristalina liberando celobiosa y en los hongos se encuentran clasificadas como GH7. Son secretadas en gran abundancia por hongos celulolíticos y cumplen un rol fundamental en la deconstrucción de la biomasa, siendo componentes mayoritarios de los cócteles enzimáticos comerciales. Para la expresión de PsCel7A y PsCel7B se utilizó una plataforma de expresión semi-industrial basada en una cepa mutante ΔcbhI del hongo filamentoso Trichoderma reseei. Las enzimas se purificaron del sobrenadante de cultivo y se caracterizaron bioquímicamente. La actividad de ambas enzimas recombinantes purificadas sobre biomasa lignocelulósica (rastrojo de maíz), en combinación con endoglucanasas y β-glucosidasas comerciales, generó una conversión de glucanos a glucosa de aproximadamente 40%, lo cual es aproximadamente el 67% relativo a la actividad de la enzima de referencia comercial Cel7A de T. reesei. Esto indica un potencial para su uso ya que se utilizaron las condiciones de reacción óptimas de TrCel7A. Restan realizarse futuras optimizaciones de las condiciones de reacción para evaluar la eficiencia de PsCel7A y PsCel7B en bioprocesos. A su vez, para la deconstrucción de la fracción cristalina de la celulosa son necesarias enzimas auxiliares capaces de generar cortes en los enlaces glucosídicos de la celulosa cristalina, con un mecanismo oxidativo y en presencia de un dador de electrones, llamadas LPMOs y clasificadas en la familia AA9. La acción de estas enzimas facilitaría el acceso de las GHs a estas regiones altamente recalcitrantes de la celulosa, mejorando la eficiencia en la conversión de la biomasa. De las 16 AA9 codificadas en el genoma de P. sanguineus, se seleccionaron tres en base a estudios previos. Las enzimas recombinantes PsAA9A, PsAA9B y PsAA9C se expresaron utilizando la plataforma fúngica de la levadura Pichia pastoris. PsAA9A y PsAA9B se purificaron exitosamente desde el sobrenadante de cultivo mientras que PsAA9C se detectó en la fracción intracelular. La actividad de ambas enzimas se ensayó sobre sustratos celulósicos, aunque solo se detectó actividad para PsAA9A, por lo que se realizó su caracterización exhaustiva. PsAA9A, en presencia de un dador de electrones, genera cortes por oxidación en sustratos celulósicos, produciendo celo-oligosacáridos solubles, nativos y oxidados, de grado de polimerización entre 2 y 6. En ensayos de complementariedad con celulasas individuales se demostró el sinergismo para la degradación de celulosa con endoglucanasas (GH5), celobiohidrolasas II (extremos no reductores) (GH6) y β-glucosidasa (GH1), aunque no con celobiohidrolasas I (extremo reductor) (GH7). Esta falta de sinergismo podría deberse a un efecto inhibitorio generado por el ácido gálico, compuesto utilizado como dador de electrones en la reacción. Por ello, en el diseño de un cóctel enzimático que incluya LPMOs se deberán optimizar las proporciones para evitar la inhibición de las GH7. A su vez, Cellulomonas sp B6 secreta un amplio repertorio de enzimas activas sobre xilanos, en presencia de biomasa. Por ello, se estudiaron en esta Tesis dos enzimas desramificantes del xilano y su sinergismo con xilanasas, paso crítico para su aprovechamiento. La degradación eficiente de arabinoxilanos (AXs) y glucuronoxilanos (GXs) es de gran interés debido a que son los tipos predominantes de hemicelulosa en cereales y pasturas (AXs) y en maderas duras (GXs). Para ello, resulta clave la utilización de enzimas con actividad α–L-arabinofuranosidasa y α-glucuronidasa debido a que son capaces de hidrolizar sustituciones de arabinosa y ácido 4-O-metil D-glucurónico, respectivamente, y permiten un mejor acceso para otras enzimas con actividad sobre la cadena principal, como las β-1,4-endoxilanasas. Se estudiaron entonces una α–L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) de la familia GH62 (CsAbf62A) y una α–glucuronidasa (EC 3.2.1.139) de la familia GH67 (CsAgu67A) para clonar y expresar de manera recombinante en una plataforma bacteriana de Escherichia coli. Ambas enzimas se purificaron del citoplasma de células de E. coli recombinantes y se caracterizaron bioquímica y funcionalmente. Las familias GH62 y GH67 tienen hasta el momento 24 y 25 enzimas caracterizadas, respectivamente. CsAbf62A presentó actividad α–L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) sobre arabinoxilanos y arabino-xilo-oligosacáridos, hidrolizando específicamente las sustituciones simples de arabinosa unidas con enlaces α-1,2 o α-1,3 a los residuos de xilosa que forman el esqueleto del polisacárido, aunque no las sustituciones dobles. También se detectó la liberación de arabinosa a partir de las sustituciones del arabinano, otro polisacárido de la pared celular vegetal. CsAgu67A presentó actividad α-glucuronidasa (EC 3.2.1.139), removiendo sustituciones de ácido 4-O-metil D-glucurónico desde el extremo reductor de glucurono-xilo-oligosacáridos, pero no de sustituciones internas ni del polisacárido. Ambas enzimas se evaluaron en combinación con tres β-1,4-endoxilanasas (EC 3.2.1.8) de las familias GH10 (CsXyn10A y CsXyn10B) y GH11 (CsXyn11A), previamente expresadas en el laboratorio. En ensayos de degradación de biomasa residual, la eliminación de residuos de arabinosa por CsAbf62A mejoró la accesibilidad de la xilanasa CsXyn10A al AX de trigo, aumentando la concentración de xilobiosa liberada, en comparación a la actividad de CsXyn10A sola. Por otro lado, la liberación de xilosa a partir de GX de madera de haya por CsXyn10A y CsXyn10B aumentó significativamente en presencia de CsAgu67A y una β-1,4-xilosidasa comercial GH43. Los resultados obtenidos en esta Tesis permitieron tener un repertorio de actividades enzimáticas complementarias, necesarias para mejorar la eficiencia de degradación de los polisacáridos presentes en la biomasa lignocelulósica. La disponibilidad de estas enzimas permitirá el desarrollo de formulaciones óptimas de complejos enzimáticos, específicas para cada tipo de biomasa y proceso de aplicación. Así se sientan las bases para el diseño de cnsorcios enzimáticos “a medida”, para su aplicación en la producción de hexosas y pentosas y/o en la funcionalización de polisacáridos.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7084_Garrido