Diagnóstico molecular de la enfermedad fúngica invasora causada por hongos oportunistas.

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2021-04-12

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

ASPERGILOSIS INVASORA - ENFERMEDAD FUNGICA INVASORA - MODELO MURINO DE INFECCION FUNGICA INVASORA - PCR PANFUNGICA - qPCR - INVASIVE ASPERGILLOSIS - INVASIVE FUNGAL DISEASE - MURINE MODEL OF INVASIVE FUNGAL INFECTION - PANFUNGAL PCR - qPCR

Descripción:

La enfermedad fúngica invasora (EFI) es producida por varias especies de hongos oportunistas; una de las más frecuentes es la aspergilosis invasora (AI) producida por Aspergillus spp. De acuerdo a criterios del EORT/MSG las EFI se clasifican en probada cuando el hongo es observado invadiendo tejido, o aislado de biopsias por punción en el paciente; probable cuando el hongo es observado y/o aislado de materiales respiratorios o aspirado de senos paranasales o se detectan galactomananos en el paciente; y posible cuando el paciente solo muestra parámetros clínicos compatibles sin hallazgo micológico. Las EFI poseen alta morbi-mortalidad en pacientes neutropénicos y un diagnóstico rápido y certero aumenta la sobrevida del paciente. El objetivo fue desarrollar y evaluar métodos de detección de ADN fúngico para diagnosticar EFI a partir de diferentes tipos de materiales clínicos. Se estandarizaron dos métodos panfúngicos, basados en la secuenciación del ITS2 (PanPCR) y de una región extendida del 28S del ADNr (Ext28s); y tres métodos rápidos (qPCR) con capacidad de detectar específicamente ADN de Aspergillus spp.: ASP28Po, ASP28Pn y qPCR-AI; las dos primeras diseñadas sobre el 28S del ADNr y la última sobre el ITS2. Se determinó el límite de detección (LOD), especificidad analítica (EA) y su rango dinámico (RD) de cada método. Los mejores rendimientos lo tuvieron la PanPCR (LOD: 10 conidios/mg; EA: 100 % y RD: 10-0.01 ƞg) y la qPCR-AI (LOD: 1 conidios/mg; EA: 88,9% y RD: 10ng-1 fg). La eficacia de detección fúngica de la PanPCR y de la qPCR-AI en comparación con el gold standard (ED/cultivo) fue evaluada en tejidos de ratones inoculados con 5 especies fúngicas causantes de EFI: Asperillus fumigatus, Aspergillus flavus, Fusarium solani species complex, Rhizopus arrhizus y Canddia albicans, mostrando una muy buena concordancia (índice Kappa de 0,83 (IC95% 0,76-0,90) para PanPCR y 0,94 (IC95%: 0,84-1) para qPCR-AI). También se evaluó la eficacia de las combinaciones entre PanPCR, qPCR-AI y con ED/cultivo. Todas las combinaciones mejoraron en algún grado capacidad de detección del ED/cultivo, pero sólo se observó un aumento significativo del 10% (P<0,05) cuando se combinaron los tres métodos (convencional y moleculares), respecto al ED/cultivo. Para determinar los parámetros diagnóstico de la PanPCR y la qPCR-AI se analizaron muestras frescas (respiratorias, sangre, LCR y biopsias) de 166 pacientes y tejidos fijados y parafinados (FFPE) de 47. Según los criterios del EORT/MSG, 69/166 y 47/47 pacientes tenían una EFI probada/probable, respectivamente. Los restantes pacientes tenían una EFI posible o un cuadro clínico que requería un diagnóstico diferencial de EFI. La sensibilidad (S), especificidad (E) y valores predictivos positivo (VPP) y negativo (VPN) de la PanPCR y la qPCR-AI considerando materiales frescos fueron del 71,0%, 91,3%, 86,0% y 80,8%, y del 100,0%, 95,5%, 76,9% y 100,0%, respectivamente. El porcentaje de identificación de agentes fue del 71,0% para el ED/cultivo, y aumentó a un 89,9% combinando el ED/cultivo con PanPCR y qPCR-AI. En tejidos FFPE los valores se S, E, VPP y VPN fueron 100,0%, 91,7%, 88,9% y 100,0% para la qPCR-AI, similar a las de muestras frescas. La PanPCR solo pudo detectar el agente en el 51,1% de los pacientes, estuvo inhibida en 19% y fue negativa en las restantes. El uso combinado de ambos métodos moleculares junto con el ED/cultivo permitió un mejor diagnóstico de las EFIs a partir de muestras frescas. La PanPCR identifica con precisión las diferentes especies de hongos causantes de EFIs, mientras que la qPCR-AI, 100 % sensible y 95 % especifica, permitiría descartar una AI cuando su resultado es negativo (VPN 100%). Si bien la PanPCR fue menos sensible cuando se analizaron tejidos FFPE, sigue siendo un material valioso considerando que a veces es la única posibilidad para arribar a un diagnóstico.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6833_Refojo